43 代谢的人工控制及其在发酵工业中的应用

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,4.3 代谢的人工控制及其在发酵工业中的应用,工业发酵的目的：大量积累人们所需要的微生物代谢产物。,代谢的人工控制：人为地打破微生物的代谢控制体系，使代谢朝着人们希望的方向进行。,人工控制代谢的手段：,改变微生物遗传特性(遗传学方法）；,控制发酵条件（生物化学方法）；,改变细胞膜透性；,1,工业发酵的目的大量地积累人们所需要的微生物代谢产物。,在正常生理条件下,微生物通过其代谢调节系统吸收利用营养物质用于合成细胞结构，进行生长和繁殖，它们通常不浪费原料和能量，也不积累中间代谢产物,代谢的人工控制,人为地打破微生物的代谢控制体系，就有可能使代谢朝着人们希望的方向进行,2,（1）对于直线式代谢途径：选育营养缺陷性突变株只能积累中间代谢产物,A,a,B,b,C,c,D,d,E,4.3.1.1,营养缺陷型菌株的应用,末端产物E对生长乃是必需的，所以，应在培养基中限量供给E，使之足以维持菌株生长，但又不至于造成反馈调节（阻遏或抑制），这样才能有利于菌株积累中间产物C 。,4.3.1.遗传学方法,3,(2) 分支代谢途径：情况较复杂，可利用营养缺陷性克服协同或累加反馈抑制积累末端产物，亦可利用双重缺陷发酵生产中间产物,A B C,D,E,F,G,4,各图成立的条件：1. 限量添加E；2.限量添加E；3.限量添加E和G；4.限量添加E和G；5.限量添加I,“”表示营养缺陷突变位置；“”表示反馈调节解除,要根据其不同反馈控制机制,5,谷氨酸棒杆菌的代谢调节与赖氨酸生产 E：表示反馈抑制；R：表示反馈阻遏,高丝氨酸脱氢酶（HSDH）,天冬氨酸激酶（AK),赖氨酸生产菌:,高丝氨酸缺陷型,6,分支途径赖氨酸发酵:,谷氨酸棒杆菌的Hom,7,分支途径,肌苷酸发酵（,IMP合成途径的代谢调控）,调控理论的实践应用,8,4.3.1.2,抗反馈控制突变株的应用,抗反馈控制突变株是指对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性，或两者兼有之的菌株。,抗反馈控制突变株可以从,终产物结构类似物抗性突变株,和,营养缺陷性回复突变株,中获得。,获得方法及其原理：,9,目标产物,结构类似物,赖氨酸,S-（2氨基乙基）-L半胱氨酸-(AEC),苏氨酸,-氨基-羟基戊酸（AHV),异亮氨酸,乙硫氨酸,精氨酸,D-精氨酸,苯丙氨酸,对氟苯丙氨酸,10,营养缺陷型回复突变株,调节酶的变构特性是由其结构基因决定的，如果调节酶的基因发生突变而失活，则有两种可能性：,一是催化亚基和调节亚基的基因均发生突变；,另一种可能仅仅是催化亚基发生突变。,一是催化亚基和调节亚基恢复到第一次突变前的活性水平。,如果前者发生回复突变，则又有两种可能性,另一种是催化亚基得以恢复，而调节亚基丧失了调节的功能。,营养缺陷型回复突变,11,4.3.1.3,选育组成型突变株和超产突变株,如果调节基因发生突变，以至产生无效的阻遏物而不能和操纵基因结合，或操纵基因突变，从而造成结构基因不受控制的转录，酶 的生成将不再需要诱导剂或不再被末端产物或分解代谢物阻遏，这样的突变株称为 组成型突变株。少数情况下，组成型突变株可产生大量的、比亲本高的多的酶，这种突变株称为超产突变株。,12,组成型突变株,结构基因不受控制地转录，酶的生成将不再需要诱导剂或不再被末端产物或分解代谢物阻遏。,调节基因发生突变,产生无效的阻遏物而不能与操纵基因结合,操纵基因突变,突变操纵基因不能与阻遏物结合,组成型突变,13,D,A B C,E F,4.3.2生物化学方法,1. 添加前体绕过反馈控制点：亦能使某种代谢产物大量产生,(-),(-),(-),2. 添加诱导剂：从提高诱导酶合成量来说，最好的诱导剂往往不是该酶的底物，而是底物的衍生物，,3. 发酵与分离过程耦合：,4. 控制发酵的培养基成分：,14,4.3.2控制细胞膜渗透性,使胞内的代谢产物迅速渗漏出去,解除末端产物的反馈抑制。,(1).,用生理学手段,直接抑制膜的合成或使膜受缺损,如,: 在,Glu,发酵中把生物素浓度控制在,亚适量,可大量分泌,Glu,；,控制生物素的含量可改变细胞膜的成分，进而改变膜透性；,当培养液中生物素含量较高时采用适量添加青霉素的方法；,再如：产氨短杆菌的核苷酸发酵中控制因素是,Mn,2+,； Mn,2+,的作用与生物素相似。,(2).,利用膜缺损突变株,油酸缺陷型、甘油缺陷型,如,:,用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型，培养过程中，有限制地添加油酸，合成有缺损的膜，使细胞膜发生渗漏而提高谷氨酸产量。,甘油缺陷型菌株的细胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸大量渗漏。应用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或油酸过量的情况下，也可以获得大量谷氨酸。,15,控制细胞膜的通透性,生物素是脂肪酸生物合成中乙酰CoA羧化酶的辅基，该酶催化乙酰CoA的羧化生成丙二酸单酰CoA，进而合成细胞膜磷脂的主要成分脂肪酸,只要控制生物素的含量就可以改变细胞膜的成分，进而改变膜的通透性，影响到代谢产物的分泌。,甘油缺陷型菌株,添加适量的青霉素,油酸缺陷型菌株,16,5、微生物次级代谢与次级代谢产物,5.1、次级代谢与次级代谢产物,一类与生物生存有关的、涉及到产能代谢和耗能代谢,的代谢类型，普遍存在于一切生物中。,初级代谢：,微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，,生成维持生命活动,所必需,的物质和能量的过程，称为初级代谢。,某些生物为了避免在初级代谢过程某种中间产物积累,所造成的不利作用而产生的一类有利于生存的代谢类,型。可以认为是某些生物在一定条件下通过突变获得,的一种适应生存的方式。,通过次级代谢合成的产物通常称为次级代谢产物，大,多是分子结构比较复杂的化合物。根据其作用，可将,其分为抗生素、激素、生物碱、毒素及维生素等类型。,次级代谢：,17,初级代谢与初级代谢的关系：,初级代谢系统、代谢途径和初级代谢产物在各类生物中基本相同。它是一类普遍存在于各类生物中的一种基本代谢类型。,(1)存在范围及产物类型不同,象病毒这类非细胞生物虽然不具备完整的初级代谢系统，但它们,仍具有部分的初级代谢系统和具有利用宿主代谢系统完成本身的,初级代谢过程的能力。,次级代谢只存在于某些生物（如植物和某些微生物）中，并且,代谢途径和代谢产物因生物不同而不同，就是同种生物也会由,于培养条件不同而产生不同的次级代谢产物。,18,例如某些青霉、芽孢杆菌和黑曲霉在一定的条件下可以分别合成,青霉素、杆菌肽和柠檬酸等次级代谢产物。,不同的微生物可产生不同的初级代谢产物,相同的微生物在不同条件下产生不同的初级代谢产物,用于青霉菌的二种培养基：,Raulin培养基：,葡萄糖5%、酒石酸0.27%、酒石酸铵0.27%、磷酸氢二铵0.04%,、硫酸镁0.027%硫酸铵0.017%、硫酸锌0.005%、硫酸亚铁0.005%,CzapekDox培养基：,葡萄糖5%、硝酸纳0.2%、磷酸氢二钾0.1%、氯化钾0.05%、硫酸,镁0.05%、硫酸亚铁0.001%,灰黄青素在CzapekDox培养基上培养时可以合成灰黄霉素，,在Raulin培养基上培养时则合成褐菌素（fulvic acid）；,Penicillium urticae,在含有0.510,-8,M的锌离子的CzapekDox培,养基里培养时合成的主要次级代谢产物是6-氨基水杨酸，但在含,0.510,-6,M的锌离子的CzapekDox培养基里培养时不合成6-氨,基水杨酸，但可以合成大量的龙胆醇、甲基醌醇和棒曲霉素。,产黄青霉在在Raulin中培养时可以合成青霉酸。但在Czapek,Dox中培养则不产青霉酸。,次级代谢产物虽然也是从少数几种初级代谢过程中产生的中间体,或代谢产物衍生而来，但它的骨架碳原子的数量和排列上的微小,变化，如氧、氮、氯、硫等元素的加入，或在产物氧化水平上的,微小变化都可以导致产生各种各样的次级代谢产物，并且每种类,型的次级代谢产物往往是一群化学结构非常相似的不同成分的混,合物。例如，目前已知的新霉素有4种，杆菌肽、多粘菌素分别有,有10多种，而放线菌素有20多种等。,19,初级代谢与初级代谢的关系：,1、存在范围及产物类型不同,2、对产生者自身的重要性不同,初级代谢产物，如单糖或单糖衍生物、核苷酸、脂肪酸等单体,以及由它们组成的各种大分子聚合物，蛋白质、核酸、多糖、,脂类等通常都是机体生存必不可少的物质，只要在这些物质的,合成过程的某个环节上发生障碍，轻则引起生长停止、重则导,致机体发生突变或死亡。,次级代谢产物对于产生者本身来说，不是机体生存所必需的物质,，即使在次级代谢的某个环节上发生障碍。不会导致机体生长的,停止或死亡，至多只是影响机体合成某种次级代谢产物的能力。,次级代谢产物一般对产生者自身的生命活动无明确功能，不是机,体生长与繁殖所必需的物质，也有人把超出生理需求的过量初级,代谢产物也看作是次级代谢产物。,次级代谢产物通常都分泌到胞外，有些与机体的分化有一定的关,系，并在同其它生物的生存竞争中起着重要的作用。,许多次级代谢产物通常对人类和国民经济的发展有重大影响。,20,初级代谢与初级代谢的关系：,(1)、存在范围及产物类型不同,(2)、对产生者自身的重要性不同,(3)、同微生物生长过程的关系明显不同,初级代谢自始至终存在于一切生活的机体中，同机体的生长,过程呈平行关系；,次级代谢则是在机体生长的一定时期内（通常是微生物的对数生,长期末期或稳定期）产生的，它与机体的生长不呈平行关系，一,般可明显地表现为机体的生长期和次级代谢产物形成期二个不同,的时期。,21,初级代谢与初级代谢的关系：,(1)、存在范围及产物类型不同,(2)、对产生者自身的重要性不同,(3)、同微生物生长过程的关系明显不同,(4)、对环境条件变化的敏感性或遗传稳定性上明显不同,初级代谢产物对环境条件的变化敏感性小（即遗传稳定性大），,而次级代谢产物对环境条件变化很敏感，其产物的合成往往因环,境条件变化而停止。,22,初级代谢与初级代谢的关系：,1、存在范围及产物类型不同,2、对产生者自身的重要性不同,3、同微生物生长过程的关系明显不同,4、对环境条件变化的敏感性或遗传稳定性上明显不同,(5)、相关酶的专一性不同,相对来说催化初级代谢产物合成的酶专一性强，催化次级代谢,产物合成的某些酶专一性不强，因此在某种次级代谢产物合成,的培养基中加入不同的前体物时，往往可以导致机体合成不同,类型的次级代谢产物，,另外，催化次级代谢产物合成的酶往往是一些诱导酶，它们是,在产生菌对数生长末期或稳定生长期里，由于某种中间代谢产,物积累而诱导机体合成的一种能催化次级代谢产物合成的酶，,这些酶通常因环境条件变化而不能合成。,23,初级代谢与初级代谢的关系：,(1)、存在范围及产物类型不同,(2)、对产生者自身的重要性不同,(3)、同微生物生长过程的关系明显不同,(4)、对环境条件变化的敏感性或遗传稳定性上明显不同,(5)、相关酶的专一性不同,(6)某些机体内存在的二种既有联系又有区别的代谢类型,初级代谢是次级代谢的基础，它可以为次级代谢产物合成提供,前体物和所需要的能量；,初级代谢产物合成中的关键性中间体也是次级代谢产物合成中,的重要中间体物质。,而次级代谢则是初级代谢在特定条件下的继续与发展，避免初,级代谢过程中某种（或某些）中间体或产物过量积累对机体产,生的毒害作用。,24,25,二、 次级代谢的调节,1、初级代谢对次级代谢的调节,2、碳、氮代谢物的调节,3、诱导作用及产物的反馈抑制,青霉素合成受赖氨酸抑制，共同前体：,NH,4,+,浓度高降低谷氨酰胺酶活性，对抗生素的生产不利,硝酸盐促进利福霉素的合成,快速利用碳源,26,