第8章-酶通论

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第8章 酶通论,一、酶催化作用的特点,二、酶的化学本质及其组成,三、酶的命名和分类,四、酶的专一性,五、酶的活力测定和分离纯化,六、核酶,七、抗体酶,八、酶工程简介,一、酶催化作用的特点,酶是一类具有高效率、高度专一性、活性可调节的高分子生物催化剂。,1857 Pasteur提出酒精发酵是酵母细胞活动的结果。,1897Buchner兄弟证明发酵与细胞的活动无关，不含细胞的酵母汁也能进行乙醇发酵。,1913Michaelis和Menten提出米氏方程。,1926Sumner首次从刀豆中提出脲酶结晶，并证明具有蛋白质性质。,1969Merrifield人工合成核糖核酸酶。,1967-1970从E.coli中发现第I、第II类限制性核酸内切酶。,1982Cech和Altman发现四膜虫细胞大核期间26SrRNA前体具有自我剪接功能。,Schultz,与,Lerner,研制成功抗体酶。,Boyer,和,Wakler,阐明,ATP,合成酶合成与分解,ATP,的分子机制。,（一）酶和一般催化剂的比较,酶与非生物催化剂相比的几点共性：,催化效率高，用量少（细胞中含量低）。,加快反应速度但不改变化学反应平衡点。,降低反应活化能。,反应前后自身结构不变。,催化剂改变了化学反应的途径，使反应通过一条活化能比原途径低的途径进行，催化剂的效应只反映在动力学上（反应速度），不影响反应的热力学（化学平衡）。,（二）酶作为生物催化剂的特点,酶的催化作用可使反应速度提高10,10,1,倍。,例如：过氧化氢分解,2,H,2,O,2,2H,2,O + O,2,用,Fe,3+,催化，效率为6,10,-4,mol/molS，,而用过氧化氢酶催化，效率为6,10,6,mol/molS。,转换数,（,turnover number）,的概念：每秒钟每个酶分子能催化底物发生变化的微摩尔数，用,kcat,表示（,mol/S,）。,1高效性,（酶具有极高的催化效率）,2专一性 Specificity,酶的专一性 Specificity,又称为特异性，是指酶在催化生化反应时对底物的选择性，即一种酶只能作用于某一类或某一种特定的物质。亦即酶只能催化某一类或某一种化学反应。,例如：蛋白酶催化蛋白质的水解；淀粉酶催化淀粉的水解；核酸酶催化核酸的水解。,3反应条件温和,酶促反应一般在pH 5-8 水溶液中进行，反应温度范围为20-40,C。,高温或其它苛刻的物理或化学条件，将引起酶的失活。,酶易失活,凡能使蛋白质变性的因素如强酸、强碱、高温等条件都能使酶破坏而完全失去活性。所以酶作用一般都要求比较温和的条件如常温、常压和接近中性的酸碱度。,.酶活力可调节控制,如抑制剂调节、共价修饰调节、反馈调节、酶原激活及激素控制等。,.某些酶催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关。,（二）酶作为生物催化剂的特点（小结）,（1）催化效率高：,酶催化反应速度是相应的无催化反应的10,8,-10,20,倍，并且至少高出非酶催化反应速度几个数量级。,（2）专一性高：,酶对反应的底物和产物都有极高的专一性，几乎没有副反应发生。,（3）反应条件温和：,温度低于100，正常大气压，中性pH环境。,（4）活性可调节：,根据据生物体的需要，许多酶的活性可受多种调节机制的灵活调节，包括：酶量的调节、激素调节、反馈抑制、别构调节、酶的共价修饰、酶的合成、活化与降解等。,（5）酶的催化活性离不开辅酶、辅基、金属离子。,二、酶的化学本质及其组成,（一）,酶的化学本质,绝大多数酶是蛋白质。,证据：（1）能被蛋白酶水解失活，酸水解的产物是氨基酸；（2）具有蛋白质的一切共性，如凡是能使蛋白质变性的因素都能使酶变性。,少数酶是RNA（核酶）。,（二）酶的化学组成及类别,.,结构专一性,（）绝对专一性,（,Absolute specificity),有些酶对底物的要求非常严格，只作用于一个特定的底物。这种专一性称为,绝对专一性,。,例如：脲酶、麦芽糖酶、淀粉酶、碳酸酐酶及延胡索酸水化酶（只作用于反丁烯二酸）等。,（）相对专一性,(,Relative Specificity),有些酶的作用对象不是一种底物，而是一类化合物或一类化学键。这种专一性称为,相对专一性,。,包括：,族,(,group)专一性（对键两端的基团要求的程度不同，只对其中一个基团要求严格）,。,如,-,葡萄糖苷酶，催化由,-,葡萄糖所构成的糖苷水解，但对于糖苷的另一端没有严格要求。胰蛋白酶，水解碱性氨基酸的羧基形成的肽键。,键,(,Bond)专一性,。如酯酶催化酯的水解，对于酯两端的基团没有严格的要求。,.,立体化学（异构）专一性,（） 旋光异构,专一性,酶的一个重要特性是能专一性地与手性底物结合并催化这类底物发生反应。即当底物具有旋光异构体时，酶只能作用于其中的一种。,例如，,淀粉酶,只能选择性地水解D葡萄糖形成的1，4糖苷键；,L-氨基酸氧化酶,只能催化L-氨基酸氧化；,乳酸脱氢酶,只对L-乳酸是专一的。,（）,几何异构专一性（,geometrical specificity,）,有些酶只能选择性催化某种几何异构体底物的反应，而对另一种构型则无催化作用。,如,延胡索酸水合酶,只能催化延胡索酸即反丁烯二酸水合生成苹果酸，对马来酸（顺丁烯二酸）则不起作用；,丁二酸（琥珀酸）脱氢酶。,（二）酶的化学组成及类别（小结）,据酶分子组成分类,单纯蛋白质酶类,结合,蛋白质酶类,酶蛋白质,辅助因子,金属离子,辅基,辅酶,据酶蛋白特征分类,单体酶,寡聚酶,多酶复合体,单体酶,-monomeric enzyme：,一般由一条肽链组成，如溶菌酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等。但有的单体酶有多条肽链组成，如胰凝乳蛋白酶由3条肽链，链间由二硫键相连构成一个共价整体。,寡聚酶,-oligomeric enzyme：,由2个或2个以上亚基组成，亚基间可以相同也可不同。亚基间以次级键缔合。如3-磷酸甘油醛脱氢酶、乳酸脱氢酶、丙酮酸激酶等。,多酶体系,-multienzyme system：,由几种酶靠非共价键彼此嵌合而成。主要指结构化的多酶复合体如丙酮酸脱氢酶系、脂肪酸合成酶复合体等。,三、酶的命名和分类,（一）习惯命名,1961年以前使用的酶沿用习惯命名：,（1）依据底物来命名：,如：催化蛋白质水解的酶称蛋白酶。催化淀粉水解的酶称淀粉酶。,（2）依据催化反应的性质及类型命名：,如：水解酶、转氨酶。,（3）结合上述两个原则命名,，琥珀酸脱氢酶。,（4）有时加上酶的来源,，如：胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶。,（二） 国际系统命名法,基本原则：明确标明酶的底物及催化反应的性质（底物为水时可略去不写）。,谷丙转氨酶的系统名称 丙氨酸:-酮戊二酸氨基转移酶,（三）国际系统分类法及酶的编号,（1）按反应性质分六大类，用1、2、3、4、5、6表示。,（2）根据底物中被作用的基团或键的特点，将每一大类分为若干个亚类，编号用1、2、3 、。,（3）每个亚类又可分为若干个亚亚类，用编号1、2、3表示。,每一个酶的编号由4个数字组成，中间以“.”隔开。,第一个数字表示大类，第二个数字表示亚类，第三个表示亚-亚类，第四个数字表示在亚-亚中的编号。,乙醇脱氢酶,乳酸脱氢酶 EC1.1.1.27,苹果酸脱氢酶,第一个数字表示大类： 氧化还原,第二个数字表示作用基团：醇基,第三个数字表示电子受体：NAD,+,或NADP,+,第四个数字表示此酶底物：乙醇，乳酸，苹果酸。,*,国际生物化学会酶学委员会（Enzyme Commsion）将酶分成六大类：1.,氧还原酶类,，2.,移换酶类,，3.,水解酶类,，4.,裂合酶类,，5.,异构酶类,，6.,合成酶类,国际分类的盲区：忽略了酶的物种差异和组织差异,SOD： ，只有一个名称和编号,2O,2,-,+2H,+,H,2,O,2,+O,2,三类不同的SOD：,CuZn-SOD 真核生物细胞质中,Mn-SOD 真核生物线粒体中,Fe-SOD,同是CuZn-SOD，来自牛红细胞与猪红细胞的，其一级结构也有很大不同。,在讨论一个具体的酶时，应对它的来源与名称一并加以说明。,四、酶的专一性,（一）酶的专一性,酶的专一性,结构专一性,绝对专一性,相对专一性,基团专一性,键专一性,立体异构专一性,旋光异构专一性,几何异构专一性,（二）关于酶作用专一性的假说,锁钥学说(,1894年Emil Fischer,lock and key thoery)：,认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样。,将酶的活性中心比喻作锁孔，底物分子象钥匙，底物能专一性地插入到酶的活性中心。,（但如何解释酶的多底物现象、酶对正反方向的催化、相对专一性）,诱导契合学说(,1958年 D.Koshland,induced-fit hypothesis)：,酶的活性中心在结构上具柔性，底物接近活性中心时，可诱导酶蛋白构象发生变化，这样就使酶活性中心有关基团正确排列和定向，使之与底物成互补形状有机的结合而催化反应进行。,诱导契合学说的要点,A.酶有其原来的形状，不一定一开始就是底物的模板,B.底物能诱导酶蛋白的形状发生一定变化（专一性结合）,C.当酶的形状发生变化后，就使得其中的催化基团形成正确的排列。,D.在酶反应过程中，酶活性中心构象的变化是可逆的。即酶与底物结合时，产生一种诱导构象，反应结束时，产物从酶表面脱落，酶又恢复其原来的构象。,Zn,Zn,Glu,270,Tyr,248,Arg,145,底物,羧肽酶结合底物前后构象变化,五、酶的活力测定和分离纯化,（一）酶活力测定,酶的含量不能直接用重量和摩尔数表示（不纯、失活、分子量不知），而采用酶的活力单位表示。,1.酶活力,酶活力：用在一定条件下，酶催化某一反应的反应速度表示。反应速度快，活力就越高。,酶量,酶活力,反应速度,酶促反应速度的表示方法：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。,研究酶促反应速度，以酶促反应的,初速度,为准。因为底物浓度降低、酶部分失活、产物抑制和逆反应等因素，会使反应速度随反应时间的延长而下降。,2.酶的活力单位,习惯单位（,U,）: 底物(或产物)变化量,/,单位时间,国际单位（,IU,）:1moL变化量,/,分钟,Katal（,Kat,）：1moL变化量,/,秒,3.酶的比活力,比活力,=,总活力单位,总蛋白mg数,=,U(或IU) mg蛋白,4.酶活力的测定方法,终点法,: 酶反应进行到一定时间后终止其反应，再用化学或物理方法测定产物或反应物量的变化。,动力学法,:连续测定反应过程中产物、底物或辅酶的变化量，直接测定出酶反应的初速度。,（1）分光光度法（spectrophotometry）：,多利用产物在紫外或可见光部分的光吸收性质，选择适当波长，测定反应过程的进行情况。简便、节约时间和样品，可以检测nmol/L水平的变化。,（2）荧光法(fluorometry)：,主要利用底物或产物的荧光性质。灵敏度高，但易受到干扰。,（3）同位素测定法：,同位素标记底物，反应后经分离，检测产物的脉冲数，即可换算成酶的活力单位。灵敏度最高。,（4）电化学方法：,pH计、 氧电极法,（二）酶的分离和纯化,酶的分离提纯方法，也就是常用来分离提纯蛋白质的方法。,（1）把很大体积的酶制剂浓缩到较小体积;,（2）把酶制剂中大量的杂质蛋白和其它大分子物质分离出去。,判断分离提纯方法的优劣，用,总活力的回收,和,比活力提高的倍数,来衡量。,过程：选材；破碎；抽提；分离及纯化；结晶；保存。,六、核 酶,(ribozyme),*,Ribozyme是一种RNA生物催化剂,Ribozyme的发现：RNA具有酶的催化功能是由Cech T.R于1982年提出的。1981年，发现四膜虫（tetrahymena thermophila）的26S rRNA前体在成熟过程中，其居间序列通过剪接反应被除去。并证明四膜虫rRNA前体的内含子序列核糖核酸（L-19RNA）具有多种催化功能，将这种具有催化活性的RNA称为 Ribozyme (ribonucleic acid enzyme)。获得1989年诺贝尔化学奖。,rRNA基因的转录产物即rRNA前体（大约6400个核苷酸残基）很不稳定，在鸟苷和Mg,2+,存在下切除自身的内含子（intron或intervening sequence,IVS-居间序列或间插序列），使两个外显子(exon)拼接起来，形成成熟的rRNA此过程没有任何蛋白质酶参与，称为自我剪接（self-splicing）,并证明RNA具有催化活性。,Ribozyme在一定条件下，高度专一地催化下列反应，具有相应酶的活性（底物专一、符合米氏方程、对竞争性抑制剂敏感,）,1.核苷酸转移酶活性 2CpCpCpCpC,CpCpCpCpCpC+CpCpCpC,2.磷酸二酯酶活性 CpCpCpCpC,CpCpCpC+Cp,3.磷酸转移酶活性,CpCpCpCpCpCp+UpCpU CpCpCpCpCpC +UpCpUp,4.RNA限制性内切酶活性,另外，1997年，Zhang和Cech证明了人工合成的RNA分子具有肽基转移酶活性。,Ribozyme发现的重大意义：,RNA具有酶的催化活性，向酶的化学本质是蛋白质这一传统概念提出了挑战。,在理论上，对于生物起源和生命进化的研究具有重要启示。,生物催化分子进化的可能性：,RNA RNA-蛋白质 蛋白质-RNA 蛋白质-辅酶或辅基 蛋白质,在实践上，由于Ribozyme的内切酶活性，可定点切割mRNA，破坏mRNA，抑制基因表达，为基因、病毒和肿瘤治疗提供了可行途径。,七、抗体酶,（abzyme）,抗体酶,指具有催化活性的免疫球蛋白，即在其高可变区赋予了酶的属性。是抗体的高度选择性与酶的高效催化性相结合的产物。,抗体与酶相似，都是蛋白质分子，酶与底物的结合及抗体与抗原的结合都是高度专一性的，但这两种结合的基本区别在于酶与高能的过渡态分子相结合，而抗体则与抗原（基态分子）相结合。利用抗体能与抗原特异结合的原理可用过度态类似物作为半抗原来,诱发抗体,，这样产生的抗体便能特异地识别反应过程中真正的过渡分子，从而降低反应的活化能。达到催化反应的目的，这种具有催化功能的抗体就被称为催化抗体或抗体酶。,O,C,A,. 酯酶的底物,酯,B,.酯的羧基碳原子受到亲核攻击形成四面体过渡态,C,.设计的磷酸酯类似物,作为抗原去免疫实验动物,磷酸酯类似物(,半抗原,),对酯水解反应有催化作用的单克隆,抗体,免疫,免疫反应,诱导法制备具有酯酶活性的抗体,抗体酶的筛选,在抗体酶研究中，一个不可少的步骤是在细胞融合后筛选到能分泌催化抗体的细胞克隆。一般的方法是先筛选其抗体能结合特异抗原的细胞克隆，再从纯化的抗体中筛选出有催化能力的单抗。主要筛选方法有生物学筛选法和纯化学筛选法。,抗体酶的研究和应用前景,催化抗体的出现不仅为人们开创了一条人工设计酶的新方法，也使人们对催化过程中催化剂的作用机理和催化剂和底物的相互识别有了进一步认识。,目前已经发现具有催化作用的自身抗体在生物体内的存在，其不仅和疾病相关，可能还参与了生物体内的某些或基本的生物学反应。有可能成为抗体酶研究的新热点。,充分利用抗体的种类繁多以及抗体酶的可诱导、可改造的特点，可望制备出具有治疗和辅助治疗某些疾病或催化某类具有特殊意义反应的抗体酶。,抗体酶的研究无疑会对化学、生物学、医学等领域产生深远影响。,八、酶工程简介,1971年第一届国际酶工程会议上得到命名。主要研究：酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造及其在工、农、医药等领域的应用。,（一）酶工程的概念,天然酶在开发和应用方面受到限制：,1.酶的不稳定性,2.酶的分离、纯化较难，成本高，价格贵,目前在酶的应用方面所采取的一般方法：,1.化学方法：通过对酶的化学修饰或固定化处理，改善酶的性质以提高酶的效率和降低成本，或通过化学合成法制造人工酶。,2.利用基因重组技术生产酶以及对酶基因进行修饰或设计新基因，生产出性能稳定、具有新的生物活性以及催化效率更高的酶。,（二）化学酶工程,化学酶工程亦称初级酶工程，指天然酶、化学修饰酶、固定化酶及人工模拟酶的研究和应用。,1.天然酶：,主要指工业用酶，从微生物发酵得到的酶。如：洗涤剂、皮革生产中用的蛋白酶；纸张制造用的淀粉酶；乳制品用的凝乳酶等。,2.化学修饰酶：,用于医药及研究工作。通过（1）化学修饰酶的功能基 ；（2）通过交联反应；（3）大分子修饰作用（用葡萄糖修饰SOD增加其半寿期，提高耐热性、耐酸碱性等。用葡萄糖和聚乙二醇修饰尿激酶等）。,3.固定化酶(immobilized enzyme)：,将水溶性酶用物理或化学方法，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。,4.人工模拟酶,化学法合成酶（已知酶的活性中心和作 用机理）。,3.固定化酶,1971年在第一届国际酶工程会议上正式采用,固定化酶,名称,酶的固定化方法：,物理法：吸附法和包埋法,化学法：共价偶联法和交联法,目前，我国利用固定化氨基酰化酶拆分DL-AA；,固定化的葡萄糖异构酶生产高果糖玉米糖浆；,（三）生物酶工程,生物酶工程亦称高级酶工程，是酶学和以DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。,生物酶工程的主要内容：,克隆酶,用基因工程技术大量生产酶（,-淀粉酶，青霉素酰胺酶、亮氨酸合成酶）,突变酶,对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶,（改变酶的催化活性、底物专一性、最适pH、改变酶的别构调节能力、改变酶对辅酶的要求、提高酶的稳定性）,制造新酶,设计新酶基因，合成自然界不曾有过的酶,