中药化学-第八单元--结晶课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第九单元 结晶,结晶法,鉴定中药化学成分，研究其化学结构，必须首先将中药成分制备成单体纯品。,在常温下，物质本身性质是液体的化合物，可分别用分馏法或层析法进行分离精制。,通常情况下大多数天然药物化学成分在常温下是固体物质，具有结晶的通性。若物质能够形成结晶，则代表其纯度达到了相当程度。研究中药化学成分时，一旦获得结晶，就能有效地进一步精制成为单体纯品。,纯化合物的结晶有一定的熔点和结晶学的特征，有利于鉴定。如果鉴定的物质不是单体纯品，不但不能得出正确的结论，还会造成工作上的浪费。获得结晶并制备成单体纯品，是鉴定天然产物成分、研究其分子结构的重要一步。结晶法是分离纯化固体成分的重要方法之一。,晶体的特性,:,（,1,）,晶体的自范性,。,（,2,）,晶体的均匀性,（,3,）,晶体的各向异性,（,1,）,晶体的自范性,。,晶体具有自发地生长成为结晶多面体的可能性，即晶体常以平面作为与周围的分界面，这种性质称为晶体的自范性。,晶体为化学性质均一的固体，且具有规则的晶型。晶体在形成过程中，其分子、原子或离子按一定方式排列，形成有规则的多面体外形，称为,结晶多面体,。,（,2,）,晶体的均匀性,晶体中每一宏观质点的物理性质和化学组成以及每一宏观质点的内部晶格都相同，这种特性称为晶体的均匀性。,（,3,）,晶体的各向异性,晶体的几何特性及物理效应一般说来常随方向的不同而表现出差异，这种性质称为各向异性。,不同物质具有不同的晶型。,同一物质由于结晶条件不同，所形成晶体的形状、大小、颜色等也可能不同，其溶解度也不同。,在结晶过程中，根据物质的不同溶解度与不同的晶型，创造相应的结晶条件，可使物质从溶液中以纯净结晶析出。,注：,而有些物质从水溶液中析出结晶时，以具有一定晶型的晶体水合物析出。,如葡萄糖含有一分子结晶水,(C,6,H,12,O,6,H,2,O),、氨茶碱含有两分子结晶水,(C,16,H,24,O,4,N,10,2H,2,O),、硫酸镁含有七分子结晶水,(MgSO,4,7H,2,O),。,结晶基本原理,利用不同温度可引起物质溶解度改变的性质来分离混合物中的不同成分。,结晶：,不是结晶状态的固体物质处理成结晶状态的操作称为,结晶,。此时，形成的晶体一般还含有较多的杂质。,重结晶：,不纯的结晶进一步精制成较纯的结晶的过程称为,重结晶,。,结晶过程的相平衡,主要是指溶液中固相与液相浓度之间的关系，该平衡关系可用固体在溶液中的,溶解度,来表示。,溶解度,饱和溶液,不饱和溶液,过饱和溶液,溶解度：,在一定温度下，任何一种物质溶解在某一定量的溶剂中，都有一个最大限度，即只能达到一个最大浓度。,通常规定在一定温度下，某物质在,100g,溶剂中所能溶解的最大克数，为该物质在此温度下的溶解度。,也称为饱和浓度。,该状态的溶液称为饱和溶液。,影响物质的溶解度的因素：,物质的化学性质,pH,值,温度,溶剂的种类,溶剂的组成,离子强度,当某一物质在特定的溶剂中溶解时，其溶解度主要随,pH,值、温度而变化。,大多数物质的溶解度随温度的升高而增大。,也有一些物质对温度不敏感。,注,:,还有少数物质,(,如螺旋霉素的溶解度随温度升高而下降。,饱和溶液：,如果溶液中溶质的含量等于溶解度，则此溶液称为饱和溶液,，,此时溶液处于饱和状态，既没有固体溶解，也没有溶质从液相析出，溶液仍呈单一液相。,不饱和溶液：,在一定温度下，如果溶液中溶质的含量小于溶解度，该溶液称为不饱和溶液,。,此种情况下溶质完全溶解在溶剂中，溶液呈单一液相状态。,过饱和溶液：,如果溶质含量超过溶解度，则此溶液称为过饱和溶液,，,此时溶液处于过饱和状态。过饱和状态下的溶液是不稳定的，也可称为“介稳状态。,一旦遇到振动、搅拌、摩擦、加晶种甚至落人尘埃，都可能使过饱和状态破坏而立即析出结晶，直到溶液达到饱和状态后，结晶过程才停止。,溶液的过饱和状态是物质从溶液中析出结晶的必要条件。,溶液的过饱和程度,(,即过饱和溶液浓度与溶解度之差,),是结晶过程的推动力。,而结晶收率则取决于溶解度的大小，溶解度越小，结晶收率越高。,当分散在溶剂中的溶质粒子小到微米级时，其溶解度不仅是温度的函数，也是粒度的函数。,用热力学方法，可推导出它们之间的定量关系，即,Kelvin,公式：,ln,C1 / C2 =2,M,/,RT,（,1/r1 1/ r2,）,式中：,C1,，,C2,分别表示溶质半径为,/r1,和,/r2,的溶解度；,R,气体常数；,T,热力学温度；,M,溶质的分子量；,固体颗粒与溶液间的界面张力。,由上式可知，因,2,M,/,RT,o,，若,r2 r1,，则,1n C1 / C2 o,，,C1 / C2,eE,1,，所以,C1 C2,。,即半径,(r1),较小的晶体，其溶解度,(C1),较大；或者说微小颗粒的溶解度比正常粒度的溶解度要,大。如果,r2,，可认为,r2,相当于正常颗粒，若它的溶解度,C2,定义为,C* (,溶质的正常溶解度,),，于是半径为,r,的粒子的溶解度,C,可表示为：,ln,C / C* =2,M,/,RTr,=,lnS,过饱和度与颗粒大小的关系：,过饱和度越大，颗粒直径越小。,若某溶液中同时存在大小不同的诸多颗粒，则经过一段时间之后，小颗粒溶质逐渐消失，而大颗粒溶质逐渐粗大整齐，这就是结晶操作中的养晶过程。,过饱和溶液的形成,结晶的首要条件是溶液处于过饱和状态，其过饱和度可直接影响结晶速率和晶体质量。,要想获得理想的晶体，必须掌握过饱和溶液的形成方法。,常用方法：,蒸发法,冷却法,真空蒸发冷却法,盐析法,反应法,重结晶,是将晶体用适合的溶剂溶解后再次结晶的过程，它可提高产品纯度。,重结晶是利用杂质与结晶物质在不同溶剂和不同温度下的溶解度不同，来达到物质的分离与纯化。,重结晶的关键是选择适合的溶剂。,杂质产生的原因主要包括：,某些杂质与产物的溶解度相近，产生共结晶现象；,有些杂质会被结合到产品的晶格中；,因洗涤不完全，而使晶体上带有母液和杂质。,结晶操作：,溶剂的选择,操作过程,结晶条件的控制,理想的溶剂必须具备的条件：,不与被提纯的成分发生化学反应；,对被提纯成分的溶解度随温度不同有显著差异，热时溶解度大，冷时溶解度小；,对可能存在的杂质无论冷热溶解度都很大或很小,(,冷热都能溶的杂质，在降温时被提纯的物质析出结晶后，仍留在母液中；冷热都不溶的杂质，可趁热过滤以除去,),；,溶剂的沸点不宜过高或过低,(,过高时，附着于晶体表面的溶剂不易除去；过低时则溶解度冷热时变化不大，不利于析晶,),；,能给出较好的结晶；,无毒或毒性小。,溶剂的选择方法：,(1),单一溶剂的选择,要找到合适的溶剂，一方面可查阅有关资料及参阅同类型化合物的结晶条件。,另一方面也可进行一些探索，参考“相似相溶”的规律加以考虑。但所选溶剂的沸点应低于化合物的熔点，以免在进行热溶解时化合物分解变质,(,若不能选择出沸点较低的溶剂，则应在比熔点低的温度下进行热溶解，以免得到混入溶剂的结晶,),。,常用的结晶溶剂：,甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯等。,摸索试验方法：,若无资料可查，且不清楚被提纯物的溶解性能，需通过小量试验来摸索。,取少量试样,(,约,0.1g),置小试管中，用滴管逐滴加入溶剂，观察试样在冷热时的溶解情况。,若试样在,lml,冷的溶剂中全部溶解或大部分溶解，则此溶剂的溶解度太大，不适宜做结晶溶剂；,若试样不溶或大部分不溶，但加热至沸腾,(,沸点低于,100,的，则应水浴加热,),时完全溶解，冷却，析出大量结晶，这种溶剂一般认为可用；,若样品不全溶于,lml,沸腾的溶剂中时，则可逐次添加溶剂，每次约加,0.5ml,，并加热至沸腾。若加入的溶剂总量达,3,4ml,时，样品在沸腾的溶剂中仍不溶解，表示这种溶剂不适用；反之，若样品能溶解在,3,4ml,沸腾的溶剂中，则将它冷却，观察有无结晶析出，还可用玻璃棒摩擦试管壁或用冰水冷却，以促使结晶析出。若仍未析出结晶，则这种溶剂也不适用；,若有结晶析出，则以结晶析出的多少来选择溶剂。按照上述方法逐一试验不同的溶剂，将试验结果加以比较，从中选择最佳的溶剂。,注,:,有些化合物在一般溶剂中不易形成结晶，而在某些溶剂中则易于形成结晶。,例如葛根素、逆没食子酸（,ellagicacid,）在冰醋酸中易形成结晶，大黄素（,emodin,）在吡啶中易于结晶，萱草毒素（,hemerocallin,）在,N,，,N,一二甲基甲酞胺（,DMF,）中易得到结晶，而穿心莲亚硫酸氢钠加成物在丙酮一水中较易得到结晶。又如蝙蝠葛碱通常为无定形粉未，但能和氯仿或乙醚形成为加成物结晶。,(2),混合溶剂的使用,当选择不到适当的单一溶剂时，可选用两种或两种以上溶剂组成的混合溶剂,.,要求,:,低沸点溶剂对被提纯物的溶解度大，高沸点溶剂对被提纯物的溶解度小，这样在放置时，沸点低的溶剂较易挥发，比例逐渐减少，易达到过饱和状态，利于结晶的形成。,选择溶剂的沸点不宜太高，要适中，可在,60,左右。沸点太低溶剂损耗大，亦难以控制；太高则不便浓缩，同时不易除去。,一般常用的混合溶剂有,:,乙醇,水,醋酸,水,丙酮,水,吡啶,水,乙醚,甲醇,乙醚,丙酮,乙醚,石油醚,苯,石油醚,操作,:,一般是先将化合物溶于易溶的溶剂中，再在室温下滴加适量的难溶的溶剂，直至溶液微呈浑浊，将此溶液微微加热，使溶液完全澄清后放置。,例如,J,一细辛醚重结晶时，可先溶于乙醇，再滴加适量水，即可析出很好的结晶。,又如自虎杖中提取水溶性的虎杖苷时，在已精制饱和的水溶液上添加一层乙醚放置，既有利于溶出其共存的脂溶性杂质，又可降低水的极性，促使虎杖俄的结晶化。,(3),重结晶选用的溶剂,可参照结晶所选用的溶剂，但若形成粗结晶后溶解度有所改变，则所选溶剂也相应有所不同。,一般操作过程,通常将需结晶物质置于锥形瓶中，加入较需要量略少的溶剂，于水浴上加热至微沸。为了避免溶剂挥发及安全操作，应在装置中接上冷凝管。若未完全溶解，可逐步添加溶剂，直至所需结晶物质刚好完全溶解,(,要注意判断是否有不溶性杂质，以免误加过多溶剂,),。趁热过滤，塞紧瓶塞，静置，冷却析晶。如果在室温中可以析出结晶，就不一定放置于冰箱中，以免伴随结晶析出更多的杂质。,然后采用减压抽滤，把结晶从母液中分离出来。晶体需用少量溶剂洗涤，以除去存在于结晶表面的母液。洗涤时，宜暂停抽气，用刮刀小心拨动，使所有晶体润湿，略静置后再行抽气。母液适当浓缩放置，又可得到一部分纯度较低的晶体。上述得到的结晶仍为粗晶，仍含有杂质，需反复进行重结晶后才可得到较纯晶体。,若所得粗结晶尚含有多种成分，可用分步结晶的方法使各成分分步析出。将粗晶用适当溶剂溶解，滤过，放置析出晶体后，立即抽滤得第一批结晶；母液浓缩放置，可得第二批结晶；抽滤后再浓缩母液,经反复处理后得数批结晶。,各部分结晶经过检查，相同物质可合并，最后再经多次重结晶以获得较纯的晶体。,结晶条件的控制,趁热过滤得到的滤液应长时间静置，逐渐冷却，避免温度骤降使析晶过快而带出杂质。一般是溶液浓度高，降温快，析出结晶的速度也快些。但是其结晶的颗粒较小，杂质也可能多些。有时自溶液中析出的速度太快，超过化合物晶核的形成分子定向排列的速度，往往只能得到无定形粉未。,有时溶液太浓，粘度大反而不易结晶化。如果溶液浓度适当，温度慢慢降低，有可能析出结晶较大而纯度较高的结晶。有的化合物其结晶的形成需要较长的时间，例如铃兰毒苷等，有时需放置数天或更长的时间。在放置过程中，最好先塞紧瓶塞，避免液面先出现结晶，而致结晶纯度较低。,若滤液久置仍无结晶析出，可采取的方法有：,加入少量晶种,(,同种分子,),，诱导晶核形成使结晶立即增长；或用玻璃棒摩擦玻璃容器内壁，产生微小颗粒代替晶核，以诱导方式形成结晶；,或用玻璃棒蘸取过饱和液，在空气中使之挥发除去部分溶剂后，再摩擦玻璃器壁；如仍无结晶析出，可打开瓶塞任溶液逐步挥散，慢慢析晶。或另选适当溶剂处理，或再精制一次，尽可能除尽杂质后进行结晶操作，或用少许干冰或置于冰箱以降低结晶温度；或加有机可溶性盐类盐析。,因杂质的存在会阻碍结晶的形成：,可通过选择适当的溶剂，溶出杂质，或只溶出所需要的成分。或用活性炭除去有色杂质，或采用氧化铝、硅胶、硅藻土等吸附色谱法使杂质尽可能除去。再进行制备结晶。但应用吸附剂除去杂质时，要注意所需要的成分也可能被吸附而损失。此外，层析法更是分离制备单体纯品所常用的有效方法,有些化合物本身不易结晶：,可将其制备成结晶性衍生物。如生物碱可制成盐，有机酸制成钾、钠、钙、铵盐，羟基化合物制成乙酰化衍生物或苯甲酰衍生物，羰基化合物可以制成脎或腙类化合物等。分离后，再用化学方法处理使其恢复成原来化合物。美登碱在原料中含量少，且反复分离精制难以得到结晶，但制备成,3,一滇丙基美登碱结晶后，再经水解除去澳丙基，美登碱就能制备成为结晶。,结晶纯度的判断,鉴定结晶纯度的方法，一般可根据下述几点来判断：,（,1,）结晶形态和色泽,（,2,）熔点和熔距,（,3,）色谱分析法,（,1,）结晶形态和色泽,即一个纯的化合物一般都有一定的晶形和均匀的色泽。,虽然晶形态可随复结晶条件的改变而有所不同，但结晶形状总是一致的。观看结晶形状可用放大镜或显微镜。如看出结晶形状不一致，那就可判断该结晶尚不是一个单一的化合物；,但是也会有例外：如葡萄糖在水溶液中加乙醇析出时，由于结晶水含量不同，先出和后析出的晶形可以不同。当然结晶形状一致也不能完全肯定是单一化合物，还必须配合其他检查。,（,2,）熔点和熔距,一个纯粹单体化合物一般都有一定的熔点和较小的熔距。,鉴时要注意重结晶前后的熔点是否一致。如复结晶后比复结晶前点高，那说明还需要再一次复结晶。,纯化合物重结晶前后熔点应该一致。,熔距：,是指开始收缩到完全熔化或分解的温度距离。,一般一个纯化合物的熔距很窄，有时要求在,0.5,左右。但一般自植物提取的结晶由于本身结构原因，有时熔距会在,12,以内。,化合物结晶的形状和熔点往往因所用溶剂不同而有差异。,原托品碱在氯仿中形成棱往状结晶，熔点,207,；在丙酮中则形成半球状结晶，熔点,203,；在氯仿和丙酮混合溶剂中则形成以上两种晶形的结晶。,又如,N,一氧化苦参碱，在无水丙酮中得到的结晶熔点,208,，在稀丙酮（含水）析出的结晶为,77,80,。,所以文献中常在化合物的晶形、熔点之后注明所用溶剂。,当某化合物的结晶有一定的结晶形状、色泽、熔点和熔距，一般可以作为鉴定的初步依据。这是非结晶物质所没有的物理性质。,注；,一般熔距较长则表示化合物不纯。但也不能绝对化，特别是分解点,.,一些化合物分解点的距离比较长，另外有一些化合物的分解点不容易看清楚。,有一些化合物仅有分解点，而熔点不明显。,如有些结晶化合物在加热过程中色泽逐步变深，最后到分解，看不清明显的收缩点。,还有一些情况是，有些化合物结晶前后熔点是一致的，熔距也是很短的，但不是单一纯粹的化合物,特别是立体异构体和结构非常类似的混合物。常有这样的现象。如土槿皮酸晶形、熔点、熔距来看都认为是纯的，但从色层法检查发现是三种单体的混合物；又如乌头中乌头碱、次乌头碱和新乌头碱三者的混合结晶，从晶形、熔点和熔距来看也可误认为是纯的。这些均加以注意。,在测熔点和熔距时要注意有些化合物有双熔点特性，即在某一温度已经全部熔化，当温度继续上升时又固化，再在某一更高温度时又熔化或分解。如汉防己乙素在,176,时熔化后继续加热至近,200,时又固化，再在,242,时分解。又如芫花素,(,Genkwanin,),和一些与糖结合成的苷类化合物，也有双熔点现象。,（,3,）色谱分析法,色谱分析法发展后已成为鉴定结晶纯度的一种常用工具。,一般常用的有：,纸层析,纸上电泳,薄层层析,高效薄层色谱,气相色谱,高效液相色谱。,薄层层析法（,TLC,）：,1.,一个单一的纯化合物在纸层或薄层点样后经过展开和显色，一般只应有一个斑点。如操作条件适当，层层显色可以看到不拖尾的近于圆形的一个斑点。,2.,要鉴定一个结晶化合物是否纯，往往需经过几种不同溶剂系统展层，然后显色，或在紫外灯下观察，如只看到一个斑点（比移值在,0.3,0.7,之间），可证明是一个单一化合物；再辅以熔点、晶形和色泽的观察，肯定纯度就更为可靠。,中药成分经过同一溶剂进行三次重结晶，其晶形及熔点一致，同时在薄层层析或纸层层析法经数种不同展开剂系统检定，也为一个斑点者，一般可以认为是一个单体化合物。,但应注意,:,1.,有的化合物在一般层析条件下，虽然只呈现一个斑点，但并不一定是单体成分。,例如鹿含草中主成分为高熊果苷，异高熊果苷极难用一般方法分离，经反复结晶后，在纸层及聚酞胺薄层上都只有一个斑点，易误认为单一成分，但测其熔点在,115,125,，熔距很长。经制备其甲醚后，再经纸层层析检定，可以出现两个斑点，异高熊果苷的比移值大于高熊果苷。又如水菖蒲根茎挥发油中的,一细辛醚和,一细辛醚，在一般薄层上均为一个斑点，前者为结晶，熔点,63,，后者为液体沸点,296,，用硝酸银薄层或气相层析很容易区分。,2.,有时由于层析条件选择不当，单纯化合物也会出现两个或两个以上的斑点。,遇到这种情况可以用厚质层析滤纸，点样可稍多，展层后不显色，将主要斑点的相应位置剪下，用溶剂洗下浓缩后再按同样条件用普通层析滤纸展层，如果仍显出一个以上斑点，那末可说明该单体在这样层析条件下有部分分解。有时采用同一种溶剂系统双向展开，也能达到同样目的。,3.,有时个别化合物（如氨基酸）可能部分地与层析纸或薄层上的微量金属离子（如,Cu,）、酸或碱形成络合物、盐或分解而产生复斑。因此，判定结晶纯度时，要依据具体情况加以分析。,如一些氨基酸往往具有复斑点。,液体的纯度是以它的沸点来确定的，纯化合物的沸距应在,1,的范围内。有时需要制成它的固体衍生物，将固体反复结晶后再回到液体，进行蒸馏，观察其沸点有否改变，不变者为纯化合物。,非晶形固体最好能制成其结晶性的衍生物，进行反复结晶后再回到原来状态。如始终无法结晶，那就只能根据纸层析、薄层层析的结果加以判断。,气相色谱,:,往往也是判断纯度的重要方法之一，主要适用于在高真空和一定加热条件下能气化而不被分解的物质，因此对液体样品、低熔点固体、能升华的物质，都可考虑试用。,高效液相色谱法,:,也可以用作判断有效成分纯度的一种重要手段有用量省、时间快、灵敏度高及准确的优点，而且不受气相色谱那样的要求限制。,判断,:,1.,在不同色谱条件下为单一色谱峰,且无色谱峰重叠,(DAD,检测,),2.,在大样品进样量,(,例,:20,g/,l),条件下,采用归一化法计算纯度,.,其他方法,:,质谱,核磁共振,核磁共振,:,由于分离所得的有效成分结晶或单体化合物一般需要进行光谱分析来鉴定是否为已知或未知化合物。某些光谱，特别核磁共能帮助判断有效成分的纯度，但必须在该成分大致为何物或某些类型的化合物已基本搞清，或者该成分的可能杂质为何物也有所知的情况下，判断纯度才有意义。,一般来讲应该效成分已经分离纯化后才进行这些光谱分析，并不是利用这些手段来判断是否已纯。但往往在解析光谱图谱时，有时会发现认为已经纯的有效成分并不纯，而是夹杂了一定的“杂质，而“杂质”往往是该有效成分的同类型化合物或同系物，物化性较接近，难于分离。在核磁共振图谱上如出现不该有的质子信号，那就说明夹有“杂质”。,如在谱上，有甲氧基、碳甲基、氮甲基、次甲氧基、链烯质子或芳香质子等信号，它们的积分线所表现的相对质子数如不到应有的质子数目，这就说明不纯，而且根据积分线所表现的相对质子数，可以粗略地估计其纯度百分比。,例如在分离甲氧基喜树碱过程中，开始分到的认为已经纯的样品，其核磁共振图谱，在芳香甲氧基的甲基质子信号，其积分线所表现的相对质子数只有,2,左右，说明不纯，其中夹有喜树碱类的杂质，而且能估计出甲氧基喜树碱的纯度仅约,70%,左右。因此需要进一步纯化。,质谱,:,在质谱图谱上，在分子离子峰附近除,M,一,1,、,M+1,及,M+2,外不应有其他峰，如有，就可能不纯；另外也可以注意有否,M+14,、,M+14+14,或,M,一,14,、,M,一,14,14,的峰，如有也表示该化合物不纯，而混有同系物高位同族体或低位同族体：,如在分离三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱时，分得的三尖杉酯碱的质诺图谱除,M+53l,外，另有,M+545,较弱的峰，这说明在三尖杉酯碱的样品中混有少量高三尖杉酯碱。同样，高三尖杉酯碱样品的质谱图谱除,M+545,外，也有较弱的,m,e531,碎片峰，也同样说明高三尖杉酯碱样品中混有少量三尖杉酯碱。因为在质谱中不可能有,M,一,14,的断裂，从这就告诉我们还需要进一步分离纯化。,总之，判断一个有效成分纯度的手段很多，但要结合起来考虑，单靠某一方法就来肯定，显然是不够的。而且随着检查手段，特别是物化方法的发展，有些本来在当时的条件下，检查判断认为是纯的，而在以后新的检查条件下又可能发现为不纯。特别在化学结构未完全测定的情况下，回过头来重新检查，有时是会发现问题的,.,