生物质谱技术与方法fytw

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,质谱技术与方法,质谱分析法,（,mass spectrometry,，,MS,）,是将化合物形成离子和碎片离子，按质荷比,（,m/z,）的不同进行分离，来进行成分和结,构分析的,方法。,所得结果用质谱图（亦称质谱，,Mass,Spectrum,）表示。,根据质谱图提供的信息可以进行有机物及无,机物的定性和定量分析、生物大分子的结构,分析、样品中各种同位素比的测定及固体表,面的结构和组成分析等。,生物质谱,（,Bio - mass spectrometry,，,Bio-MS,）,是用于生物分子分析的质谱技术。,生物质谱要求测定上万甚至是几十万的,相对分子质量 。,随着电喷雾电离（,ESI,）和基质辅助激光,解吸电离（,MALDI,）技术的完善和成熟，,生物大,分子的质谱分析才得以实现。,The Nobel Prize in Chemistry 2002,for the development of methods for identification and,structure analyses of biological macromolecules,for their development of soft,desorption,ionisation,methods for,mass spectrometric analyses of,biological macromolecules,for his,development of,nuclear magnetic,resonance,spectroscopy for,determining the,three-dimensional,structure of,biological,macromolecules in,solution,约翰,芬,田中耕一,库尔特,伍斯里,奇,质谱法的基本原理,质谱分析的基本过程是使样品在离子源中,发生电离，生成不同质荷比的带电离子，,经加速电场的作用形成离子束，进入质量,分析器，在其中再利用电场和磁场使其发,生色散、聚焦，获得质谱图。,质谱分析中，多种离子化技术均可使物质,分子失去外层价电子形成分子离子,（,molecular ion,，,M,+,），分子离子中的化,学键还可以继,续发生某些有规律的断裂而,形成不同质量的碎片离子（,fragment ion,）：,M,M,+,+,碎片离子,+,中性分子,被分析样品离子电离后经加速进入磁场时，其动,能与加速电压及电荷,z,有关，即：,zeU,= 1/2mv,2,其中：,z,为电荷,数，,e,为元电荷（,e = 1,60,10,-19,C,），,U,为加速电压，,m,为离子的质量，,v,为离子初,加速后的运动速度。,具有速度,v,的带电粒,子进入质谱仪的质量分析器中，,根据所选择的分离方式，最终各种离子按质荷比,（,m,z,）的不同实现分离。,质谱仪,质谱仪包括进样系统、电离系统、质量分析器,和检测系统。为了获得离子的良好分析，必须,避免离子损失，因此凡有样品分子及离子存在,和通过的地方，必须处于真空状态。,在进行质谱分析时，一般过程是：通过合适的,进样装置将样品引入并进行气化。气化后的样,品引入到离子源进行电离。电离后的离子经过,适当的加速后进入质量分析器，按不同的,m,z,进行分离。然后到达检测器，产生不同的信号,而进行分析。,质量分析器,检测器,样品导,入系统,离子源,真空泵,m/z,计算机控制与,数据处理,相,对,丰,度,质谱仪的构成,Data,System,Mass,spectrum,out,Inlet,System,Mass,Analyzer,Ion,Source,Detector,Sample,in,Inlet systems:,Ion sources:,Mass analyzers:,Simple vacuum lock,HPLC,GC,Electrospray,(ESI),MALDI,FAB/LSIMS,Electron ionization (EI),Quadrupole,Time-of-flight,Ion trap,Magnetic sector,FTMS,Mass Spectrometer Schematic,Vacuum envelope,离子源,(ion source),质谱仪中将分子转化为离子的装置称为离子,源,(ion source),。由于离子化所需要的能量,随分子不同差异很,大，因此，对于不同的分,子应选择不同的离解方法。,通常将能给样品较大能量、生成较多碎片离,子的电离方法称为,硬电离方法,（如电子轰击,离子化，,EI,），而给样品较小能量、,碎片离,子较少或不生成碎片离子的电离方法称为,软,电离方法,。,生物质谱中有代表性的离子源,1,电喷雾电离,(,E,lectrospray,Ionization,，,ESI,),2,离子喷雾电离（,Ion spray Ionizat,ion,，,ISI,）,3,大气压化学电离,(,Atmospheric Pre,ssure,Chemical Ionization,，,APCI,),4,基质辅助激光解吸电离,(,M,atrix Assisted,Laser Desorption Ionization,，,MALDI,),5,快原子轰击电离,(,Fast Atom,Bonbardment,Ionization,，,FAB,),离子源是质谱仪的心脏，可以将离子源,看作是离子化反应器，样品在其中发生,一系列的特征裂解反应，反应在很短时,间（,10,-11,s,）内发生，所以可以快速地获,得质谱图。,质量分析器,质量分析器是质谱仪的核心，它将离子,源产生的离子按其质量和电荷比（质荷,比,m/z,，,m,离子的质量数，,z,离子携,带的电荷数）的不同,在空间的位置,时间的先后或轨道的稳定与否进行分离,以便得到按质荷比（,m/,z,）大小顺序排列,而成的,质谱图。,质量分析器,(mass analyzer),的种类,1.,磁质量分析器,(,单聚焦质量分析器,双聚,焦质量分析器,),2.,四极质量分析器,(,四极杆滤质器,),3.,飞行,时间质量分析器,(TOF,),4.,离子阱,(Ion Tra,p),质量分析器,5.,离子回旋共振,质量分析器,其中,234,是目前生物质谱,分析中常,用的质量分析器,检测器,1.,直接电检测器,2.,电子倍增器,3.,闪烁检测器,4.,微通道板,计算机控制与数据处理系统,1.,监控各单元的工作状态,实现质谱仪的,全自动操作,.,2.,数据的采集和简化,.,3.,质量数的转换,.,4.,扣除本底或相邻组分的干扰,.,5.,谱峰强度归一化,.,6.,标出高分辨质谱的元素组成,.,7.,用总离子流对质谱峰强度进行修正,.,8.,谱图的累加,平均,.,9.,输出质,量色谱图,.,10.,单离子检测和多离子检测,.,11.,谱图检索,.,质谱图,质谱分析中，按各离子,m/z,的顺序及相对,强度大,小记录分析结果的图谱即为质谱,图。由于图谱中离子的质量及相对强度,是各物质所特有的，即反映了物质的性,质和结构特点，因此通过质谱解析可以,进行物质的成分和结构分析。,常见的质谱图是经过计算机处理后得到,的棒图（,bar graph,）。,常见的质谱图是经计算机,处理的棒图,.,图中,纵坐,标表示离子的,相对丰度,(,以质谱中最强,峰的高度为,100%,并将此,峰称位基峰,其余峰按与,基峰的比例加以表示,又,称为相对强度,);,横坐标表,示离子的质荷比,.,根据峰位,(,棒位,),可进行定,性鉴别,;,根据相,对丰度可,进行定量测定,.,15,28,29,31(,基峰,),32,(,分子离子峰,),33,100,80,60,40,20,10,20,30,40,50,m/z,相,对,峰,强,棒图,(bar graph),CH,3,OH,%Intensity,1239.4,1679.8,2120.2,2560.6,Mass (,m/z,),0,3001.0,0,799.0,10,20,30,100,1480.60,1567.46,90,80,70,60,50,40,804.68,2044.21,1738.35,1570.45,1439.65,1894.26 2047.21,927.77,843.87,2470.78,2210.10,1923.27,1724.38,1000.70,1209.84,1391.67,1574.12,2661.87 2807.67,2066.13,牛血清蛋白（,BSP,）酶解产物的,质谱图,Voyager Spec #1BP = 1480.6, 8127,10,0,30,%Int.,100,90,80,70,60,50,40,3494,3495,3496,3497,3498,3499,3500,3501,3502,3503,3497.6422,3496.6541,3498.6256,3495.6545,3499.6528,20,3500.6595,3501.6502,Resolution 20,000,m/z,胰岛素的高分辨质谱图,质谱仪的主要性能指标,衡量质谱仪整体性能的主要指标有：,质量范围,分辨率,质量准确度,灵敏度,扫描速度等,质量,分析器,质量上限,(,m/z,),质量准确,度（,u,）,分辨率,（,R,）,扫描速度,（,u/s,）,适用,范围,四极杆质,谱,4000,0.1,500,3000,4000,6000,小分子、,多电荷离,子大分子,离子阱质,谱,10000,0.1,1000,10000,4000,6000,小分子、,多电荷离,子大分子,飞行时间,质谱,500000,0.001(,高,分辨飞行,时间质谱,),500,1000,（低），,2000,20000,（高）,1000000,小分子、,大分子,不同类型质量分析器的性能指标,质量范围,(mass range),是指质谱仪能够测量的离子质量范围，通常用最小和最大离,子的离子质量表示。,质谱分析中，是以核素,12,C,质量（,12,C=12.000u,）的,1/12,为一,个质量单位（,u,）。,1u =,（,12.00,000 gmol,-1,/ 6.02214,10,23,mol,-1,）,/12,= 1.66054,10,-24,g,在生物大分子的质谱分析中，还常用道尔顿（,dalton,，,Da,）,作为度量单位。,1Da = 1.6603,10,-24,g,。,Da,与,u,两者相差,万分之三左右，在生物质谱分析中，可以视为,1Da = 1u,。,质量准确度（,mass accuracy,）,质量准确度又称质量精度，即离子质量实测,值,M,与,理论值,M,0,的相对误差：,质量精度,=,M,M,0,/ m,10,6,(,ppm,),（,m,为,离子质量数的整数）,仪器的质量精度一般应小于,10,ppm,。,分辨率,(resolution,，,R),分辨率是指仪器能分离相邻两质谱峰的能力。若,将强度近似相等、质量分别为,M,和,M+,M,的两个,相邻峰恰好分开，则质谱仪的分辨率定义为：,R,m,1,/ (m,2,- m,1,),m,1,/,M,其中,m,1,、,m,2,：为质量数，,且,m,1,m,2,：，故在两,峰质量相差越小时，要求仪器分辨率越大。,重点介绍两种生物质谱分析方法,基质辅助激光解吸电离,/,飞行时间质谱,（,Matrix Assisted Laser Desorption,Ionization / Time of Flight Mass Spectra,，,MALDI-TOF MS,）,电喷雾电离,(,Electrospray,Ionization,，,ESI),质谱,电喷雾离子化（,ESI,）原理,内衬弹性石英管的不锈钢毛细管（内径,0.1,0.15mm,）被,加以,2,5kV,的正电压，与相距约,1,2cm,接地的反电极形,成强静电场。,被分析的样品溶液从毛细管流出时，在电场作用下形成高,度荷电的雾状小液滴；在向质量分析器移动的过程中，液,滴因溶剂的挥发逐渐缩小，其表面上的电荷不断增大。,当电荷之间的排斥异力足以克服表面张力时（瑞利极限），,液滴发生裂分；经过这样反复的溶剂挥发,-,液滴裂分过程，,最后产生单个的气态离子。,由于没有外界能量直接作用于分子，因此对分子结构破坏,较少，是一种典型的,“,软电离”方式。,ESI,MALDI,1,、离子化形式：产生多电荷离子，常与,与,HPLC,联用，才适用于混合物中蛋白质,成分的鉴,定,1,、离子化形式：通常产生单电荷离子，,因此，适用于混合物中蛋白质成分的,-18,2,、灵敏度,：,10,M,-15,-18,2,、灵敏度,：,10,M,3,、分辨率：,5,000,3,、分辨率：,5,000,4,、联用形式：可与,H,PLC,、,CE,在线联用,4,、联用形式：只能与,H,PLC,、,CE,离线联,用,5,、与质量分析器的兼容性：可与各种质,量分析器（,QQQ, QTOF,，,Ion Trap,，,FTMS,）兼容,5,、与质量分析器的兼容性：主要与,T,OF,配合使用,6,、源内裂解能力：具有低能量,（,1keV,）,的诱导碰撞解离能力,7,、适用性：精确分子质量测定、,M,S /,MS,分析（使用,Trap,质量分析器可做,n,MS,分析）,7,、适用性：精确分子质量测定、,P,MF,分,析,8,、操作的难易程度：需经培训,8,、操作的难易程度：容易,ESI,与,MAL,DI,的比较,质量分析器,(mass analyzer),在生物质谱中，与,ESI,离子化源配合使用,的质量分析器主要有：、四极滤质器、,离子阱分析器和离子回旋共振分析器等。,随着技术的发展，也可以采用这些分析,器的变型。,四极滤质器,（,Quadrupole,Mass Filter,）,四极滤质器也称四极质量分析器，它由,四根截面呈双曲面的平行金属杆电极组,成，离子束穿过对准四根杆之间空间的,准直小孔。,相对的一对电极是等电位的，两对电极,之间的电位是相反的。,离子源的电位比四极滤质器的电位略高,几个伏特，以提供离子沿传播中心轴飞,行所需的动能。,离子阱,(ion trap),质量分析,器,离子阱质量分析器亦称四极离子阱（,quadropole,ion,trp,）或,Paul,阱，简称离子阱，是一种通过电,场或磁场将,气相离子控制并贮存一段时间的装置。,这种分析器是由双曲线表面的中心环形电极,（,ring electrode,） 和 上 下 各 一 个 端 盖 电 极,（,endcap,electrode,）组成，中间形成一个空腔,（阱），因此而成为离子阱。端盖电极接地，环,形电极施以射频电压。,离子阱内充有一定量的氦气（约,10,-3,（,Torr,），这,有利于离子朝中心聚集，而离子聚,集得越紧凑，,离子能量和位置分散越小，有利于提高分辨率和,灵敏度。,液相色谱,-,质谱联用,技术,（,liquid chromatography / mass,spectrometry,，,LC-MS,）,LC-MS,把液相色谱技术强有力的分离能力与质,谱技术有效的定性分析能力相结合，特别适合,于复杂体系的分离分析，目前已成为蛋白质组,学研究中最重要的技术平台之一。,LC-MS,的开发在技术上十分困难，直到电喷雾,电离（,ESI,）接口和大气压化学电离（,APCI,）,接口出现，在,20,世纪,90,年代才有了成熟的商品,化的液相色谱,-,质谱联用仪。,HPLC,*,含有缓冲剂的,水相,/,有机溶剂,*,非挥发性分,析样品,Interface,*,脱溶剂,*使分析样品,发生离子化,MS,*,高真空度,*,按,m/z,分析,产生的,离子,LC-MS,的基本构成,接口的作用就是将,HPLC,与,MS,两者实现在线的对接。,它的,主要作用是脱去来自,HPLC,的大量溶剂，使分析样品由,液相转变为气相并发,生离子化。,接口性能的好坏在很大程度上决定着色谱,-,质谱联用仪器性能,的优劣。,好的,HPLC,条件,可能是,“,坏的,”,MS,条件，,二者难以匹配,要实现,HPLC,与,MS,的有效的联用，必,须,解决以下困难问题：,色谱仪与质谱仪的压力匹配问题,色谱仪与质谱仪的流量匹配问题,气化问题,谱图类型,色谱,-,质谱,提供的信息,MS,的谱图有,:,1.,质谱图,2.,色谱图,3.,全扫描色谱,-,质谱三维谱,谱 图 类 型,色谱,-,质谱提供的信息,MS,的谱图有,:,1.,质谱图,质谱图是一次扫描时间内得到的峰强,质荷比图。扫描方式又有连续扫描和跳,变扫描之分。,2.,色谱图,3.,全扫描色谱,-,质谱三维谱,色 谱 图,通常有三种类型,:,1.,总离子流色谱图,(T,IC),2.,质量色谱图,(MC),3.,选择离子监测图,(S,IM),一个例子,:,反相高效液相色谱,-,电喷雾电离质谱法测定,人血浆,、尿样中,D,L-,异亮氨酸和,D,L-,别异,亮氨酸异构体,H,2,N,COOH,CH,C H,2,CH,H,3,C,C H,3,H,2,N,COOH,CH,CH,H,2,C,C H,3,C H,3,Leucine,Isoleucine,图,. 17,对,氨基酸和甘氨酸标准溶液衍生物的,RP-HP,LC,荧光检测色谱图,Fig. Chromatograms of OPTA-,AcCys,-derivatives of 17 pairs of standard amino acids,and,Gly,. A:L-Ile, B:L-,allo,-Ile, C:D-Ile, D:D-,allo,-Ile,Conditions: mobile phase A, 50,mmol,/L NH,4,AC; mobile phase B: methanol; 0-10 min,mobile phase B 10%; 10-30 min, mobile phase B 10-40% (linear gradient);30-70 min,mobile phase B 40%; flow rate : 0.2 ml / min ;,column temperature: 35,.,Detector,：,ex,345 n,m,em,445nm,图,.,异亮氨酸衍生物负离子检测的质谱图,图,. 17,对,氨基酸和甘氨酸标准溶液衍生物的,质谱检测,SIM,色谱图,Fifg.3 SIM LC/MS chromatograms of OPTA-,AcCys,-derivatives of 17 pairs of,standard amino acids and,Gly,tandard,amino acids,mobile phase: 40% 50,mmol,/L NH,4,AC, 60% methanol; M-H,-,m/z,391,在,LC-MS,分,析中，,MC,的用途很广，例如：,利用,MC,搜寻目标化合物，快速鉴别化,合物,类型；,可以检查色谱峰的纯度，即利用化合物特征,离子质量色谱保留时间的差异，分辨共流出的,色谱峰。如果色谱峰是单一的化合物，则该化,合物的几个主要特征离子的质量色谱峰应该是,重叠的，保留时间是一致的；,MS,比,TIC,简洁，消,除了背景干扰，信噪比更,好，因此，多采用,MC,的色谱峰面积进行定量。,生物质谱技术,进行蛋白质鉴定分析的流程,肽质量指纹谱,peptide mass,fingerprinting,PMF,-,当前鉴定蛋白质的质谱技术,肽质量指纹谱,(,PMF,),PMF,是指蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解,后得到的肽片段质量图谱，由于其具有特征性,所以称为指纹谱。,PMF,可用于蛋白质的鉴定，即用实验测得的蛋,白质酶解肽段质量数在蛋白质数据库中检索，,寻找具有相似肽指纹谱的蛋白质。,如果在数据库中找不到，有可能是发现了新蛋,白质，要进行序列分析，合成,DNA,探针来表达,分离和鉴定这一蛋白质。，,