细胞培养技术---课件

,单击此处编辑母版标题样式,PPT课件,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,*,细胞培养技术,1,PPT课件,细胞培养技术1PPT课件,一、细胞培养概念,从机体内取出组织或细胞，在体外模拟体内的生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下进行孵育培养，使之生存、生长，并维持其结构和功能的方法。,2,PPT课件,一、细胞培养概念从机体内取出组织或细胞，在体外模拟体内的生理,细胞培养特点,1,、条件可控：研究影响因素,2,、体外： 可用各种手段研究,3,、长期： 遗传性状,4,、大量提供条件相同的细胞,3,PPT课件,细胞培养特点3PPT课件,细胞培养目的和作用,1,、科学研究,药物研究与开发,新药筛选：如化学合成药物药效研究,中药有效成分筛选与鉴定等。,疫苗研究与开发：如病毒性疫苗的研究与开发,(,肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等,),肿瘤疫苗,(,多肽疫苗,),等。,基因工程药物研究与开发：如干扰素研究与开发,细胞生长因子研究与开发等。,细胞工程药物研究与开发：生物活性多肽研究与开发,人参皂甙,紫杉醇等生物活性成分研究与开发。,单克隆抗体制备：包括诊断用单克隆抗体,治疗用单克隆抗体。,4,PPT课件,细胞培养目的和作用1、科学研究4PPT课件,细胞培养目的和作用,基础研究,(1),药物作用机理；,(2),基因功能；,(3),疾病发生机理。,2,、生物制药,疫苗生产：如病毒性疫苗,(,肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等,),肿瘤疫苗,(,多肽疫苗,),等。,基因工程药物生产：如在临床医学中具有治疗价值的一些细胞生长因子如干扰素,粒细胞生长因子,胸腺肽等。,诊断用和药用单克隆抗体生产。,细胞工程药物生产：生物细胞内的一些生物活性多肽,生物活性物质等。,5,PPT课件,细胞培养目的和作用基础研究 5PPT课件,二、培养细胞相关条件,（一）,实验室准备,1.,无菌操作实验室,无菌操作间、缓冲间、更衣室等。,2.,生物安全柜（超净工作台）,生物安全柜是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的。,6,PPT课件,二、培养细胞相关条件（一） 实验室准备6PPT课件,二、培养细胞相关条件,生物安全柜分类,一级：可保护工作人员和环境而不保护样品，目前已很少用。,二级：提供工作人员、环境和产品的保护。,A,（,A1,和,A2,）,B,（,B1,和,B2,）,三级：生物安全,3,、,4,级实验室用。,7,PPT课件,二、培养细胞相关条件 生物安全柜分类7PPT课件,生物安全柜,ESCO AC2-4S1,8,PPT课件,生物安全柜ESCO AC2-4S18PPT课件,生物安全柜,9,PPT课件,生物安全柜9PPT课件,三级生物安全柜,10,PPT课件,三级生物安全柜10PPT课件,3.,相关仪器设备,（,1,）,CO,2,培养箱,（,2,）倒置显微镜、普通显微镜及照相系统,（,3,）冰箱（,4,度，,-20,度，,-80,度）,（,4,）超纯水系统（电阻率,18.2M.cm,）,（,5,）细胞存储器（液氮罐，深低温冰箱、,-80,度冰箱）,（,6,）高温高压灭菌装置、清洗装置,（,7,）滤菌相关仪器（针式滤器，泵加压过滤）,（,8,）离心机、天平、,pH,仪、移液枪等,二、培养细胞相关条件,11,PPT课件,3.相关仪器设备二、培养细胞相关条件11PPT课件,（二）培养用品,（,1,）培养瓶（,25,、,75 cm,3,）,培养板（,96,、,48,、,24,、,12,、,6,孔）,培养皿（各种直径规格）,二、培养细胞相关条件,12,PPT课件,（二）培养用品二、培养细胞相关条件12PPT课件,（二）培养用品,（,2,）离心管（,15,、,50 ml,）,（,3,）移液管、吸管,（,4,）冻存管、,EP,管,（,5,）试剂瓶等。,二、培养细胞相关条件,13,PPT课件,（二）培养用品二、培养细胞相关条件13PPT课件,（三）细胞培养用试剂,（,1,）培养基,MEM,，,DMEM,，,RPMI1640,4,保存，避免光照；用前放在,37,温热。,二、培养细胞相关条件,14,PPT课件,（三）细胞培养用试剂二、培养细胞相关条件14PPT课件,（三）细胞培养用试剂,（,1,）培养基,水,无机盐,氨基酸,维生素,其他成分,葡萄糖、酚红、,HEPES,、丙酮酸钠,二、培养细胞相关条件,15,PPT课件,（三）细胞培养用试剂二、培养细胞相关条件15PPT课件,16,PPT课件,16PPT课件,17,PPT课件,17PPT课件,（三）细胞培养用试剂,（,1,）培养基,培养基选择：按提供细胞来源的要求准备。,什么情况下选择无酚红培养基：,酚红影响到实验结果,流式细胞仪检测细胞样品,二、培养细胞相关条件,18,PPT课件,（三）细胞培养用试剂二、培养细胞相关条件18PPT课件,（三）细胞培养用试剂,（,2,）血清,二、培养细胞相关条件,19,PPT课件,（三）细胞培养用试剂二、培养细胞相关条件19PPT课件,20,PPT课件,20PPT课件,血清分类,1,、特级胎牛血清（最高级别的） （,1,）,Hyclone,北美特级胎牛血清,（,SH30070.03,） （,2,）,Gibco,北美特级胎牛血清,（,16000-044,）,2,、优等级胎牛血清（,1,）,Hyclone,加拿大优等胎牛血清,（,SH30396,）,（,2,）,Hyclone,澳大利亚优等胎牛血清,（,SH30084,）（,3,）,Gibco,澳大利亚胎牛血清,（,10099-141,）,二、培养细胞相关条件,21,PPT课件,血清分类二、培养细胞相关条件21PPT课件,血清分类,3,、普通进口胎牛血清,如,Hyclone,南美胎牛血清,（,SV30087,）,4,、国产的各种系列胎牛血清 国产的胎牛血清，国内没有严格意义的胎牛血清，胎牛血清本身是需要穿刺取血的，而国内都是剖腹产出胎牛，,8,小时左右取血，然后，进行过滤分装。,5,、其他血清 新生牛血清，小牛血清，一般国产的。,二、培养细胞相关条件,22,PPT课件,血清分类二、培养细胞相关条件22PPT课件,（三）细胞培养用试剂,（,2,）血清,使用：,5,20%,。,保存：,20,-70,储存；,4,存放勿超过一个月。,解冻步骤：,-20,或,70,至,4,冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装或使用。,二、培养细胞相关条件,23,PPT课件,（三）细胞培养用试剂二、培养细胞相关条件23PPT课件,（三）细胞培养用试剂,血清解冻后发现有絮状物出现，该如何处理,?,原因：脂蛋白的变性；,血纤维蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解冻后，也会存在于血清中，也是造成絮状物的主要原因之一。这些絮状物的产生不会影响血清本身的质量。,去除方法：可以将血清分装至无菌离心管内，以,400g,稍微离心，将上清液加入培养基内一起过滤。我们不建议您直接过滤血清以去除这些絮状物，因为它可能会阻塞过滤膜。,二、培养细胞相关条件,24,PPT课件,（三）细胞培养用试剂二、培养细胞相关条件24PPT课件,（三）细胞培养用试剂,血清热灭活：,56, 30,分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。目的：使血清中补体成份失活。,启动的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，启动淋巴细胞和巨噬细胞活化。在免疫学研究、培养,ES,细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。,除非必须，一般不建议作此热处理。,二、培养细胞相关条件,25,PPT课件,（三）细胞培养用试剂二、培养细胞相关条件25PPT课件,（二）细胞培养用试剂,（,3,）缓冲液,Hanks,、,PBS,4,保存，避免光照；用前放在,37,温热。,二、培养细胞相关条件,26,PPT课件,（二）细胞培养用试剂二、培养细胞相关条件26PPT课件,（,4,）抗生素,工作浓度,储存温度,杀灭细菌,penicillin 100 units/ml -20,G(+) bacteria streptomycin 100 ug/ml -20,G(+) and G(-) bacteria chlotetracycline 50 ug/ml -20,G(+) and G(-) bacteria gentamicin 50 ug/ml -20,G(+) and G(-) bacteria,mycoplasma,amphotericin B 2.5 ug/ml -20,yeast and molds nystatin 50 ug/ml -20,yeast and molds fungizone 2.5ug/ml -20,yeast and molds,二、培养细胞相关条件,27,PPT课件,（4）抗生素二、培养细胞相关条件27PPT课件,（,5,）添加因子,生长因子（,EGF,、,FGF,、,BFGF,）、胰岛素、肝素、二巯基乙醇等,（,6,）消化液,胰酶（,0.25%,、,0.125%,）、,EDTA,（,0.02%,）,消化效果与浓度、温度、时间、,pH,值等相关,二、培养细胞相关条件,28,PPT课件,（5）添加因子二、培养细胞相关条件28PPT课件,（三）细胞培养用试剂,（,7,）其他,谷氨酰胺： 终浓度,2 mmol/L,HEPES,：,10-25 mmol/L,丙酮酸钠： 终浓度,1 mmol/L,2-,巯基乙醇：终浓度,50 uM,1.,细胞培养介绍,.flv,二、培养细胞相关条件,29,PPT课件,（三）细胞培养用试剂二、培养细胞相关条件29PPT课件,（一）基本操作,1.,无菌操作,防止微生物污染；,培养用一切物品、液体都无菌。,（,37,度预热，或室温平衡）,2.,操作区消毒,75%,酒精擦拭（生物安全柜，进入操作区物品）,紫外消毒,20-30 min,3.,洗手和着装,4.,实验操作,动作稳、准，幅度小；,物品摆放合理，工作有序，缩短暴露时间。,2.,灭菌消毒,.flv,三、培养细胞技术,30,PPT课件,（一）基本操作三、培养细胞技术30PPT课件,（二）细胞来源,1.,原代培养,从机体上取下细胞、组织或器官，让它们在体外维持与生长。（实际中，传,10,代以内的细胞用作原代培养细胞）,特点：表现来源组织或细胞特征。,三、培养细胞技术,31,PPT课件,（二）细胞来源三、培养细胞技术31PPT课件,（二）细胞来源,（,1,）,组织块培养法,从机体上取下组织，使其在体外维持与生长，细胞从组织块边缘向外长出，铺满培养瓶（皿），即可进行传代。,特点：表现来源组织或细胞特征。,三、培养细胞技术,32,PPT课件,（二）细胞来源三、培养细胞技术32PPT课件,（二）细胞来源,（,1,）,组织块培养法,基本过程：,无菌条件下，取组织，去掉组织表面血污,剪成小块（,0.5,1 mm,3,）,反复漂洗,（,Hanks,液和完全培养液）,接种于培养皿，培养箱培养,长满后传代,三、培养细胞技术,33,PPT课件,（二）细胞来源三、培养细胞技术33PPT课件,（二）细胞来源,（,2,）,消化培养法,与组织块培养法区别：,A.,用酶制剂处理组织块，除去细胞间质，使细胞分离，形成细胞悬液；,B.,细胞生长方式多为单层。,优点：更易摄取营养、排除代谢产物生长较快。,缺点：操作繁杂，易污染；消化可能对细胞有损伤。,三、培养细胞技术,34,PPT课件,（二）细胞来源三、培养细胞技术34PPT课件,（二）细胞来源,2.,细胞系（,cell line,）,原代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（,Finite Cell Line,）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（,Infinite Cell Line,）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。,三、培养细胞技术,35,PPT课件,（二）细胞来源三、培养细胞技术35PPT课件,原代培养细胞的生命归宿,原代培养期,传代期,衰退期,36,PPT课件,原代培养细胞的生命归宿原代培养期36PPT课件,37,PPT课件,37PPT课件,（二）细胞来源,3.,细胞株（,cell strain,）,从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（,substrain,）。,细胞库：,美国菌种保藏中心（,ATCC,）,http:/www.atcc.org/,中国典型培养物保藏中心,上海细胞库,各科研机构,三、培养细胞技术,38,PPT课件,（二）细胞来源三、培养细胞技术38PPT课件,培养细胞的特性,培养细胞的生长方式,贴附生长：,必须贴附于支持物表面才能生长。大多数细胞属此型。失去在体内特有形态。,成纤维细胞型、上皮细胞型、游走型、多形型。,悬浮生长：,于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。,39,PPT课件,培养细胞的特性培养细胞的生长方式39PPT课件,每代贴附生长细胞的生长过程,游离期,贴壁期,潜伏期,对数生长期,停止期（平台期）,40,PPT课件,每代贴附生长细胞的生长过程40PPT课件,游离期：,细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。,10,分钟一,4,小时,41,PPT课件,游离期：41PPT课件,贴壁期：,细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在,10,分钟一,4,小时贴壁。,底物,：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等,血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（,生长基质,），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。,进口塑料培养瓶涂有,生长基质,（化学合成的功能基团）,42,PPT课件,贴壁期：42PPT课件,43,PPT课件,43PPT课件,44,PPT课件,44PPT课件,潜伏期,此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为,6,24,小时。,45,PPT课件,潜伏期45PPT课件,对数生长期：,细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。,46,PPT课件,对数生长期：46PPT课件,停止期（平台期）：,细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。,机制：接触抑制、密度依赖性,47,PPT课件,停止期（平台期）：47PPT课件,48,PPT课件,48PPT课件,（三）细胞培养常规操作技术,1.,细胞传代培养,细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。,传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。,三、培养细胞技术,49,PPT课件,（三）细胞培养常规操作技术三、培养细胞技术49PPT课件,贴壁细胞传代操作流程：,（,1,）弃去培养液。,（,2,）加入胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。,（,3,）消化时间约为,1,3,分钟。倒置镜下观察细胞。原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，细胞间出现空隙，细胞未漂起时弃去胰酶，同时用,Hanks,或培养液终止消化。,（,4,）制作细胞悬液，细胞计数（有经验者可省），根据细胞数目和细胞生长特点，按,1:2,1:6,进行传代，置,37,下继续培养。,三、培养细胞技术,50,PPT课件,贴壁细胞传代操作流程：,附：消化液配制方法：,称取,0.25,克胰酶蛋白酶（活力为,1,：,250,），加入,100ml,无,Ca,2+,、,Mg,2+,的,Hanks,液（,D-Hanks,）溶解，滤器过滤除菌，,4,保存，用前可在,37,下回温。,可配成,1%,溶液，,-20,保存，用前稀释成,0.25%,。,胰酶溶液中也可加入,EDTA,，使最终浓度达,0.02,。,3.,细胞传代,.flv,三、培养细胞技术,51,PPT课件,三、培养细胞技术51PPT课件,2.,细胞冻存,在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、,PH,改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在,130,以下的低温中能减少冰晶的形成。,目前常用的保护剂为二甲亚砜（,DMSO,）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。,三、培养细胞技术,52,PPT课件,2. 细胞冻存三、培养细胞技术52PPT课件,三、培养细胞技术,细胞冻存操作,（,1,）收集对数生长期细胞，细胞定量。,（,2,）加入保护液（,10%DMSO,），调整至,4,1010,6,/ml,左右。,（,3,）将悬液分至冻存管中，每管,1 ml,。,（,4,）将冻存管口封严。,（,5,）贴上标签，写明细胞名称、代数、冻存日期等。,（,6,）标准降温速度：,-1,-2,/min,；,温度达到,-25,时，,-5,-10,/min,；,到,-70, 时，直接放入液氮。,53,PPT课件,三、培养细胞技术细胞冻存操作53PPT课件,三、培养细胞技术,细胞冻存操作,一般降温顺序：室温,4,（,20,分钟,低温冰箱（,20,30 min,）,超低温冰箱（,80,）或直接放入液氮。,注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般,30,立升的液氮能用,1,1.5,月。,细胞冻存量很大时：可用细胞冻存仪。置,80,冰箱过夜后，直接放入液氮保存。,54,PPT课件,三、培养细胞技术细胞冻存操作 54PPT课件,三、培养细胞技术,冻存液配制：,培养基加入甘油或,DMSO,，使其终浓度达,520%,。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好后,4,下保存。,4.,细胞冻存,.flv,55,PPT课件,三、培养细胞技术冻存液配制： 55PPT课件,3.,细胞复苏,细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的,5,0,，细胞仍能生长，活力受损不大。,三、培养细胞技术,56,PPT课件,3. 细胞复苏 三、培养细胞技术56PPT课件,3.,细胞复苏,操作：,（,1,）从液氮中取出冻存管、迅速置于,37,温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在,1,分钟之内融化。,（,2,）打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中，加,10ml,培养液或,Hanks,液，,1000rpm,离心,10,分钟，弃去上清液。,（,3,）细胞沉淀加,10ml,培养液或,Hanks,液，吹打均匀，再离心,10,分钟，弃上清液。,（,4,）加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，,37,培养，第二天观察生长情况。,解冻时务必注意安全，预防冷冻管爆裂。,细胞复苏 高清,.kux,三、培养细胞技术,57,PPT课件,3. 细胞复苏三、培养细胞技术57PPT课件,4.,细胞计数及活力测定,培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。,在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。,三、培养细胞技术,58,PPT课件,4. 细胞计数及活力测定三、培养细胞技术58PPT课件,（,1,）,细胞计数,A.,将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。,B.,将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。,C.,静置,3,分钟。,D.,镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：,细胞数,/ml,4,大格细胞总数,/ 410,4,三、培养细胞技术,59,PPT课件,（1） 细胞计数 三、培养细胞技术59PPT课件,三、培养细胞技术,60,PPT课件,三、培养细胞技术60PPT课件,（,1,）,细胞计数,注意：,细胞要分散成单个细胞；,镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占,10%,以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液；,对于压线的细胞：只计算上线和左线。,三、培养细胞技术,61,PPT课件,（1） 细胞计数 注意：三、培养细胞技术61PPT,（,1,）,细胞计数,另外：可以用细胞计数仪。,三、培养细胞技术,62,PPT课件,（1） 细胞计数三、培养细胞技术62PPT课件,（,2,）,细胞活力测定,A. MTT,法,B. XTT,法,C. CCK-8,法,三、培养细胞技术,63,PPT课件,（2） 细胞活力测定 三、培养细胞技术63PPT课,5.,细胞增殖检测,（,1,）,MTT,：化学名：,3-(4,，,5-,二甲基噻唑,-2)-2,，,5-,二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性,MTT,还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（,Formazan,）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（,DMSO,）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在,490nm,波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，,MTT,结晶形成的量与细胞数成正比。,缺点,：由于,MTT,经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。,三、培养细胞技术,64,PPT课件,5. 细胞增殖检测三、培养细胞技术64PPT课件,（,2,）,XTT,法,XTT,：化学名：,2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-(phenylamino)carbonyl-2H-tetrazolium hydroxide,，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲瓒产物。当,XTT,与电子偶合剂（例如,PMS,）联合应用时，其所产生的水溶性的甲瓒产物的吸光度与活细胞的数量成正比。,优点,：,1,、使用方便，省去了洗涤细胞；,2,、检测快速；,3,、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；,4,、重复性优于,MTT,。,缺点,：,XTT,水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用。,三、培养细胞技术,65,PPT课件,（2）XTT法三、培养细胞技术65PPT课件,（,3,）,CCK-8,法或称,WST-8,法,CCK-8,试剂中含有,WST8,：化学名：,2-(2-,甲氧基,-4-,硝基苯基,)-3-(4-,硝基苯基,)-5-(2,4-,二磺酸苯,)-2H-,四唑单钠盐,，它在电子载体,1-,甲氧基,-5-,甲基吩嗪,硫酸二甲酯（,1-Methoxy PMS,）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在,450nm,波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。,三、培养细胞技术,66,PPT课件,（3）CCK-8法或称WST-8法三、培养细胞技术66PPT,（,3,）,CCK-8,法或称,WST-8,法,优点,：,1,、使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；,2,、检测快速；,3,、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；,4,、重复性优于,MTT,；,5,、对细胞毒性小；,6,、为,1,瓶溶液，毋需预制，即开即用。,缺点：,1,、与,MTT,相比，,CCK-8,和,XTT,的价格比较贵。,2,、,CCK-8,试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。,三、培养细胞技术,67,PPT课件,（3）CCK-8法或称WST-8法三、培养细胞技术67PPT,操作步骤：,a. 96,孔板细胞经过干预处理,b. MTT,法：去掉培养液，加入,80ul,培养液,+20ulMTT,（,0.5%,）,XTT,法：直接加入,XTT 50ul,（,0.1%XTT+1.5%,硫酸甲醋吩嗦,PMS,：,1ml,：,30ul,）,CCK-8,：直接加入,CCK-8 10ul,c. MTT,法：培养,4 h,，加入,DMSO 150ul,溶解结晶，酶标仪检测。,XTT,法：培养,4 h,，酶标仪检测。,CCK-8,：培养,1-4 h,，酶标仪检测。,三、培养细胞技术,68,PPT课件,操作步骤：三、培养细胞技术68PPT课件,三、培养细胞技术,69,PPT课件,三、培养细胞技术69PPT课件,（,4,）,BrdU,法,（,5,）实时监测系统,三、培养细胞技术,70,PPT课件,（4）BrdU法三、培养细胞技术70PPT课件,6.,细胞周期分析,三、培养细胞技术,71,PPT课件,6. 细胞周期分析三、培养细胞技术71PPT课件,6.,细胞周期分析,细胞周期（,cell cycle,）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为,间期,与,分裂期,两个阶段。,G1,期,（,first gap,）从有丝分裂完成到,DNA,复制前的一段时期，又称合成前期，此期主要合成,RNA,和核糖体。该期特点是物质代谢活跃，迅速合成,RNA,和蛋白质，细胞体积显著增大。这一期的主要意义在于为下阶段,S,期的,DNA,复制作好物质和,能量,的准备。,三、培养细胞技术,72,PPT课件,6. 细胞周期分析三、培养细胞技术72PPT课件,6.,细胞周期分析,G1,期,（,first gap,）细胞进入,G1,期后，并不是毫无例外地都进入下一期继续增殖，在此时可能会出现三种不同前景的细胞：增殖细胞：这种细胞能及时从,G1,期进入,S,期，并保持旺盛的分裂能力。暂不增殖细胞或,休止细胞,（,G0,期）：这类细胞进入,G1,期后不立即转入,S,期，在需要时，如损伤、手术等，才进入,S,期继续增殖。不增殖细胞：此种细胞进入,G1,期后，失去分裂能力，终身处于,G1,期，最后通过分化、衰老直至死亡。例如高度分化的神经细胞、肌细胞及成熟的红细胞等。,三、培养细胞技术,73,PPT课件,6. 细胞周期分析三、培养细胞技术73PPT课件,6.,细胞周期分析,S,期,（,synthesis,）即,DNA,合成期，在此期，除了合成,DNA,外，同时还要合成,组蛋白,。,G2,期,（,second gap,）期为,DNA,合成后期，是有丝分裂的准备期。在这一时期，,DNA,合成终止，大量合成,RNA,及蛋白质，包括,微管蛋白,和,促成熟因子,等。,三、培养细胞技术,74,PPT课件,6. 细胞周期分析三、培养细胞技术74PPT课件,分析方法：,（,1,）显微镜下细胞形态分析；,（,2,）,BrdU,法；,（,3,）流式细胞术：明确各期细胞数及百分比。,三、培养细胞技术,75,PPT课件,分析方法：三、培养细胞技术75PPT课件,7.,细胞凋亡分析,细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因基控制的细胞自主的有序的死亡。,形态学,观察细胞凋亡的变化是多阶段的，细胞凋亡往往涉及单个细胞，即便是一小部分细胞也是非同步发生的。首先出现的是细胞,体积缩小,，连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素,C,到胞浆，,核质,浓缩，,核膜,核仁,破碎，,DNA,降解,成为约,180bp-200bp,片段；胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个,凋亡小体,，无内容物外溢，因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。,三、培养细胞技术,76,PPT课件,7. 细胞凋亡分析三、培养细胞技术76PPT课件,7.,细胞凋亡分析,（,1,） 电镜检查：在电镜下可见细胞膜表面凸出形成典型的凋亡小体，内含有正常形态的线粒体和其他细胞器。细胞质高度浓缩。核染色质浓缩成月牙状，同时形成一些核仁碎片，核膜凹陷使胞核裂开。,（,2,）,DNA,检测：凋亡细胞的基因组,DNA,核小体之间连接的双链,DNA,被切断，从而产生,180-200bp,的多倍体,DNA,片段。应用琼脂糖凝胶电泳出现一典型的,DNA,梯形,(DNA ladder),，与坏死细胞出现的,DNA,随机降解带型有明显的区别。,三、培养细胞技术,77,PPT课件,7. 细胞凋亡分析三、培养细胞技术77PPT课件,7.,细胞凋亡分析,（,3,）,TdT,介导的,dUTP,缺口标记分析法：细胞在凋亡时，其基因组,DNA,在核小体之间被切断，产生许多,3-OH,末端。用末端脱氧核苷酸转移酶,(TdT),将地高辛标记的,dUTP,掺入到,DNA,片段的,3-OH,末端，然后再加入经荧光标记的抗地高辛抗体，使其与地高辛特异结合，在荧光显微镜下，凋亡细胞呈现黄绿色荧光。,（,4,）应用流式细胞仪分析,三、培养细胞技术,78,PPT课件,7. 细胞凋亡分析三、培养细胞技术78PPT课件,8.,细胞培养过程中常见的问题,（,1,）,培养液,pH,值快速偏离 ：,CO,2,浓度异常，培养瓶盖过紧 ；细菌、酵母或霉菌污染 。,（,2,）培养液出现沉淀 ：细菌或霉菌污染。,（,3,）细胞不贴壁 ：胰酶过度消化细胞 ，支原体污染 ，缺乏附着因子,三、培养细胞技术,79,PPT课件,8. 细胞培养过程中常见的问题三、培养细胞技术79PPT课,8.,细胞培养过程中常见的问题,（,4,）细胞死亡 ：孵箱中缺,CO,2,， 孵箱温度不稳定 ，细胞冻融损伤 ，渗透压改变，培养液中毒性代谢产物堆积。,（,5,）细胞生长缓慢 ：培养液或血清改变 ，基本促生长成分的消耗、缺乏或降解,如谷氨酰胺、生长因子等 ，低水平的细菌或霉菌污染，接种细胞数太少，有限培养细胞衰老 ，支原体污染,。,三、培养细胞技术,80,PPT课件,8. 细胞培养过程中常见的问题三、培养细胞技术80PPT课,8.,细胞培养过程中常见的问题,细菌感染：,pH,变酸，培养液浑浊，镜下看到细菌，细胞形态改变，停止生长。,三、培养细胞技术,81,PPT课件,8. 细胞培养过程中常见的问题三、培养细胞技术81PPT课,8.,细胞培养过程中常见的问题,真菌,感染：一般在培养液中有肉眼可见的白色或浅黄色的漂浮小点，念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间，个体细小，有增多趋势，培养液一般不混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。培养细胞受真菌污染后，细胞生长变慢，最后由于营养耗尽及毒性作用可使细胞脱落、死亡。,三、培养细胞技术,82,PPT课件,8. 细胞培养过程中常见的问题三、培养细胞技术82PPT课,三、培养细胞技术,83,PPT课件,三、培养细胞技术83PPT课件,8.,细胞培养过程中常见的问题,支原体污染及判断,支原体（,mycoplasma,）是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，直径,0.22m,左右，无细胞壁，对理化因素比较敏感。受污染的细胞在显微镜下无特殊的外观表现，培养液也不浑浊；部分敏感细胞生长增殖变慢，细胞变圆，脱落。在细胞培养过程中，如在显微镜下发现破碎的细胞有许多，培养物需要频繁改善营养环境才能支持长期传代培养时，应怀疑培养物可能受支原体污染。支原体可通过培养法、,DNA,荧光染色法、聚合酶链式反应、免疫学等方法进行检测。,三、培养细胞技术,84,PPT课件,8. 细胞培养过程中常见的问题三、培养细胞技术84PPT课,8.,细胞培养过程中常见的问题,污染的排除,一般的原则是应将污染的细胞弃去，而不要试图去除污染，非常重要的细胞株才考虑去除污染，但在任何情况下，污染都很难完全被消除。,细菌污染的排除,：可使用大剂量抗生素冲击法，向污染的细胞培养液中加入大剂量的抗革兰氏阳性和阴性细菌的抗生素，一般采用,5,10,倍于常用量进行用药，加入高浓度抗生素后作用,24,48,小时，再换入常规的培养液，有时可以奏效。,支原体的排除,：卡那霉素、庆大霉素、支原体去除因子（,MRA,）、卷须霉素及,BM-Cycline,等对抗支原体是有活性的，可使用它们抑制或消除支原体。,三、培养细胞技术,85,PPT课件,8. 细胞培养过程中常见的问题三、培养细胞技术85PPT课,谢谢！,86,PPT课件,谢谢！86PPT课件,