微透析技术与方法研究生课件

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,微透析技术与方法,洪 宗 元,皖南医学院定量药理研究所,微透析技术与方法洪 宗 元皖南医学院定量药理研究所,1,微透析技术是一种微量化学采样与检测技术,微透析技术,微透析技术是一种微量化学采样与检测技术微透析技术,2,微透析系统组成,微透析技术原理,微透析技术特点,透析相关仪器及透析液,微透析实验操作,微透析实验的注意事项,微透析系统组成,3,一、微透析系统组成,Perfusion medium: aCSF,Flow rate: 2,l/min,Dialysis probe,Area of diffusion,Freely moving rats,一、微透析系统组成 Perfusion me,4,二、微透析技术原理,微透析探头是由具有一定截留分子量的纤维半透膜制成(microdialysis probe，MDP)；,将探头埋入待测的组织区域，以恒定速度向探头内灌注与组织液成分相近的等渗灌流液；,当灌流液流经探头前端透析膜时，组织内小分子量生物活性物质即顺浓度梯度从膜外扩散入膜内，并随灌流液被引流至探头外；,按一定的时间间隔连续收集透析液，检测其中待测生物活性物质水平，可监测该区域内细胞外生物活性物质浓度的经时变化过程,二、微透析技术原理微透析探头是由具有一定截留分子量的纤维半透,5,微透析技术与方法研究生课件,6,微透析技术原理,优点,组织损伤小、取样少、方便、快捷、可连续监测且易实现自动化等优点。,微透析技术原理优点组织损伤小、取样少、方便、快捷、可连续监测,7,微透析系统示意图-,Anesthesized rats,Anesthesized rats,微透析系统示意图-Anesthesized ratsAnes,8,微透析系统示意图-,Freely moving rats,Perfusion medium: aCSF,Flow rate: 2,l/min,Dialysis probe,Area of diffusion,Freely moving rats,微透析系统示意图- Freely moving rats,9,MDP,：常用管式半透膜与不锈钢、石英或塑料毛细管构成，半透膜由再生纤维素、聚碳酸脂或聚丙烯腈制成。截留分子量,5,000-100,000 dolton,不等。适合神经递质等小分子物质通透，而蛋白质难以通透 ；,三、微透析技术特点,灌流液,：脑微透析的灌流液一般采用人工脑脊液,(artificial cerebral spinal fluid, aCSF)、Ringer,或,Krebs,溶液；,MDP：常用管式半透膜与不锈钢、石英或塑料毛细管构成，半透膜,10,检测方法,：,微透析技术特点,(续）,-单胺类物质测定主要采用高效液相色谱,(HPLC-ECD,法；,-氨基酸类物质多用,HPLC,-荧光法测定；,-乙酰胆碱、乳酸、抗坏血酸、丙酮酸和嘌呤类等物质多采用,HPLC,-紫外检测法；,-神经肽类物质主要用放射免疫法测定。,检测方法：微透析技术特点(续）-单胺类物质测定主要采用高,11,（一）微透析探针,组成成分：小口径的透析膜、硅管、防水万用胶、硅胶毛细管,1.橡胶管；,2.硅胶管,（silica tubing）,粗管；,3.硅胶管（silica tubing）细管；,4.聚乙烯管(,PE-10 (polyethylene tubing)；,5.透析膜,（Dialysis membrane）,；,6.环氧乙烷,（epoxy adhesive）,；,7.注射针头。,四、透析相关仪器及透析液,（一）微透析探针组成成分：小口径的透析膜、硅管、防水万用胶、,12,（二）透析泵,1.流速稳定且缓慢，介于,1-5l/min,2.快速的前进/后退模式，连续而可调整的流速，和微调控制选择,（microprocessor control option）,3.液体转动轴,（liquid swivel）,:动物可自由行动，不会被透析管缠住,4.常用透析泵,CMA/100, Harvard Microliter , Sage Model 341A,（二）透析泵 1.流速稳定且缓慢，介于 1-5l/min,13,（三）透析液转换器,Carnegie Medicine,公司发展了一个全自动的透析液转换器,CMA/110 及 CMA/111,。因这个机器有微调的功能，马达驱动的设备，来转换透析液，在转换过程中不会让空气进入。,（三）透析液转换器Carnegie Medicine 公司发,14,（四）,透析液收集,1.手动收集透析液,虽然耗时间，但可使一台,HPLC,发挥最大功用。例如收集时间要 20 分钟，测定一个样品只要 7-8 分钟，则一台,HPLC,力足以应付 3 种样品；使样品分离和分析很明确,2.自动收集器,(CMA/140),按一定间间隔将透析液收集在冷藏,（refrigerated）,设备的旋转盘上的玻璃小瓶内,这就不需在实验过程中一直看守着仪器。但就无法一边收一边分析透析液,（四）透析液收集1.手动收集透析液2.自动收集器 (CMA/,15,3.在线收集与检测,(Online),将探针出口直接连到,HPLC,的承载阀,（load-valve,）上，而直接在线上自动分析透析液。即把一台,HPLC,限制在单一动物身上，使透析实验全自动化,3.在线收集与检测 (Online),16,（五）灌流液,(perfusate),1. Ringers solution：, 140 mM NaCl, 3.0 mM KCl, 1.2-3.4 mM CaCl,2, 1.0 mM MgCl,2, 1.2 mM Na,2,HPO,4, 0.27 mM NaH,2,PO,4, 7.2 mM glucose, pH 7.4,2. 人工脑积液,(artificial cerebrospinal liquid, aCSF),147 mM Na,+, 4.0 mM K,+, 2.0 mM Ca,2+,（五）灌流液 (perfusate) 1. Ringers,17,大多数微透析使用的透析液，都含有1-3.4 mM 浓度的钙离子。,动物组织不同区域，钙离子浓度从1-3 mM 不等。透析液中含有3.4 mM 和含有1.2 mM 钙离子时，对药物引起的 DA 变化，会有定量的（quantitative）不同。,目前我们虽知透析液中钙离子的含量，对单胺的释出有影响，但影响的程度则未知。组织间的不同差异，钙离子可能是一个影响因素。,（六）透析液中钙离子的浓度,大多数微透析使用的透析液，都含有1-3.4 mM 浓度的钙离,18,五、微透析实验操作,（一）透析探针的植入,1.必须的仪器：外科器械、钻孔机、立体定位仪,2.定位软件、图谱：,Paxinos, G., and W. C. (1997) The,Rat Brain,in Stereotaxic Coordinates (The Third Edition): San Diego, Academic Press.,Paxinos, G., and F. K. B. J. (2001) The,Mouse Brain,in Stereotaxic Coordinates (The Second Edition): San Diego, Academic Press.,五、微透析实验操作（一）透析探针的植入 1.必须的仪器：外科,19,（二）微透析探针植入前的准备,1.手术前，将透析探针（储存在干的状态下）连上透析系统，并安置在立体定位仪的把手。,2.将把手夹在一个小蒸馏架上，将探针浸到含有透析液的烧杯中，使透析膜完全浸湿和微微张开。一旦透析膜弄湿后，就不可将透析膜移出溶液，因为透析膜干掉后，会影响单胺的回收率。,3.检查透析膜，确定它是流通而不渗漏的；并排空系统内气体。,（二）微透析探针植入前的准备1.手术前，将透析探针（储存在干,20,（三）麻醉,1.非复原性（急性实验,acute preparation,）,实验进行中，用加温毯或台灯将动物体温维持在,37 C,。,手术（,30min,），然后等 2 小时作基础值测定期,（baseline period）,看(单胺释出量)有否趋于稳定，然后药物注射之后，继续测定 2 小时左右的给药测定期,（post-drug）,。,用,chloral hydrate 或 urethane,麻醉，麻醉时间较长,（三）麻醉1.非复原性（急性实验 acute prepara,21,用 pentobarbital 或 halothane (0.15% halothane/air mixture, air mixture: 95% O,2,+ 5% CO,2,),麻醉,Halothane麻醉,恢复快又比较不会发生意外,但要求小动物麻醉机,2.自由活动实验（慢性实验,chronic preparation,）,需要液体转动轴，动物在自由运动的情形下，不受限制地收集透析液,需要适当的动物活动室(动物行为合乎生理状况,如隔音、保温、保湿、光控等),用 pentobarbital 或 halothane (0,22,六、微透析实验的注意事项,（一）组织损害,脑组织急性植入小导管或探针，导致立即地，但数分钟到数小时内可恢复的变化，如在探针邻近区域，,组织被压凹，,血脑障壁被破坏，,葡萄糖代谢受影响，,神经元,损害,六、微透析实验的注意事项 （一）组织损害 脑组织急性植入小导,23,微透析探针植入几天，透析膜附近的组织，立即发生神经胶质,（gliotic）,反应，结果造成炎症细胞和结缔组织覆盖在半透膜上，形成障壁,（barrier）,阻碍透析进行。例如：,（二）慢性实验过程,探针植入后几天，基本的单胺释出和药物引起的单胺释出都会下降,无论是术后 4 天纹状体的 DA,还是术后 7 天海马回的 5-HT，其基本的释出量仍都与钙离子相关，暗示它们都源自神经元,微透析探针植入几天，透析膜附近的组织，立即发生神经胶质（gl,24,HPLC-ED,分析单胺及其代谢物实验。,(A),单胺及其代谢物标准品。,(B),纹状体透析液。,1. norepinephrine; 2. epinephrine; 3. dopamine; 4. DOPAC; 5. 5-HIAA; 6. HVA; 7. 3-MT(3-methoxytyramine); 8. 5-HT.,HPLC-ED 分析单胺及其代谢物实验。(A)单胺及其代谢物,25,微透析技术与方法研究生课件,26,