基因工程的基本操作程序--公开课--课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1.2,基因工程的基本操作程序,1,1.2 基因工程的基本操作程序1,1,、目的基因的获取,2,、基因表达载体的构建,3,、将目的基因导入受体细胞,4,、目的基因的检测与鉴定,2,1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受,一、目的基因的获取,1.,目的基因,符合人们需要，能编码蛋白质的基因,2.,基因文库,P9,将含有某种生物,不同基因,的许多,DNA,片断，导入到,受体菌,的群体中，,各个受体菌分别含有这种生物的不同基因,，称为基因文库。,3,一、目的基因的获取1.目的基因符合人们需要，能编码蛋白质的基,4,4,种类,基因组文库,：,含有一种生物的,全部基因,部分基因文库,：,只包含了一种生物的,部分基因,，,如：,cDNA,文库,5,种类基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了,某种生物的,全部,DNA,限制酶,DNA,片段,DNA,片段与载体连接,重组,DNA,基因组文库,导入受体菌中储存,基因组文库的构建,6,某种生物的全部DNA限制酶DNA片段DNA片段与载体连接重组,生物,某个发育时期,的,mRNA,单链,DNA,双链,cDNA,片段,重组,DNA,与载体连接,cDNA,文库,反转录酶,DNA,聚合酶,导入受体菌中储存,cDNA,文库的构建,-,逆转录法：,7,生物某个发育时期的mRNA单链DNA双链cDNA片段重组DN,基因组,DNA,文库与,cDNA,文库的比较,8,基因组DNA文库与cDNA文库的比较8,3.,获取目的基因的方法,（,1,）从基因文库中获取,（,2,）利用,PCR,技术扩增,（,3,）人工合成,9,3.获取目的基因的方法（1）从基因文库中获取（2）利用PCR,依据：,目的基因的有关信息。,如：,根据基因的核苷酸序列,基因的功能,基因在染色体上的位置,基因的转录产物,mRNA,基因翻译产物蛋白质等特性,（,1,）从基因文库中获取目的基因,10,依据：目的基因的有关信息。（1）从基因文库中获取目的基因10,（,2,）利用,PCR,技术扩增目的基因,概念：,PCR,全称为,_,，是一项,在生物,_,复制,_,的核酸合成技术。,原理：,_,多聚酶链式反应,体外,特定,DNA,片段,DNA,复制,11,（2）利用PCR技术扩增目的基因 概念：PCR全称为_,模板,DNA,12,模板DNA12,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,50,引物,1,引物,2,DNA,引物,95,13,PCR的基本原理PCR反应条件50引物1引物2DNA引物9,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,引物,1,引物,2,DNA,引物,72,Taq,酶,Taq,酶,14,PCR的基本原理PCR反应条件引物1引物2DNA引物72T,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,72,第,1,轮结束,第,2,轮开始,15,PCR的基本原理PCR反应条件72第1轮结束第2轮开始15,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,95,50,72,Taq,Taq,Taq,Taq,16,PCR的基本原理PCR反应条件955072TaqTaq,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,72,第,2,轮结束,17,PCR的基本原理PCR反应条件72第2轮结束17,过程：,a,、,变性,（,90-95,）：双链,DNA,在受热下，,_,断裂，形成,_,b,、,复性,（,55-65,）：温度降低，,引物,与单链,DNA,结合，形成局部,_,。,c,、,延伸,（,70-75,）：在,Taq,酶,的作用下，合成与模板互补的,_,。,氢键,单链,DNA,双链,DNA,链,18,过程：a、变性（90-95）：双链DNA在受热下，_,方式：以,_,方式扩增，即,_,条件：前提条件,:_,结果：,指数,2,n,短时间内大量扩增目的基因,已知基因的核苷酸序列,19,方式：以_方式扩增，即_条件：前提条件:_,PCR,技术扩增与,DNA,复制的比较,高温,解旋酶,体外复制,主要在细胞核内,热稳定的,DNA,聚合酶,细胞内的,DNA,聚合酶,20,PCR技术扩增与DNA复制的比较高温解旋酶体外复制主要在细胞,（,3,）人工合成法：,在,基因较小，核苷酸序列已知,的情况下，,可以利用,DNA,合成仪,人工合成,化学合成法 、 反转录法,21,（3）人工合成法： 在基因较小，核苷酸序列已,蛋白质,mRNA,DNA,推测,推测,DNA,DNA,合成仪合成,根据已知的氨基酸序列合成,DNA,法 ：,22,蛋白质mRNADNA推测推测DNADNA合成仪合成根据已知的,二、基因表达载体的构建（,核心,）,1.,目的,A.,使目的基因在受体细胞中,稳定存在,并,遗传,给子代,B.,同时使目的基因能,表达和发挥作用,23,二、基因表达载体的构建（核心）1.目的A. 使目的基因在受,2.,基因表达载体的,组成,：,a,、目的基因,b,、启动子,c,、终止子,d,、标记基因,24,2.基因表达载体的组成：a、目的基因b、启动子c、终止子d、,质粒,目的基因,限制酶,DNA,连接酶,重组,DNA,3.,基因表达载体的构建过程,25,质粒目的基因限制酶DNA连接酶重组DNA3.基因表达载体的构,（,1,）用,_,切割质粒，使其出现切口露出,_,。,（,2,）用,_,切割目,的基因，使其产生,_,_,。,（,3,）将目的基因插入质粒的,_,处，加入,_,，形成了一个重组,DNA,分子,限制酶,黏性末端,同种限制酶,的黏性末端,切口,DNA,连接酶,相同,26,（1）用_切割质粒，使其出现切口露出_,三、将目的基因导入受体细胞,-,转化,目的基因进入,_,内，并且在 受体细胞内维持,_,和,_,的过程,稳定,表达,受体细胞,27,三、将目的基因导入受体细胞-转化目的基因进入_,1,、将目的基因导入,植物,细胞,（,1,）,农杆菌转化法,特点,:,a.,能感染,双子叶,植物和,祼子,植物,对单子叶植物无感染能力,b.Ti,质粒的,TDNA,可转移至受体细胞并,整合到其染色体上,28,1、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法特点:a.能感染,Ti,质粒,目的基因,构建,表达载体,导入,植物细胞,整合,植物细胞染色体,DNA,表达,新性状,转入,农杆菌,29,Ti质粒构建表达载体导入植物细胞整合植物细胞染色体DNA表达,（,2,）,基因枪法,-,单子叶植物,30,（2）基因枪法-单子叶植物30,（,3,）花粉通道法,我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得,31,（3）花粉通道法我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得31,2,、将目的基因导入,动物细胞,方法：,显微注射法,程序：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物,32,2、将目的基因导入动物细胞目的基因表达载体提纯,3,、将目的基因导,入微生物细胞,（,1,）方法：,Ca,2+,处理法（,增加细胞壁通透性,）,（,2,）微生物作受体细胞原因：,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,（,3,）过程：,Ca,2+,处理,大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收,DNA,33,3、将目的基因导入微生物细胞（1）方法：Ca2+处理法（增加,四、目的基因的检测与鉴定,检测（,分子水平,）,:,是否,插入,目的基因,是否,转录,是否,翻译,鉴定,:,个体生物学水平鉴定,34,四、目的基因的检测与鉴定检测（分子水平）:34,（,1,）检测转基因生物染色体的,DNA,上,是否插入了目的基因,首先取出转基因生物的基因组,DNA,；,A,方法,:,DNA,分子杂交,B,过程,:,将含目的基因的,DNA,片段用,放射性同位素,等作标记,以此做,探针,；,使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出,杂交带,表明目的基因已插入染色体,DNA,中。,1.,检测,35,（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 首,基因探针,通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交带，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。,36,基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交带，能从浩,(2),检测目的基因,是否转录出了,mRNA,方法,:,分子杂交法,过程,:,用上述探针和转基因生物的,mRNA,杂交,若出现,杂交带,表明目的基因转录出了,mRNA,。,37,(2)检测目的基因是否转录出了mRNA方法:分子杂交法过,（,3,）检测目的基因,是否翻译成蛋白质,方法,:,抗原,-,抗体杂交,38,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法:抗原-抗体杂交38,提取,方法抗原,-,抗体杂交,苏云金杆菌,Bt,毒素蛋白,将,Bt,毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗,Bt,毒素的抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,39,提取方法抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白,2.,鉴定（个体生物学水平,）,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,40,2.鉴定（个体生物学水平）抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等40,目的基因的表达和检测,抗虫鉴定 抗病鉴定,活性鉴定等,抗原抗体杂交法,DNA-RNA,分子杂交法,DNA,分子杂交法,受体是否具有,转基因特征,个体水平,目的基因是否翻译,目的基因是否转录,目的基因是否导入,分子水平,方法,检测对象,41,目的基因的表达和检测抗虫鉴定 抗病鉴定抗原抗体杂交法DN,非编码区,非编码区,编码区,外显子,内含子,终止子,基因的结构,启动子,原核,真核,42,非编码区非编码区编码区外显子内含子终止子基因的结构启动子原核,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,43,原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白,编码区,非编码区,非编码区,mRNA,前体,mRNA,单链,DNA,cDNA,转录,剪接,逆转录,复制,启动子,终止子,基因,不含,非编码系列,。即不含,非编码区,和,内含子,44,编码区非编码区非编码区mRNA前体mRNA单链DNAcDNA,