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,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第八章,微生物的遗传变异,遗传（,heredity,）:,上一代生物将自身的一整套遗传基因稳定地传递给下一代的特性,。,变异（,variation）,：,生物体在某种外因或内因的作用下，发生遗传物质结构或数量的改变，而且这种改变稳定，具有可遗传性,。,遗传与变异,遗传保证了微生物种的相对稳定性、种的存在和延续，,而变异则推动了种的进化和发展。,遗传型和表型,遗传型（,genotype）,表型(,phenotype ),某一生物体个体所含有的全部遗传因子，即基因的总和,，,又称为基因型。,某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和,。,表型的实现是由生物体的,遗传型,和,环境条件,共同作用的结果。,第一节 遗传变异基础理论,一、遗传变异的物质基础,二、基因突变,三、基因重组,（,1,）经典转化实验:,证明,DNA,是遗传变异的物质基础。,Avery,在四十年代以更精密的实验设计重复了以上实验,分别用,S,型菌中提取的,DNA、RNA,和,蛋白质转化,R,型菌,且,DNA,被酶降解破坏的抽提物无转化活性,DNA,是转化所必需的转化因子,1,、三个经典实验,一、遗传变异的物质基础,T2,噬菌体感染实验,（,2,） 噬菌体感染实验（,1952年，,A.D.Hershey,和,M.Chase,）,（,3,）植物病毒重建实验,证明杂种病毒的蛋白质,外壳来自,TMV,还是,HRV,可用,血清学反应鉴定,证明核酸（,RNA）,是遗传的物质基础,血清学反应说明病毒蛋,白质的特性由核酸而定,H.,Fraenkel-Conrat,(,1956年),病斑的特性和,病毒核酸一致,2.,遗传物质在细胞内存在的部位和方式,（,1,）七个水平,细胞水平,（单核，多核）,细胞核水平,（真核，拟核）,染色体水平,核酸水平,（,DNA，,部分病毒为,RNA；,双链，少数病毒为单链）,基因水平,（遗传功能单位）,密码子水平,（遗传信息单位）,核苷酸水平,（最低突变单位和交换单位）,（一套，两套,核外染色体）,（,2,）质粒,二、基因突变,突变指细胞内遗传物质的分子结构或数量发生变化的现象。包括基因突变（又称点突变）和染色体畸变。,基因突变,（,gene mutation,）,:,是指一个基因内部遗传结构或,DNA,序列的任何改变，涉及一对或少数几对碱基的置换、缺失或插入，因其发生的范围很小，所以又称点突变（,point mutation,）。,染色体畸变,（,chromosomal aberration,）,:,是指染色体较大范围内结构的变化，如缺失、重复、倒位、易位等以及染色体数目的变化。,1.,基因突变的类型,同种碱基的置换,不同种碱基的置换,只涉及,1对碱基,被另1对碱基所置换,1个或少数几个碱基对的插入或缺失，使该部位后面遗传密码的阅读框架发生改变，并进一步引起转录和转译错误的突变。,遗传物质在染色体水平发生较大范围的变化,DNA,分子中1对或少数几对碱基的突变,按照突变所引起的遗传信息的改变情况可分为三种：,同义突变,表型不发生改变,错义突变,改变的密码子编码的氨基酸改变了；,无意义突变,终止密码子,（UAA, UAG, UGA）,营养缺陷型,抗性突变型,条件致死突变型,形态突变型,抗原突变型,产量突变型,2.,基因突变的表型,选择性突变株,（能在选择性培养基上或其它的,选择性条件下迅速选出或鉴别出）,非选择性突变株,（1）营养缺陷型（,auxotroph）,一种缺乏合成其生存所必须的营养物（包括氨基酸、维生素,、碱基等）的突变型，只有从周围环境或培养基中获得这些,营养或其前体物（,precursor）,才能生长。,营养缺陷型是微生物遗传学研究中重要的选择标记和,育种的重要手段,表型判断的标准：,在,基本培养基,上能否生长,特点：,在选择培养基（一般为基本培养基）上不生长,负选择标记,突变株不能通过选择平板直接获得,（2）抗药性突变型（,resistant mutant）,基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性。,特点：,正选择标记,（突变株可直接从抗性平板上获得-,在加有相应抗生素的,平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。,）,表示方法：,所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“,r”,表示,str,r,和,str,s,分别表示对链霉素的抗性和敏感性,（3）条件致死突变型（,conditional lethal mutant）203,在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死,效应的突变型。,常用的条件致死突变是,温度敏感突变,，用,ts（temperaturesensitive,）,表示，这类突变在高温下（如42）是致死的，但可以在低温（如,25-30）下得到这种突变。,特点：,负选择标记,这类突变型常被用来分离生长繁殖必需的突变基因,（4）形态突变型（,morphological mutant）,造成形态改变的突变型,特点：,非选择性突变,突变株和野生型菌株均可生长，但可从形态特征上进行区分。,举例：,产蛋白酶缺陷突变株的筛选,菌落颜色变化,半乳糖苷酶基因的插入失活，使重组子菌落为白色而,与兰色的非重组子分开。,形成芽孢缺陷菌株,（5）抗原突变型,指由于基因突变引起的细胞抗原结构发生的变异类型，包括细胞壁缺陷变异、荚膜或鞭毛成分变异等。,（6）产量突变型,通过基因突变而引起的目标代谢产物的产量发生变化的变异菌株，其在产量上高于或低于原始出发菌株。如果产量提高的突变株，被称为,“正突变”,（,plus-mutant），,也称为“高产突变株”(,high producing mutant)；,如果产量低于出发菌株的突变株，则称为,“负突变”,（,minus-mutant）。,3.,基因突变的特点,自发性,菌种衰退的根本原因,不对应性,突变的性状与突变的原因无关系,稀有性,自发突变几率低（10,-6,10,-10,）,突变率：,每一个细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。,（某一单位群体在每一世代中产生突变株的数目）,独立性,某基因的突变率不受它种基因突变率的影响,可诱变性,自发突变的频率可因诱变剂的影响而提高（10,-3,10,-6,）,稳定性,基因突变后的新性状是稳定的,可逆性,野生型菌株某一性状可发生正向突变，也可发生反向的回复突变。,证明突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系！,如何证明基因突变的非对应性？,三个经典实验,:,1.,变量实验、,2.,涂布实验、,3.,影印实验,基因突变自发性和不对应性的实验证明,1）变量实验（,fluctuation analysis）,Salvador Luria & Max Delbruck(1943),对噬菌体,T1,敏感的,E.coli,对数期培养物，稀释至10,3,/,mL,分装两试管，各10,mL,与甲管分装的各小管同时保温2436,h,甲管,乙管,2）Newcombe,的涂布实验（1949）,在涂布过的一组中，共长出抗性菌落353个，比未经涂布过的（28个菌落）高得多,约繁殖了12.3代,选用对,T1,噬菌体敏感的,E.coli,，,以相等数目涂布于12个平板上,3）影印实验（,replica plating ）,Joshua Lederberg and Esther Lederberg（1952）,通过使菌不接触抗性环境而检查其抗性菌落的方法,基因重组,（,gene recombination）：,将两个不同性状个体的基因通过一定的方式转移到一起，并发生重新组合，产生新的遗传性状的过程，称为基因重组,(,gene recombination),或遗传重组。,重组,：,遗传物质在,分子水平,上发生的交换；,杂交,：,在,细胞水平,上遗传物质的交换,.,杂交必然包含着重组，但重组不仅限于杂交这一形式。,三、基因重组,（一）原核生物的基因重组类型,4种形式：,1）转化,2）转导,3）接合,4）原生质体融合,1,、,转化（,transformation）,定义,：,受体细胞直接吸收供体细胞的,DNA,片段, 并与其染色体同源片段进行遗传物质交换，从而使受体细胞获得新的遗传性状的现象。,转化子（,transformant,）,：,经转化后出现了供体性状的受体细胞称为,转化子,，,即转化成功的菌落。,目前已知有二十多个种的,G,+,和,G,-,细菌具有自然转化的能力,此过程可以发生在土壤和海洋环境中，可能是自然界遗传交换的重要方式。,自然遗传转化（,natural genetic transformation）,人工转化（,artificial transformation）,感受态细胞,（,competent cell）,：,具有摄取外源,DNA,能力的细胞,1.,感受态,感受态：是指受体细胞最易接受外源,DNA,片段并能实现转化的一种生理状态。一个细菌能否出现感受态是由其遗传性决定的，但受环境条件的影响也很大，因而表现差别很大。,感受态因子：,调节感受态的一类特异蛋白，它包括三种主要成分：膜相关,DNA,结合蛋白、细胞壁自溶素和几种核酸酶。,自然感受态与人工感受态的不同？,自然感受态,的出现是细胞一定生长阶段的生理特性,（如肺炎链球菌的感受态出现在对数生长期）,受细菌自身的基因控制,人工感受态,则是通过人为诱导的方法，使细胞具有,摄取,DNA,的能力，或人为地将,DNA,导入细胞内。,（,该过程与细菌自身的遗传控制无关！,）,进行自然转化，需要二方面必要的条件：,（,1,）建立了,感受态的受体细胞,（,2,）外源游离,DNA,分子,(2),转化过程,供体,(,str,R,),ds,DNA,感受态受体,(,str,S,),酶解与吸收单链,同源区段配对,单链整合,复制与分离,转化子,(,str,R,),非转化子,(,str,S,),肺炎链球菌转化的主要过程,转化因子进入细胞,转化因子单链配对与整合,复制,分离,2,、转导（,transduction）,转导：,利用完全或部分缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞的小片段,DNA,携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。,由转导作用而获得供体细胞部分遗传性状的重组受体,细胞称为,转导子 （,transductant,）,携带供体部分遗传物质（,DNA,片段）的噬菌体称为,转导噬菌体。,细菌转导的二种类型：,普遍性转导,局限性转导,（,1,）普遍性转导（,generalized transduction）,通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段,DNA,进行误包，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，称普遍性转导。,意外的发现,1951年，,Joshua Lederberg,和,Norton,Zinder,为了证实大肠杆菌以外,的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型,的鼠伤寒沙门氏菌,LT22A(trp,-,)（P22）,和,LT2(his,-,),进行实验：,用,“,U,”,型管进行同样的实验时，在供体和受体细胞不接触的情况下，同样出现原养型细菌！,沙门氏菌,LT22A(trp,-,),是携带,P22,噬菌体的溶源性细菌,另,一株,LT2(his,-,),是非溶源性细菌,一个表面看起来的常规研究却导致,一个惊奇和十分重要发现的重要例证！,基因的传递很可能是由可透过“,U”,型管滤板的,P22,噬菌体介导的(,在接种,LT22A,的一端出现了原养型,),（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）,转导模型,转导噬菌体为什么,“,错,”,将宿主的,DNA,包裹进去?,噬菌体的,DNA,包装酶,也能识别染色体,DNA,上类似,pac,的位点,并进行切割，以,“,headful,”,的包装机制包装进,P22,噬菌体外壳，,形成只含宿主,DNA,的转导噬菌体颗粒,（假噬菌体）,。,因为染色体上的,pac,与,P22 DNA,的,pac,序列不完全相同，,利用效率较低，这种,“,错装,”,机率一般仅约10,-6,-10,-8,形成转导颗粒的噬菌体可以是温和的，也可以是烈性的，但必须具有能偶尔识别宿主,DNA,的包装机制，并在宿主基因组完全降解以前进行包装。,普遍性转导的基本要求：,普遍性转导的三种后果：,进入受体的外源,DNA,通过与细胞染色体,的重组交换而形成稳定的转导子,流产转导（,abortive transduction）,转导,DNA,不能进行重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。,特点：在选择培养基平板上形成微小菌落,外源,DNA,被降解，转导失败。,如果受体菌通过普遍转导获得了供体菌,DNA,片段后，在其体内不发生基因的交换、整合和复制，只进行转录、翻译和性状的表达。这种转导被称为流产转导,.,（,2,） 局限转导（,restricted transduction,）,定义：,通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数,特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因,组整合、重组，形成转导子的现象。,媒介：,部分缺陷噬菌体,（丢失自身一部分基因，并被,同等长度的宿主基因所取代）,只能转导个别特定基因,大肠杆菌中,噬菌体的正常裂解及半乳糖基因转导噬菌体的形成过程,低频转导（,LFT）,的定义,:,诱导溶源性大肠杆菌而产生的细胞裂解产物中，除含有正常的噬菌体外，还有少数（10,-6,）转导噬菌体颗粒，因此，用诱导,溶源性菌株得来的噬菌体进行转导时的转导频率不过,10,-6,，,称为低频转导,。,高频转导,(HFT):,如果细菌染色体中整合有一个正常的,噬菌体时，,缺陷,噬菌体也能整合到同一细菌染色体上,（因为正常,噬菌体整合后，产生两个细菌/噬菌体杂合,att,位点，缺陷,噬菌体可以在该位点插入），这种细菌称为双重溶源菌,.,双重溶源菌中，正常,噬菌体称为,辅助噬菌体,，因为它帮助缺陷噬菌体整合和繁殖。,双重溶原菌,在紫外辐射等因子的诱导下,原噬菌体容易被切割下来，,产生等量的缺陷噬菌体和正常噬菌体，该裂解物称为高频率转导裂解物,，用这样的裂解物去感染细菌，将比低频率转导裂解物产生多得多的转导子。这一过程称为高频转导。,3,、,接合 (,conjugation),通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程,（,1,）接合现象的发现和证实,1946年，,Joshua Lederberg,和,Edward,L.Taturm,细菌的多重营养缺陷型杂交实验,中间平板上长出的原养型菌落,是两菌株之间发生了遗传交换,和重组所致！,为了减少所培养的结果是回复突变的机会，采用了双重或三重营养缺陷型。该实验是建立在不大可能同时发生两种或三种回复突变的设想上的。,（,2,）能进行接合的微生物种类,主要在细菌和放线菌中存在。,在细菌中，,G,细菌尤为普遍，如,E. coli,、,沙门氏菌属、志贺氏菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、弧菌属、固氮菌属和假单胞菌属等；,放线菌中，以链霉菌属和诺卡氏菌属最为常见，其中研究得最为详细的是天蓝色链霉菌（,Streptomyces,coeilcolor,）。,在不同属的一些菌种之间也可发生接合现象，如大肠杆菌与鼠伤寒沙门氏菌间或沙门氏菌与痢疾志贺氏菌间。,在所有对象中，接合现象研究得最多、了解得最清楚的是,E. coli,。,E. coli,是有性别分化的，决定性别的是其中的,F,质粒，,F,质粒还是合成性菌毛基因的载体。,（）大肠杆菌的接合型与接合,细菌遗传重组单向过程和,F,因子的提出,F,菌株,F,菌株,Hfr,菌株,F,因子结构图,:,相对分子质量通常为510,7,，上面有编码细菌产生性菌毛及控制接合过程进行的20多个基因。,图中黄色区域表示转座子，通过这些部位可以整合进细菌染色体上形成各种,Hfr,菌株。,Hfr,菌株,:,细胞中的,F,质粒整合到核染色体组上,与,F,菌株相接合后，发生基因重组的频率比任何已知的,F,与,F,接合后的频率高出几百倍，这种“雄性”菌株称为,Hfr,。,在,Hfr,菌株与,F,-,细胞进行接合时,OriT,序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，,F,因子的先导区(,leading region),结合着染色体,DNA,向受体细胞转移，,F,因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此,F,因子不易转入受体细胞中，故,HfrF,-,杂交后的受体细胞大多数仍然是,F,-,（,即不能使受体菌变成供体）。,接合中,DNA,转移过程有着稳定的速度和严格的顺序性 。,染色体上越靠近,F,因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在,F,-,中出现重组子的的时间就越早，频率也高。,（二）真核生物的基因重组,.,有性杂交,2.,准性杂交,第二节 育种技术,一、菌种的自然选育,二、诱变育种,三、原生质体融合,四、基因工程育种,一、菌种的自然选育,利用自发突变进行的育种工作,1. 从生产中选育,2. 定向培育优良品种,一般指用特定因素长期处理微生物群体，同时不断地对它们进行移种传代，以达到积累并选择相应的自发突变株的目的。,例：卡介苗（牛型结核分枝杆菌的减毒活菌苗）,特点：选育时间长，工作量大，无方向性,二、诱变育种,诱变育种的基本环节,诱变育种中的几个原则,指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变率显著提高，然后设法从中选取少数符合育种目的的突变株。,2个主要环节：,诱变（随机）,选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀、分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中的突变频率大大提高。,筛选（定向）,设计有效的筛选方法，将少量正变株中的优良菌株挑选出来。,1.,出发菌株（,original strain）,出发菌株,指用于诱变育种的起始菌株。,具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、,标记明显等）；,对诱变剂敏感,野生型菌株；,从生产中选育的自发突变菌株；,诱变获得的高产菌株,出发菌株的选择标准：,出发菌株的来源：,2.,菌悬液的制备,(1),选用单细胞或单孢子悬液,（均匀、分散）,目的：,使每个细胞能均匀接触诱变剂；,减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退化现象）,(2),同步培养,（生理状态一致）,(3),菌龄：对诱变剂最敏感时期,营养细胞：对数期,孢子或芽孢：萌发前期,(4),菌悬液的制备方法,物理诱变：生理盐水配制,化学诱变：缓冲液配制,(5),菌悬液的浓度,酵母菌，霉菌的孢子：10,6,个/,mL,细菌，放线菌孢子：,10,8,个/,mL,3.,诱变剂的选择及处理方法,(1),诱变剂的选择（,高效，简便,）,物理诱变剂：,频度低、大损伤，难修复，且操作简便；,化学诱变剂：,频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。,(,NTG,超诱变剂）,UV,是最常用的一种诱变剂,(2),剂量的选择,突变率随剂量的增加而提高，但到达一定程度后，再提高剂量,反而会使突变率下降。,正变较多出现在偏低剂量中，而负变较多出现在偏高剂量中。,在产量变异工作中，常采用相对杀菌率为7075%,甚至3070%的剂量,。,UV,的剂量,:,固定,UV,功率和照射距离,以照射时间长短来确定剂量多少。,最适剂量：,在提高突变率的基础上，既能扩大变异幅度，,又能使变异向正突变范围移动的剂量。,常以杀菌率来表示相对剂量（剂量-存活率曲线）,(3),诱变处理方法,单因素处理或多因素的复合处理：,同一诱变剂的重复使用；,两种或多种诱变剂的先后使用；,两种或多种诱变剂的同时使用,.,4.,中间培养（,CM，,培养过夜）,目的：,克服表型延迟,表型延迟,（,phenotypic lag）：,表型的改变落后于基因型改变的,现象,.,分离性延迟：,突变的基因经,DNA,复制和细胞分裂后变成纯,合状态，表型才能表现出来,。,生理性延迟：,由杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能,表现出来。,分离性延迟的原因,:,对数生长期中，单核细胞常出现双核现象，多核细胞的核也成倍增加，诱变对数期的细胞时，突变通常发生在一个核上，故其变异或非变异的细胞必须经过一代或几代繁殖才能分离，这种纯种变异细胞出现的推迟现象称为分离延迟现象。,生理性延迟的原因,:,当变异细胞由杂合状态变为纯合状态时,由于杂合期所合成的非变异的蛋白或酶仍然发挥作用,必须经过细胞多代分离后,才能将这些非变异的酶稀释掉,最终达到变异后应该表现的形态,如营养缺陷型突变株的筛选过程。,生理性延迟,:,5.,突变株的筛选,初筛,复筛,(1),初筛（以量为主）,（,a,）利用形态变异：,需预先测定形态与产量的相关性,（,b,）根据平板颜色反应直接挑选,透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）；,抑菌圈法（抗生素）；,变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）；,沉淀圈法（外毒素）,透明圈直径（,H）/,菌落直径（,C）：,产量高低（初筛指标）,2. 复筛（以质为主，定量测定）,摇瓶培养，直接检测所需产物,方法需简便、快速,2步,三、原生质体融合,1.定义：,通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生,质体进行融合，以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组,子的过程。,融合子,意义：,打破了微生物的种界界限，可实现远缘菌株的基因重组。,可使遗传物质传递更为完整、获得更多基因重组的机会。,可与其他育种方法相结合，如把常规诱变和原生质体诱变所获得,的优良性状，组合到一个单株中。,两亲本菌株的选择和遗传标记的制作,（选择不同的营养缺陷型，,（,A: a,+,b,-, B:a,-,b,+,）,对药物抗性差异）,原生质体的制备,（高渗条件）,原生质体再生（测定再生率）,融合,（,PEG、,离心沉淀、电脉冲等）,融合子的检出,（直接检出法和间接检出法）,实用性菌株的筛选,2. 操作过程：,四、基因工程育种,基因工程的操作过程主要由以下步骤组成：载体和目的基因的分离；载体和目的基因的切断；载体和目的基因的重组；重组,DNA,的转化和扩增；重组,DNA,的筛选和鉴定。,要求：受体细胞遗传背景清楚,优点：可实现微生物的定向改造,性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。,影响微生物菌种稳定性的因素：,a）,变异；,b）,污染；,c）,死亡,.,第三节 菌种的衰退、复壮和保藏,一、菌种的衰退,1. 衰退的表现,1）原有形态形状变得不典型；,2）,生长速度变慢；,3）代谢产物生产能力下降；,4）致病菌对宿主侵袭力下降；,5）对外界不良环境的抵抗力下降。,2. 衰退的原因,1）,根本原因在于基因自发突变,；,2）传代次数的影响，使负突变株的比例逐渐占,了优势；,3）与培养条件有关。,衰退是发生在微生物细胞群体中的一个由量变到质变的逐步演变的过程。,二、衰退的防止与复壮,（一）防止衰退的措施,1,. 减少传代次数；,2. 创造良好的培养条件；,3. 利用不易衰退的细胞传代,4. 采用有效的菌种保藏方法；,（二）菌种的复壮,（,rejuvenation）,1.,从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有,原有典型性状的菌种,(狭义复壮，消极措施),。,2. 有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种,维护工作中不断筛选“正变”个体,(广义复壮，积极措施),。,a）,纯种分离,;,b）,通过寄主体进行复壮；,纯种的分离方法,平板划线分离法,菌落纯,平板涂布分离法,平板倾注分离法,用“分离小室”进行单细胞分离,细胞纯,显微操纵器进行单细胞分离,菌丝尖端切割法进行单细胞分离,三、菌种保藏,在一定时间内使菌种不死、不变、不乱,基本要求：,基本方法：,生活态,休眠态,培养基传代培养,寄主传代培养,冷冻,干燥,斜面、平板,液氮、低温冰箱,沙土管、冷冻真空干燥,1. 原理,人为地创造有利于微生物长期休眠的条件，主要是,低温、干燥、缺氧,。,2. 保藏方法,7种常用方法,（1）斜面冰箱保藏法,（2）半固体冰箱保藏法,（3）石蜡油封藏法,（4）甘油悬液保藏法,（5）沙土管保藏法,（6）冷冻干燥保藏法,（7）液氮保藏法,由于微生物的多样性，,不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜,。,因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。,
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