生物可降解塑料课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Environmental Biotechnology,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第八章 可降解塑料的生物合成,第一节 可降解塑料概述,第二节,PHAs,的结构、物理化学性质和应用,1,第八章 可降解塑料的生物合成第一节 可降解塑料概述1,第一节 塑料废物污染和可降解塑料,二十世纪七十年代以来塑料工业得到迅猛的发展，无论是工业、农业、建筑业，还是人们的日常生活无不与塑料密切相关。,化学合成塑料在自然环境中很难分解，亦不会被腐蚀，燃烧处理又会产生有害气体，塑料垃圾对环境造成了巨大的危害。,2,第一节 塑料废物污染和可降解塑料二十世纪七十年代以来塑料工业,普通塑料对环境污染的特点,成分为合成树脂,(1),污染范围广,(2),污染物增长量快。,全世界每年对塑料的需求量为,1,亿吨。,美国专家估计每,10,年产量将增加,1,倍。,1995,年我国的塑料需求量为,600,万吨，其中对环境有威胁的地膜为,88,万吨，包装用品为,150-200,万吨。,美国、日本的塑料垃圾占垃圾总量的,7%,。,3,普通塑料对环境污染的特点成分为合成树脂3,普通塑料对环境污染的特点,-,续,(3),处理难,。塑料具有耐酸碱、抗氧化、难腐蚀、难降解的特性，埋地处理百年不烂；燃烧时产生大量有毒气体，如,HCl,、,SO,x,、,CO,等。,4,普通塑料对环境污染的特点-续(3) 处理难。塑料具有耐酸碱、,普通塑料对环境污染的特点,(4),回收利用难,。塑料制品种类多，填料、颜料多样，难以分拣回收再利用。,(5),生态环境危害大,。地膜降低耕地质量，农作物植株矮小，抗病力差。,5,普通塑料对环境污染的特点(4)回收利用难。塑料制品种类多，填,研究和开发生物可降解塑料已迫在眉捷,用可生物降解塑料代替部分石油化工合成塑料，禁用某些塑料制品,如意大利已立法规定自,1991,年起所有包装用塑料都必须生物可降解，我国也已开始考虑禁用塑料方便餐盒等不可降解的塑料制品。,生物可降解塑料,6,研究和开发生物可降解塑料已迫在眉捷生物可降解塑料6,国内外出现的生物可降解塑料,PCL-,聚已内酰胺,;PVA-,聚乙烯醇,;PE-,聚乙烯,7,国内外出现的生物可降解塑料PCL-聚已内酰胺;PVA-聚乙烯,生物可降解塑料的特点,工艺简单,生产过程污染轻,生物可降解性和生物可相容性,可进行高分子材料的结构调整：控制营养、环境条件,8,生物可降解塑料的特点工艺简单8,第二节、,PHAs,的生物合成与应用,采用微生物发酵法生产的聚,-,羟基烷酸,(,简称,PHAs),，成为应用环境生物学方面的一个研究的热点,聚,-,羟基丁酸,PHB,3-,羟基丁酸与,3-,羟基戊酸的共聚物,P(3HB-co-3HV),或,PHBV,9,第二节、PHAs的生物合成与应用采用微生物发酵法生产的聚-,PHAs,除具有高分子化合物的基本特性，如质轻、弹性、可塑性、耐磨性、抗射线等外，还具有,生物可降解性和生物可相容性,。,PHAs,香波瓶,100,年,个月,合成塑料,PHAs,原料,降解,10,PHAs除具有高分子化合物的基本特性，如质轻、弹性、可塑性、,一、,PHAs,的结构、物理化学性质和应用,多种微生物在一定条件下能在胞内积累,PHAs,作为碳源和能源的贮存物。,由于,PHAs,具有低溶解性和高分子量，它在胞内的积累不会引起渗透压的增加，是理想的胞内贮藏物，比糖原、多聚磷酸或脂肪更加普遍地存在于微生物中。,PHAs,的通式可写成：,单体数目,11,一、PHAs的结构、物理化学性质和应用多种微生物在一定条件下,R,为甲基时，单体为,-,羟基丁酸,(HB),；,R,为乙基时，单体为,-,羟基戊酸,(HV),；,R,为丙基时，单体为,-,羟基已酸,(HC),；,R,为丁基时，单体为,-,羟基庚酸,(HH),；,R,为戊基时，单体为,-,羟基辛酸,(HO),；,R,为已基时，单体为,-,羟基壬酸,(HN),；,R,为庚基时，单体为,-,羟基癸酸,(HD),；,R,为辛基时，单体为,-,羟基十一酸,(HUD),；,R,为壬基时，单体为,-,羟基十二酸,(HDD),；,R,多为不同链长正烷基，也可以是支链的、不饱和的或带取代基的烷基,12,R为甲基时，单体为-羟基丁酸(HB)；R多为不同链长正烷,聚合物命名,R,为甲基时，其聚合物为聚,-,羟基丁酸,(PHB),R,为乙基时，其聚合物为聚,-,羟基戊酸,(PHV),在一定条件下两种或两种以上的单体还能形成共聚物，其典型代表是,3HB,和,3HV,组成的共聚物,P(3HB-co-3HV),。,13,聚合物命名R为甲基时，其聚合物为聚-羟基丁酸(PHB)1,每个,PHAs,颗粒含有数千条多聚体链。这些多聚物的物理化学性质和机械性能如韧度、脆性、溶点、玻璃态温度和抗溶剂性等与单体的组成有极大的关系。,例如,PHBV,共聚物中,羟基戊酸组分的增加可使熔点从,180(PHB,均聚物,),降至,75(PHBV,共聚物中,HV,组分的摩尔分数为,3040%),。,PHAs,的结构、物理化学性质,HV -,羟基戊酸,14,每个PHAs颗粒含有数千条多聚体链。这些多聚物的物理化学性质,大多数有关细菌,PHAs,的物化性质的研究是针对,PHB,和,PHBV,两种聚合物进行的。,PHB,是高度结晶的晶体，结晶度的范围在,55,80%,，其在物理性质甚至分子结构上与聚丙烯,(PP),很相似，例如熔点、玻璃态温度、结晶度、抗张强度等，而比重大、透氧率低和抗紫外线照射以及具有光学活性、阻湿性等则是,PHB,的优点，见表,7-2-1,。,PHAs,的结构、物理化学性质,-,续,15,大多数有关细菌PHAs的物化性质的研究是针对PHB和PHBV,16,16,PHB,较脆和发硬，但可通过与适量,HV,共聚而补偿。,随着,PHBV,中,HV,组分的增加，聚合物的劲度降低而韧性增加，且共聚物的熔点随着,HV,组分的增加而降低，使得较易对其进行热加工处理。,单体,4HB,的聚合物或,3HB,与,4HB,的共聚物,P(3HB-co-4HB),则是高弹体，且其生物降解的速度比均聚,PHB,或,PHBV,更快。,PHAs,的结构、物理化学性质,-,续,HV -,羟基戊酸,HB -,羟基丁酸,17,PHB较脆和发硬，但可通过与适量HV共聚而补偿。PHAs的结,PHB,的工业化应用主要存在两个缺点,PHB,较差的熔化稳定性，其分解温度约为,200 ,，该温度与其熔点相近,(,约,175 ),；,可通过在发酵过程中加入,3HV,的前体合成,PHBV,共聚体或将,PHB,与其它多聚物相混合使用来解决；,在环境条件下贮存数日后，,PHB,易发脆。,PHB,的老化问题可通过简单的淬火处理来较大程度地解决。,18,PHB的工业化应用主要存在两个缺点PHB较差的熔化稳定性，其,思考题,含有,PHAs,的微生物能通过什么染料鉴别？,能利用糖蜜生产,PHB,的最有效菌株是什么？,工业生产,PHAs,的微生物菌种需要考虑哪些因素？,目前报道利用葡萄糖基质生产,PHB,的最高记录是多少？,一般发酵过程分为哪两个阶段？,19,思考题含有PHAs的微生物能通过什么染料鉴别？19,PHAs,的应用,shampoo bottles,bicycle helmet,20,PHAs的应用shampoo bottles bicycle,二、,PHAs,的生物合成,合成,PHAs,的主要微生物,合成,PHAs,的主要基质,PHAs,的代谢途径与调控,21,二、PHAs的生物合成合成PHAs的主要微生物21,PHAs,的生物合成,一 合成,PHAs,的主要微生物,1 PHAs,的发现及形成机制,PHB,最初由,Lemoigne,于,1925,年首先发现。从,巨大芽孢杆菌,（,Bacillus megaterium,),分离鉴定。阐明该菌,形成芽孢时产生,PHB,。,20,世纪,50,年代，发现,PHB,的生成量,随培养基中,碳氮比的增加而增加,22,PHAs的生物合成一 合成PHAs的主要微生物1 PHAs,能产生,PHAs,的微生物分布极广，包括光能和化能自养及异养菌计,65,个属中的近,300,种微生物。,目前研究的较多的微生物：,产碱杆菌属,(,Alcaligenes europhus,现在更名为,Ralstonia eutropha,),假单胞菌属,(,Pseudonomas,),甲基营养菌,(,Methylotrophs,),固氮菌属,(,Azotobacter,),红螺菌属,(,Rhodospirilum,),（一）合成,PHAs,的主要微生物,23,能产生PHAs的微生物分布极广，包括光能和化能自养及异养菌,活性污泥中微生物产生的,PHB,24,活性污泥中微生物产生的PHB24,表,7-4,各种微生物利用不同碳源合成,PHVs,的情况及水平比较,25,表7-4 各种微生物利用不同碳源合成PHVs的情况及水平比,选择工业生产,PHAs,的菌种考虑的因素：,能利用廉价碳源的能力,生长速率问题,多聚物合成速率,在细胞内最大量积累多聚物的能力,26,选择工业生产PHAs的菌种考虑的因素：能利用廉价碳源的能力2,英国,ICI,公司进行考察，发现,：,固氮菌,：产生多糖，,PHB,的比产率降低，技术问题。,甲基营养菌,：,PHB,产率中等。,真养产碱杆菌,：生长快，易培养、胞内,PHB,含量高、聚合物分子量大并能利用各种较经济的能源。,最终选择了,真养产碱杆菌（,A . eutrophus,）,ICI,Imperial Chemical Industries,帝国化学工业公司,27,英国ICI公司进行考察，发现：固氮菌：产生多糖，PHB的比产,真养产碱杆菌,(,Ralstonia eutropha,),为革兰氏阴性的兼性化能自养型细菌,积累,PHB,可达细胞干重的,90%,以上,能利用糖加丙酸或戊酸产生,P(3HB-co-3HV),改变基质该菌还能将,4HB,和,5HV,结合到,3HB,的结构中去，形成,4HB,或,5HV,单体与,3HB,的共聚物。,采用带有真养产碱杆菌,PHB,合成基因的重组大肠杆菌,(,E.coli,),。,工业化生产,PHAs,的微生物,28,真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha)为革兰氏,带有,A.eutrophus,PHB,合成基因,的,重组,E.coli,成为新的选择,！,A.eutrophus,重组,E.coli,1,生长快，容易培养（培养条件简单）,2,胞内聚合物含量高,3,聚合物分子量大,4,提取相对较困难,5,生产共聚物较容易，易调节共聚比,6,分子量分布控制较难,7,已有工业化产品,1,发酵周期短,2,胞内聚合物积累量大,3,胞内无聚合物降解酶，分子量大,4,易于提取,5,胞内聚合物颗粒大、结晶度高,6,能利用多种碳源,7,在复杂培养条件下，胞内聚合物才能高积累。,8,有较成熟的高密度细胞培养技术,生产,PHB(V),的,A.eutrophus,和重组,E.coli,特点,29,带有A.eutrophus PHB合成基因的A.eutrop,二 合成,PHAs,的主要基质,1,糖质碳源,2,甲醇,3,气体（,H,2,、,CO,2,、,O,2,）,4,烷烃及其衍生物,30,二 合成PHAs 的主要基质1 糖质碳源30,1,糖质碳源,葡萄糖,A.eutrophus,的变异株利用葡萄糖已用于工业生产,PHB,。,Kim,等人采用,细胞密度培养,的方法，,50h,细胞浓度达,164g/L,，干细胞中,PHB,含,76,，,PHB,生产强度为,2.42g/(L.h),是目前世界上已报道的,最高记录,.,31,1 糖质碳源 葡萄糖31,重组,E.coli,利用丰富酵母膏、蛋白胨的葡萄糖培养基培养，,42h,细胞浓度达,117g/L,，,PHB,占细胞干重,76,，,PHB,生产强度,2.11g/(L.h),降低成本，用合成培养基培养,35h,，细胞浓度为,71.4g/L,，,PHB,干重,22.8,。即 在合成培养基上不能大量积累,PHB,（乙酰,CoA,不足）。,在合成培养基上加有机氮源，改进方法，细胞浓度达,116g/L,，,PHB,干重达,62.2,。,32,重组E.coli 32,蔗糖和糖蜜,带有稳定高拷贝数的,pSYL104,质粒的重组,E.coli,能利用蔗糖生产,PHB,。,在含蔗糖的合成培养基中采用恒定,pH,的分批补料方式培养,48h,，细胞浓度达,124.6g/L, PHB,浓度,34.3g/L,。加有机氮可以改善。,利用糖蜜原料有困难：杂质多，,PHB,难积累。需精制后使用。,33,蔗糖和糖蜜带有稳定高拷贝数的pSYL104质粒的重组E.c,2,、甲醇,甲醇是最便宜的基质之一，,ICI,拥有生产甲醇单细胞蛋白的技术经验，曾考虑用甲醇作基质生产,PHB,。甲醇菌积累,PHB,含量不高，,PHB,回收成本大，获得的,PHB,的分子量较小，故放弃该路线。,但可以作为寻求新的菌种和开发更有效的培养方法的途径。,34,2、甲醇34,35,35,3,、气体,H,2,/CO,2,/O,2,真养产碱杆菌等一些爆鸣气细菌能利用,H,2,/CO,2,/O,2,产生,PHB,，其中,H,2,作为能源，,CO,2,是碳源。,以,H,2,作为基质按其价格和产率而言,(,见表,1),在经济上是划算的，且,H,2,又是一种干净的可再生资源。可以同时解决两个严重的环境污染问题：温室效应及废弃的非降解塑料对生态环境的危害。,安全性问题：解决混合气体爆鸣的安全问题和气体的循环利用问题。控制基质气相中氧的浓度低于气体爆炸的下限,(6.9%),是安全的。,36,3、气体H2/CO2/O2真养产碱杆菌等一些爆鸣气细菌能利用,4,、烷烃及其衍生物,假单胞菌能利用中等链长的烷烃或其衍生物醇、酸等产生中等链长羟基烷酸的共聚物,(PHAMCL),，共聚物中单体的组成与基质碳架的长度有关。,以辛烷作基质连续培养食油假单胞菌,(,P. oleovorans,),，稳定态细胞浓度,11.6g/l,，,PHA,的生产强度为,0.58g/Lh,，,37,4、烷烃及其衍生物假单胞菌能利用中等链长的烷烃或其衍生物醇、,（三）,PHAs,的代谢途径与调控,PHAs,的产生机理,微生物在碳源过量而其他营养如,氮、磷、镁或氧不足,时，积累大量,PHAs,作为碳源和能源的贮存物，或作为胞内还原性物质还原能力的一种储备。,当限制性营养物再次被提供时，,PHAs,能被胞内酶降解后作为碳源和能源利用。,38,（三）PHAs的代谢途径与调控PHAs的产生机理38,胞中积累的,PHAs,存在形式,以单个粒子的形态存在，每个细胞含有的颗粒数量的大小随微生物种类而不同，在,Ralstonia eutropha,中，每个细胞含有,8-10,个颗粒，每个颗粒直径大小为,0.2-0.5m,；,以非晶体形式存在。具有高度的折光性，颗粒外面包裹着一层膜，没有生物膜那样的典型双层结构，膜中含有,PHAs,合成酶的降解酶系统。,39,胞中积累的PHAs存在形式以单个粒子的形态存在，每个细胞含,Scanning electron microscope of PHB granules in,Ralstonia eutropha,40,Scanning electron microscope o,补料分批培养,45h,收获的菌体细胞的电镜照相,41,补料分批培养45h收获的菌体细胞的电镜照相41,PHAs,的代谢途径,不同微生物合成,PHAs,的途径不同，基质不同其合成途径也有差异,(,图,7-2),。,真养产碱杆菌及多数细菌从糖合成,PHB,；,深红红螺菌从糖合成,PHB,；,食油假单孢菌等从链烃、醇及酸合成具有与基质链长有关的,HA,单位的,PHAs,；,一株产碱杆菌从长链偶碳脂肪酸合成,PHB,；,铜绿假单孢菌等从糖质碳源,(,如葡萄糖酸,),合成具中链,HA,单位的,P HAs,；,真养产碱杆菌等利用糖加丙酸合成,PHBV,。,HA-,羟基烷酸,42,PHAs的代谢途径 不同微生物合成PHAs的途径不同，基质不,A,43,A43,PHAs,的生物合成和降解同时存在,的,丁酰,CoA,44,PHAs的生物合成和降解同时存在的丁酰CoA44,基因重组细菌,20,世纪,80,年代后期开始将重组,DNA,技术应用于生物合成,PHB,，来自于多种细菌的,PHA,生物合成酶,PHA,生物合成途径的关键酶，已被在分子水平进行了详细的研究，,PHA,生物合成酶基因已被克隆成功。,3,个实验室独立地将真养产碱杆菌,H16,的,PHB,生物合成基因,phbA,、,phbB,和,phbC,克隆并在大肠杆菌中表达。,45,基因重组细菌 20世纪80年代后期开始将重组DNA技术应用于,基因重组细菌,研究发现，在真养产碱杆菌中，,PHA,合成酶的结构基因排列在称为,phbC-A-B,的一个操纵子上，分别编码,PHA,合成酶、,-,酮基硫酯酶和依赖于,NADPH,的乙酰乙酰,CoA,还原酶,(,见图,7-4),。,46,基因重组细菌研究发现，在真养产碱杆菌中，PHA合成酶的结构基,三、,PHAs,的发酵生产,PHAs,实现大规模工业化生产的主要障碍是生产成本。英国帝国化学公司,(ICI),认为影响,PHAs,生产成本的主要因素有,菌种,原料,操作方式,提取方法,47,三、PHAs的发酵生产PHAs实现大规模工业化生产的主要障碍,因而降低,PHAs,的生产成本主要措施,(1),采用廉价基质,(,如,CO,2,、,H,2,和,O,2,，甲醇，乙醇，葡萄糖及来自农业废物的有机酸等,),和提高产物对基质的产率系数，降低发酵原材料的成本；,(2),提高生产强度,(,如选育高产菌株、采用合适的发酵生产方式等,),，以降低操作成本；,(3),改进提取、纯化技术,(,如不采用价格昂贵的有机溶剂、简化操作等,),，以降低提取成本。,48,因而降低PHAs的生产成本主要措施(1)采用廉价基质(如CO,PHAs,的流加发酵,选定了较适宜的菌种、基质和提取方法后，要进一步降低,PHAs,的生产成本，最主要的关键在于采取适当的发酵方式，以获得高的产物转化率、高的产物浓度。采取适宜的发酵生产方式是提高聚合物的生产率和改进其质量的关键。,49,PHAs的流加发酵选定了较适宜的菌种、基质和提取方法后，要进,PHAs,的流加发酵,在,PHAs,的生产中，通常采用分批发酵法和流加发酵法，有时用连续培养法来获得高的生产强度。,由于,真养产碱杆菌,只有在某种营养成份氮、磷或氧等缺乏而碳源过量的不平衡生长条件下才能大量积累,PHAs,，一般可将发酵过程分成两个阶段来进行控制：,第一阶段为菌体细胞的形成阶段，在此阶段微生物利用基质形成大量菌体，而多聚体,PHAs,的积累量很少；,第二阶段为多聚体形成阶段，当培养基中某种营养耗尽时，细胞进入,PHAs,形成阶段，在此阶段,PHAs,大量形成而菌体细胞基本上不繁殖。,50,PHAs的流加发酵 在PHAs的生产中，通常采用分批发酵法和,采用流加发酵法进行,PHAs,的生产时，可以在某些必须的营养成分成为生长限制性因素之前，对其进行定量流加，延长细胞的对数生长期，从而可以获得较高的菌体浓度。,51,采用流加发酵法进行PHAs的生产时，可以在某些必须的营养成分,减少菌体细胞在生长阶段积累多聚体，也需通过流加法来控制，培养液中氨离子浓度不小于,200 mg/L,，否则会降低共聚体的最终产率。,在多聚体形成阶段，限制氮源能刺激细胞积累,PHAs,，但氮源的完全缺乏会极大地损害微生物细胞的合成活性，所以将在,PHAs,合成阶段以较低的速率限量流加氮源。与分批发酵中氮源完全缺乏相比，流加发酵细胞中的,PHAs,含量增加更快。,PHAs,的流加发酵,52,减少菌体细胞在生长阶段积累多聚体，也需通过流加法来控制，培养,此外，与传统的分批发酵相比，流加发酵通常具有染菌和退化的几率小，可以获得较高的转化率，对发酵易实现优化控制等优点。,53,53,1,、采用流加培养法生产,PHB,（,1,）选择限制培养基中的氮源作为流加控制的手段，可以提高,PHB,产率；,（,2,）控制碳氮比相当重要。,54,1、采用流加培养法生产PHB54,2,、采用流加培养法生产共聚物,P(HB-CO-HV),聚羟基烷酸（,PHAs,）是一类具有广泛工业应用价值的耐热塑料，某些共聚物,PHA,比均聚物,PHB,具有更有用的热机械性能，如,PHB,较脆和发硬，而,HB,和,HV,形成的共聚物,PHA,比,PHB,的硬度降低而韧度增加。,55,2、采用流加培养法生产共聚物P(HB-CO-HV)55,在共聚物,P(HB-CO-HV),的生产过程当中，流加发酵比分批发酵具有明显优势。,丙酸和戊酸,是生产共聚物,P(HB-CO-HV),所必需的基质，由于这些有机酸对菌体细胞具有一定的毒性，故采用简单的分批发酵不可能获得高产，采用流加培养法，可以避免由于培养基中有机酸的积累而使细胞活力受到损害，从而达到提高,P(HB-CO-HV),产率的目的。,56,在共聚物P(HB-CO-HV)的生产过程当中，流加发酵比分批,另外为了减少菌体细胞在生长阶段积累多聚体，也需通过流加的方法来控制培养液中铵离子浓度不小于,200mg/L,，否则会降低共聚体的产率。,57,57,（三）流加培养条件对多聚体相对分子量的影响,多聚体的相对分子量常常影响其质量和生物降解的速度。,不同用途对生物可降解多聚体的平均相对分子质量大小要求不同，一般来说平均相对分子质量大且相对分子质量分布范围窄的多聚体具有更广泛的工业应用前景，并且提取也较为方便。,58,（三）流加培养条件对多聚体相对分子量的影响58,多聚体的平均相对分子量大小受流加培养条件的影响。当培养条件恒定时，其平均相对分子量也保持相对恒定，因而只要控制适宜的流加培养条件，就可以将相对分子量控制在所需的范围之内。,59,多聚体的平均相对分子量大小受流加培养条件的影响。,对于共聚物,P(HB-CO-HV),而言，由于大多数微生物即使在氮源和磷等因素不受限制的细胞生长阶段也能在胞内积累少量的,PHB,，因而在加入任何能激发其形成共聚体的基质时，菌体胞内已含有一些均聚物,PHB,，因而得到的是各种,HV,单体含量的共聚体的混合物。,60,对于共聚物P(HB-CO-HV)而言，,为了得到更均质的共聚体，在共聚物,P(HB-CO-HV),的积累阶段开始时，应先使培养物处于碳源饥饿状态，这样使细胞内源,PHB,的量大大降低，得到的共聚物也就较为均一。,61,为了得到更均质的共聚体，在共聚物P(HB-C,另外，共聚体中,HB/HV,单体比例依赖于流加过程中糖,/,丙酸或者丁酸,/,戊酸的比例，且基质流加速率应小于其最大可能的利用速率，以避免对细胞有毒性的基质的积累，确保产生的共聚物具有恒定的,HB/HV,比例。,62,另外，共聚体中HB/HV单体比例依赖于流加过程中糖/丙酸或者,第四节,PHAs,的提取,PHB,的提取涉及到两个方面的问题：一是方法的合理性，主要表现在提取率、产物的纯度，提取过程是否对,PHB,的结构产生影响，以及是否方便操作，预后处理是否复杂、环境是否污染等方面。二是过程的经济性，表现在提取的材料的费用、能量的消耗和设备的投资等。,63,第四节 PHAs的提取PHB的提取涉及到两个方面的问题：一是,四、,PHAs,的提取技术,有机溶剂法,次氯酸钠提取法,酶法,表面活性剂,-,次氯酸钠法,其他方法,64,四、PHAs的提取技术有机溶剂法64,1.,有机溶剂法,对于由真养产碱杆菌,(,Ralstonia eutropha,),生产,PHB,，研究初期通常采用的提取方法是有机溶剂法。包括,:,氯仿、二氯乙烷、,1,1,2,三氯乙烷、乙酸酐、碳酸乙烯酯及碳酸丙烯酯等。,原理：有机溶剂一方面能改变细胞壁和膜的通透性，另一方面能使,PHB,溶解到溶剂中，而非,PHB,的细胞物质,(NPCM),不能溶解，从而将,PHB,与其它物质分离开来。具体操作步骤如图,7-5,所示。,65,1. 有机溶剂法对于由真养产碱杆菌(Ralstonia e,图,7-5,有机溶剂提取,PHB,的过程示意图,66,图7-5 有机溶剂提取PHB的过程示意图66,(1),当溶剂中含有超过,5%(w/v),的,PHB,时，溶液变得很粘，要去掉细胞的残余物就变得很困难；,(2),提取率难以达到很高；,(3),使用大量的有机溶剂；,(4),造成严重环境污染，操作不便。,优点：,引起,PHB,的降解非常小，得到,PHB,的纯度非常高。,因此，用有机溶剂提取,PHB,通常作为一种实验室方法。,有机溶剂的方法的缺点,67,(1)当溶剂中含有超过5%(w/v)的PHB时，溶液变得很粘,2,次氯酸钠提取法,次氯酸钠能够破胞且对细胞中的,非,PHB,的细胞物质,的消化很有效，因而用该方法破胞所得产品的纯度较高、提取速度快，避免了有机溶剂提取过程中繁琐的前、后处理工作。,但是,PHB,分子量只有原来的一半。,具体操作过程见图,2,。,68,2 次氯酸钠提取法次氯酸钠能够破胞且对细胞中的非PHB的细胞,图,2,次氯酸钠提取,PHB,过程示意图,69,图2 次氯酸钠提取PHB过程示意图69,次氯酸钠提取法,优点：不使用大量的有机溶剂。,缺点：次氯酸钠对,PHB,分子有严重的降解作用，因而所获得的,PHB,的分子量较小。,70,次氯酸钠提取法优点：不使用大量的有机溶剂。70,次氯酸钠,/,氯仿提取法,改进：根据氯仿提取时,PHB,纯度高且被降解程度小，而次氯酸钠对非,PHB,细胞物质消化很有效的优点，结合,PHB,疏水亲油物质，而细胞膜具有亲水性的特点的原理，发明了用分散的次氯酸钠,/,氯仿提取,PHB,的方法。,71,次氯酸钠/氯仿提取法 改进：根据氯仿提取时PHB纯度高且,冷冻干燥的菌体,+,次氯酸钠,+,氯仿破壁 离心分离 氯仿相中加入非溶剂物质使,PHB,沉淀 离心过滤分离 烘干 成品,72,冷冻干燥的菌体+次氯酸钠+氯仿破壁,在该方法中次氯酸钠主要起破胞作用，而氯仿则对破胞产生的,PHB,起保护作用，因而不但可得到较高纯度的,PHB,，而且,PHB,被次氯酸钠降解的程度大大降低。同时由于破胞较完全，因而可以获得较好的提取收率。,73,73,优点：提取率较高，得到的,PHB,的分子量较大。,缺点：需要大量的有机溶剂，并且操作复杂，限制了工业化生产。,74,优点：提取率较高，得到的PHB的分子量较大。74,三、酶法,基本原理与次氯酸钠法相似，即让大量的,NPCM,溶解而,PHB,不溶解，从而达到分离提纯的目的。但是由于,NPCM,通常包括核酸、类脂物、磷脂、肽聚糖以及蛋白质等物质，因此实际上是通过多种酶的多步或协同作用来达到消化,NPCM,的目的。,75,三、酶法75,单独的使用酶来消化细胞中的杂质物质，所得到的,PHB,的纯度不高，往往要结合其他的方法，例如再用表面活性剂处理，才能得到较高纯度的,PHB,。该法包括细胞的热处理、酶处理和阴离子表面活性剂处理等步骤，因此操作十分复杂。,76,单独的使用酶来消化细胞中的杂质物质，所得到的PH,由于细胞杂质成分比较复杂，特别是酶作用的条件比较苛刻，需要处理的步骤较多、操作较为复杂，因此酶法的应用在提取成本、过程放大方面受到了很大的限制。,77,由于细胞杂质成分比较复杂，特别是酶作用,四、表面活性剂,/,次氯酸钠法,基本原理：当表面活性剂浓度较低时，其单个分子进入到细胞膜的磷脂双层中；随着表面活性剂浓度的增加，更多的表面活性剂分子结合到磷脂双层中，细胞膜的体积就会不断的增大；一旦磷脂双层中的表面活性剂饱和，再增加表面活性剂就会使细胞膜收到破坏，表面活性剂与磷脂形成大量的胶团，胞内,PHB,物质释放出来。,78,四、表面活性剂/次氯酸钠法78,冷冻干燥菌体表面活性剂破胞 离心过滤分离 次氯酸钠洗涤 离心过滤分离 水洗 离心过滤分离 烘干 产品,79,冷冻干燥菌体表面活性剂破胞,该方法能够比较方便的实现在水相中提取,PHB,，这是它的突出优点，但要使用大量的表面活性剂，而且次氯酸钠的使用不可避免的造成了,PHB,的降解。,80,该方法能够比较方便的实现在水相中提取PHB，这是它,五、其他方法,基因工程技术重组大肠杆菌生产,PHB,的方法，用氨水从这类细胞中提取,PHB,就是其中的一种方法。,81,五、其他方法81,各种提取,PHB,的方法比较,82,各种提取PHB的方法比较 82,（一）降解机制,1,胞内降解,胞内,PHB,的代谢是个循环过程。,图,7-9,中第四步到第七步是降解过程。首先,(,第四步,),胞内无定形,PHB,颗粒在解聚酶作用下降解，形成单体和二聚体的混合物。二聚体随之在二聚体水解酶作用下形成单体。,五、,PHAs,的生物降解,83,（一）降解机制五、PHAs的生物降解 83,图,7-9 PHB,的代谢过程,84,图7-9 PHB的代谢过程84,2,胞外降解,聚,羟基丁酸,(PHB),的胞外降解有两种机制，,在无菌条件下通过水解进行,。这种机制对于,PHB,在医疗方面的应用,(,如作为药物的缓适载体、手术缝线等,),特别重要。,在自然环境中，是酶降解机制,。许多细菌和真菌可分泌外解聚酶，有些甚至可以利用,PHB,作为唯一碳源生长。,85,2 胞外降解 聚羟基丁酸(PHB)的胞外降解有两种机制，8,（二）,PHB,在环境中的降解,影响,PHB,降解速度的因素较多,包括环境类型：微生物种群及活力，水份，温度,塑料制品性质：厚度，表面组织形态，孔隙度，制品中的第二组分,如填充料、颜料,在自然环境中，能降解,PHB,的微生物包括细菌、放线菌、和霉菌等。,J.Mergaertd,等在土壤中发现有,295,种微生物可降解,PHB,，包括,105,种革兰氏阴性菌，,36,种革兰氏阳性菌，,68,种放线菌和,86,种霉菌。,86,（二）PHB在环境中的降解影响PHB降解速度的因素较多86,研究表明，在一定的范围之内，,PHB,的降解速度与温度呈正相关，其降解可以分为两个阶段。第一阶段相对分子量下降；第二阶段是相对分子量下降到,13000,后开始腐蚀。,87,研究表明，在一定的范围之内，PHB的降,环境中有许多微生物能降解,PHB,，但每种的数量不一定很多，活力不一定很高。当,PHB,出现在环境中后，经过一定的迟滞期，能降解的,PHB,的微生物会逐渐增多，活力升高，降解的速度增快。,88,环境中有许多微生物能降解PHB，但每种,表,7-10,PHB,在环境中的降解,89,表7-10PHB在环境中的降解89,通常情况下，,PHB,厌氧降解比有氧降解快,真养产碱杆菌在厌氧条件下，主要代谢产物是乙酸和,R3,羟基丁酸，乙酰,CoA,转变成乙酸的同时生成,ATP,。,而在有氧情况下，乙酰,CoA,完全分解成,CO2,和,H2O,，产生,12,个,ATP,。,与,PHB,相比较，有较长侧链的,PHA,在环境中降解速度较慢，因为低分子量的有机化合物离子化速度比结构复杂的要快，并且长侧链的重复单元增加了,PHA,的疏水性，抑制或阻碍了微生物在聚体表面的生长。,PHB,在环境中的降解,90,通常情况下，PHB厌氧降解比有氧降解快PHB在环境中的降解9,六、,PHAs,工业化和研究进展,(,一,),影响,PHAs,工业化的因素,(,二,),国内外研究,PHAs,的水平,(,三,),研究进展,91,六、PHAs工业化和研究进展(一)影响PHAs工业化的因素9,(,一,),影响,PHAs,工业化的因素,PHAs,早在,20,世纪,60,年代就已引起了人们的广泛关注,在过去几十年中，有数家公司一直在探索,PHB,工业生产的可能性。,1962,，,Baptist,在美国申请了有关,PHB,生产的专利。,20,世纪,80,年代初，,ICI,公司和奥地利生物技术有限公司等将微生物合成,PHAs,的研究推向试生产阶段。,92,(一)影响PHAs工业化的因素PHAs早在20世纪60年代就,1982,年，,ICI,公司使用真养产碱杆菌突变株为生产菌种，以葡萄糖为惟一碳源，在,35m3,气升环流反应器及,200m3,机械搅拌反应罐内试生产,PHB,成功，并以葡萄糖加丙酸为碳源生产聚,-,羟基丁酸和聚,-,羟基戊酸无序共聚物,P(HB-co-HV),。,PHB,价格：,33,美元,/kg5.58,美元,/kg,左右,聚丙烯的价格,(1,美元,/kg),降低,PHAs,的生产成本：菌种、发酵方式、提取方法。,93,1982年，ICI公司使用真养产碱杆菌突变株为生产菌种，以葡,94,94,(,二,),国内外研究,PHAs,的水平,国内外的研究内容主要集中于：,微生物菌种的改良；,发酵生产技术研究，流加发酵控制技术、高密度细胞培养技术；,新型反应器研制，提高传氧效率、降低能耗；,产品提取工艺开发，降低成本，采用非有机溶剂提取方法。,95,(二)国内外研究PHAs的水平国内外的研究内容主要集中于：9,国内外从事,PHAs,研究机构,国外英国,ICI,公司、韩国现代科学技术研究所,(KAIST),、奥地利生物技术公司和日本名古屋大学等。,国内起步于,20,世纪,80,年代的中后期。中科院微生物所、山东大学、北京农业大学和无锡轻工大学等。中国科学院微生物所、清华大学生物系和化工系均已有批量生产技术。但在,PHB,提纯方面，目前尚未达到应用水平。,96,国内外从事PHAs研究机构国外英国ICI公司、韩国现代科学技,(,三,),研究进展,改性,共聚,官能化：如靠原子的引入有可能提高,PHAs,的绝缘性能，降低材料的表面张力，使,PHAs,有较高的润滑性、耐热性和耐油性。,结构设计：不同的菌种、改变培养条件，可以调节,PHAs,的组成,采用廉价底物,构建自溶性,PHAs,生产菌种：噬菌体,转基因植物,97,(三)研究进展改性97,植物生产,PHB,利用细菌发酵生产的,PHB,价格较高。为降低成本，人们研究利用植物资源生产,PHB,。相对微生物而言，植物更象一个大加工厂，更适于生产复杂、多样且具特殊用途的塑料原料。目前，人们利用生物工程技术已将关键酶基因导入拟南芥、油菜和向日葵等植物中，从这些转基因植物的细胞质或质体中获得,PHB,。由于植物生产便于,PHB,的分离提纯，降低了成本，因此，利用转基因植物生产,PHB,使开发生物降解塑料前景广阔。,98,植物生产PHB利用细菌发酵生产的PHB价格较高。为降低成本，,