MTT比色法测定细胞生长曲线、细胞生长曲线拟合、课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,1.,MTT比色法测定细胞生长曲线,2.细胞,生长曲线,的,拟合及细胞群体倍增时间的简化计算,1.MTT比色法测定细胞生长曲线2.细胞生长曲线的拟合及,1,1.,MTT比色法测定细胞生长曲线,1.MTT比色法测定细胞生长曲线,2,细胞生长曲线,细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用,方,法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。,一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的,迟缓期,（潜伏期）,，即进入大量分裂的,对,数生长期,。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入,稳定,期,，然后,退化衰亡,。,以存活细胞数(万/mL)对培养时间(h或d)作图，即得生长曲线,。,一般而言，我们主要研究的是对数生长期的生长曲线。,细胞生长曲线细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是,3,测定细胞生长曲线的方法,1.细胞,计数法,（简单、最常用、有误差）,（,1,）传代后把细胞重悬，得到细胞悬液，把悬液均匀加到24孔板中,（,2,）,24 h后开始,进行,细胞,计数,，以后每隔24 h计数一次，每次取,4孔,细胞，分别进行计数,，计数结果取4孔的,平均值。连续计数,6天,。,（3）,根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数/mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。,24孔板 细胞计数板,测定细胞生长曲线的方法,4,2.MTT法,（复杂，误差小）,原理,MTT,：,全称为3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,汉语化学名,：,3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐,商品名：噻唑蓝,，,是一种黄颜色的染料。,活细胞,的,线粒体,中琥珀酸脱氢酶能够,使外源性的,MTT,还原,，同时在细胞色素C 的作用下，生成,不溶于水的,蓝色（或蓝紫色）,络合物,甲臜,。,按照时间间隔，通过酶联免疫检测仪,在,490nm（或,570nm,）波长处测定,甲臜,的光吸收值（A值）,。,在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据,光吸收,值,推算出活细胞的数目。,由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入 MTT 不会有反应,。,2.MTT法（复杂，误差小）,5,1.,标准曲线,的,测定,:,例如：,用培养液将待检细胞,重悬，得到细胞悬液，按照4x104/ml,细胞密度梯度 ,分别接种于 96孔板 ,每孔 100l,重复 3孔;采用 MTT法,测量吸光值A值,同一浓度下测得的A值为该浓度下3孔的平均值。,依检测结果 ,得到,吸光值,A值与,细胞浓度,的,对应关系，绘出标准曲线,。,2.,细胞生长曲线的,测定,:,例如：,用培养液将待检细胞制成 110,4,/ml的细胞悬液;分别接种于多块96孔板 ,每孔 100l ;,在,24、 48、 72、 96及 120 h,时间点,取一块 96孔板 ,采用 MTT法,测量吸光值A值得到,吸光值A值与时间,的关系。,根据,标准曲线,计算出相应的细胞数 ,再绘出细胞的生长曲线。,1.标准曲线的测定:,6,2.细胞,生长曲线拟合及细胞群体倍增时间的简化计算,2.细胞生长曲线拟合及细胞群体倍增时间的简化计算,7,曲线拟合,曲线拟合（curve fitting）是指选择适当的曲线类型来拟合观测数据，并用拟合的曲线方程分析两变量间的关系。,SPSS,SPSS是世界上最早的统计分析软件，由美国斯坦福大学的三位研究生Norman H. Nie、C. Hadlai (Tex) Hull 和 Dale H. Bent于1968年研开发成功，同时成立了SPSS公司，并于1975年成立法人组织、在芝加哥组建了SPSS总部。,1984年SPSS总部首先推出了世界上第一个统计分析软件微机版本SPSS/PC+，开创了SPSS微机系列产品的开发方向，极大地扩充了它的应用范围，并使其能很快地应用于自然科学、技术科学、社会科学的各个领域。,曲线拟合,8,通常地，细胞生长曲线的函数拟合模型是,但由于细胞增值是二次分裂生长，所以选用,作为细胞生长曲线的拟合模型更为合适。,通常地，细胞生长曲线的函数拟合模型是,9,又因为在SPSS中的曲线拟合功能选项中并没有 的 函数拟合模型，只有,于是我们可以通过变换,从而能使用SPSS中的函数拟合模型进行曲线拟合。,又因为在SPSS中的曲线拟合功能选项中并没有,10,原始数据,原始数据,11,曲线1.,培养天数,X,ln2,曲线2.,进入对数生长期天数,X,ln2,依据,以上,变量进行曲线拟合,记录相应,的a,b值。,曲线1. 培养天数 X ln2,12,MTT比色法测定细胞生长曲线、细胞生长曲线拟合、课件,13,MTT比色法测定细胞生长曲线、细胞生长曲线拟合、课件,14,2.2,细胞群体倍增时间的,简化计,算方法,2.2 细胞群体倍增时间的简化计算方法,15,细胞群体倍增时间的计算方法有2种。,1.,做图法:在细胞生长曲线的对数生长期找出细胞增加一倍所需的时间,即倍增时间,2.,公式法,按细胞倍增时间计算细胞群体倍培时间,其为,公式为：,（,Nt为对数生长期任一点的理论观察值,N0为对数生长期理论初始值,）,计算比较复杂,而我们基于以往曲线进行理论推导而行的理论倍增时间,计算相对简单,。,细胞群体倍增时间的计算方法有2种。,16,推导过程,推导过程,17,结果,曲线一.,b=0.855,曲线二.,b=0.921,结果,18,THANK YOU,THANK YOU,19,