中药指纹图谱课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五章,中药指纹图谱,第五章中药指纹图谱,1,本章学习要求,掌握中药指纹图谱分析及评价,熟悉中药指纹图谱研究程序及技术要求,了解中药指纹图谱测定方法,本章学习要求掌握中药指纹图谱分析及评价,2,淫羊藿HPLC图谱,12批次淫羊藿HPLC的指纹图谱及其共有模式,淫羊藿HPLC图谱 12批次淫羊藿HPLC的指纹图谱及其共,3,淫羊藿对照指纹图谱,淫羊藿对照指纹图谱,4,第一节 概 述,定义:,中药指纹图谱是指中药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药特性的,共有峰,的图谱，是一种新的中药质量控制模式。,中药指纹图谱的基本属性：,整体性和模糊性,。,整体性：强调多个成分（共有指纹峰）的相对稳定的比例、,排列顺序及相互的牵制，反映的质量信息是综合的。,模糊性：中药化学成分复杂性+次生代谢产物化学成分不确,定性，具有无法精密度量的模糊性。,第一节 概 述定义: 中药指纹图谱是指中药经适,5,指纹图谱分析：强调准确的辨认，而不是精密的计算。,图谱比较：强调的是相似性，而不是相同。,特点：,(1),通过指纹图谱的特征性，能有效鉴别中药的真伪,。,(2),通过指纹图谱主要特征峰的面积和比例的制定，能有效控制中药质量，保证中药质量的相对稳定。,指纹图谱分析：强调准确的辨认，而不是精密的计算。,6,中药指纹图谱的研究成为当前我国中药基础研究的重,要领域与热点，研究侧重于:,中药指纹图谱的理论探讨；,测试指纹图谱的规范化试验；,构建指纹图谱的方法学研究；,指纹图谱信息化和知识化研究；,指纹图谱在提高中药质控指标方面的研究；,指纹图谱指导中药材规范化生产方面的研究；,指纹图谱在开发中药资源方面的研究；,指纹图谱用于研制中药新药等方面的研究。,中药指纹图谱的研究成为当前我国中药基础研究的重,7,一、指纹图谱的产生与发展,(一) 指纹图谱的产生,指纹(fingerprint)概念起源于法医学，依据每个人的指纹结构上细微处的绝对差别可以鉴识区分不同的人。法医学的,指纹分析强调的是个体的绝对唯一性(absolute uniqueness)。,近代指纹分析的概念结合生物技术的发展延伸到指纹图谱分析，而且应用范围从犯罪学扩大到医学和生命科学的领域。,生物样品的指纹图谱分析强调个体的唯一性，侧重于整个物种的唯一性。,一、指纹图谱的产生与发展 (一) 指纹图谱的产生,8,中药指纹图谱分析借用法医学“指纹鉴定”的概念，但又不同于常规意义的“指纹”含义。根据中药化学成分的复杂性（或模糊性）和有效成分的整体性，在现阶段还不可能将中药复杂化学成分搞清楚的情况下，运用多学科交叉综合技术手段，进行计算机辅助分析检测和评价，,寻找同一药材群体化学成分的相似性，即物种群体内的唯一性。,通过建立中药指纹图谱，可以全面反映中药所含内在化学成分的种类和数量，进而反映中药的质量。,中药指纹图谱分析借用法医学“指纹鉴定”的,9,中药指纹图谱是以各种波谱、色谱等技术为依,托，是一种综合的、可量化的鉴别中药的手段，是,当前评价中药真实性、稳定性和一致性的质量控制,模式之一。,建立的中药指纹图谱应满足专属性、重现性,和实用性的技术要求。,中药指纹图谱是以各种波谱、色谱等技术为依,10,1.指纹图谱的发展阶段：,初级阶段:,是确立指纹图谱的建立方法及相似度判定。,研究重点主要是测定方法的建立，方法稳定性和适用性考察，化学有效部分基础研究，图谱多指标控制等，力求基本说清中药化学基础及质量控制参数，将中药质量控制提到整体量化的高度。,(二) 指纹图谱的发展现状,1.指纹图谱的发展阶段：(二) 指纹图谱的发展现状,11,高级阶段:,即指纹图谱特征和药效相关性研,究，指纹图谱的生物等效性研究。,中药指纹图谱的研究向多学科的相互渗,透、从单指标向多指标（多维多息）的综合,发展，最终建立体现谱效关系的指纹图谱，,确保中药安全、有效和可控。,高级阶段: 即指纹图谱特征和药效相关性研,12,国内，目前还处在初级阶段。,1.针对中药注射剂这一相对简单的体系，进行大量研究和深入探讨。,2.利用指纹图谱手段表征中药注射剂的特性，表达成品的质量，以达到控制工艺操作和原药材的目的，利用指纹图谱追寻工艺操作中的问题和实现对原药材GAP的质量要求。,3.通过对大量注射剂的指纹图谱研究，建立系统的测定方法和全面的指标控制参数，寻找一定的数学模型，最终达到指纹图谱的可操作，可控，稳定，显性和量化的目的，提高整个中药注射剂的质量控制水平。,4.逐步建立其它类中药制剂，中药复方制剂的指纹图谱。,国内，目前还处在初级阶段。,13,在国外，指纹图谱在植物药产品工业指南（2000年草案稿）、草药评价指南（1996年）以及英国草药典（1986）、印度草药典（1998）、美国草药典（1999-2001，Monographs）中均将其列入。目的是解决多数草药有效成分不明，市场商品无法有效鉴别真伪和控制质量的问题。,要求草药制剂生产商提供半成品的指纹图谱以保证品种的真实性和产品的指纹图谱以证明其批间产品质量的一致和稳定。,在国外，指纹图谱在植物药产品工业指南,14,2.指纹图谱的分类,指纹图谱可按应用对象、测定手段进行不同的分类。,按应用对象分类：,中药材(原料药材)指纹图谱,中药原料药(包括饮片、配伍颗粒)指纹图谱,中药中间体（工艺生产过程中间产物）指纹图谱,中药制剂指纹图谱,2.指纹图谱的分类指纹图谱可按应用对象、测定手段进行不同,15,按测定方法分类:,中药化学指纹图谱,指纹图谱系指采用色谱、光谱和其他分析方法建立,的用以表征中药化学成分的特征的指纹图谱。中药化,学指纹图谱对控制中药质量具有更直接、更重要的意,义。,色谱指纹图谱：,TLC、GC、GC-MS、HPLC、HPLC-MS等,光谱指纹图谱：,UV、IR、FP、NMR、MS等,按测定方法分类:,16,中药生物指纹图谱,包括：中药材DNA指纹图谱,中药基因组学指纹图谱,中药蛋白组学指纹图谱,中药材DNA指纹图谱主要是测定各种中药材的DNA图谱，,由于每个物种基因的唯一性和遗传性,，中药材DNA指纹图谱,可用于对中药材的种属鉴定、植物分类研究和品质研究。它,对中药材GAP基地建设、中药材种植规范(SOP)、选择优良种,质资源和药材道地性研究极为有用。,中药生物指纹图谱,17,中药基因组学图谱和中药蛋白组学指纹图谱系指用中药作用于某特定细胞或动物后，引起的基因和蛋白的复杂的变化情况，这两种指纹图谱可称为,生物活性指纹图谱。,中药蛋白组学指纹图谱是指纹图谱研究的最高级,阶段，可确定中药的主要活性物质。,中药基因组学图谱和中药蛋白组学指纹图谱系指用中药作用于某特定,18,第二节 中药指纹图谱测定方法,一、色谱法,色谱技术具有极强的分离能力和极大的适应性，,中药指纹图谱首推色谱法,，其常用的方法有：,TLC、GC、,HPLC、,HPCE、SFC等。,第二节 中药指纹图谱测定方法 一、色谱法,19,1.薄层色谱(TLC)：,可离线、展开剂灵活多选、色谱后衍生,TLC独具的优势是提供直观形象的可见光或荧光图像，较柱色谱多了色彩这一可比“参数”，并可进一步配合色谱扫描或数码处理得到不同层次轮廓图谱和相应的积分数据。,用固定波长对薄层展开的各斑点进行扫描得到扫描图谱，比目测的薄层图谱更为客观准确，还可计算各峰的峰面积与标准峰的比作量化指标，具有指纹意义,。,现代薄层色谱技术：如高效薄层色谱（HPTLC）、 TLC-GC、 TLC-IR,1.薄层色谱(TLC)：可离线、展开剂灵活多选、色谱后衍生T,20,中药指纹图谱课件,21,中药指纹图谱课件,22,2.气相色谱(GC)：,外界影响因素较少，稳定性较好，检测设备可选性,较大。适用于含挥发性成分中药的指纹图谱的研究和,应用。,新技术：如毛细管气相色谱（CGC）、气相色谱质谱联用（GC-MS）、气相色谱傅里叶变换红外光谱联用（GC-FTIR）等，其中最引人注目是裂解气相色谱（,用于不能直接使用GC分析的样品,）。,2.气相色谱(GC)：,23,3.高效液相色谱(HPLC)：,稳定性和重现性好、流动相选择性广、检测器种类多、色谱柱可反复使用等特点，样品适用范围广。目前已成为构建中药指纹图谱最主要和常用的方法。,3.高效液相色谱(HPLC)：,24,新的高效通用检测器的发展，如二极管阵列检测器（DAD）、蒸发光散射检测器（ELSD）、电喷雾电离-质谱（ESI-MS）、质谱-质谱（MS-MS）等设备的引入，使得HPLC适用性与分辨率显著提高，从而使复杂样品的分析成为可能，还可对主要色谱峰进行归属。,新的高效通用检测器的发展，如二极管阵列,25,注射用双黄连指纹图谱,注射用双黄连指纹图谱,26,相关性,相关性,27,4.高效毛细管电泳（HPCE）,适用于大部分化学成分，特别是生物大分子肽和蛋白的分离，,能实现大小分子(如蛋白质和氨基酸)同时分析,，得到的指纹图谱能更多的反映中药的成分特性，如动物类中药的指纹图谱研究。,4.高效毛细管电泳（HPCE）,28,中药指纹图谱研究中最常用的两种模式：毛细管凝胶电泳(CGE)、胶束电动毛细管色谱(MECC)。,重现性可通过采用淌度比法、对照品校正法、保留指数法等加以提高。,中药指纹图谱研究中最常用的两种模式：毛细管凝胶电泳(CGE),29,二、光谱法,光谱法是指用一定波长的光照射或扫描中药样品，取得特定的图谱和数据。其主要方法有：,UV、IR、FS、NMR、MS、AAS等。,二、光谱法 光谱法是指用一定波长的光照射或扫描中药样,30,1.紫外-可见光谱法（UV-VIS）,指纹图谱的构建,：是多种成分特征吸收光谱叠加而成的复合谱。在一定条件下，中药多成分的复杂组合也有一定规律性，从而在紫外叠加光谱上显示出一定的特异性和稳定性。,光谱特征分析,：最大吸收波长、最小吸收波长、肩峰、吸收系数、吸收度比值、吸收峰的数目、峰形、峰高等。,如果中药亲缘相近而紫外光谱不易区别，可采用多阶导数光谱法提高分辨率。,1.紫外-可见光谱法（UV-VIS）,31,2.红外光谱（IR）,指纹图谱的构建,：是多种成分在红外光区域内(4000400cm,-1,)总体官能团吸收的叠加。,图谱分析,：主要着眼于所测得的红外光谱的轮廓特征（全谱图形）的比较，不用将各主要吸收峰归宿，只要在所扫描的波数范围内比较吸收峰的波数、同一波数吸收峰的形状和强度、“指纹区”面貌等方面的差异即可。,新技术,：如傅里叶变换红外光谱（FTIR）、二维相关红外光谱（2D FTIR）、近红外光谱（NIR）、傅里叶变换拉曼光谱（FT-Raman）等。,2.红外光谱（IR）,32,3.核磁共振波谱法（NMR）,在规范的提取分离条件下，植物类中药的,1,H-NMR图谱与植物品种间存在着严格的对应关系。可通过对,1,H-NMR指纹图上显示特征共振信号(如化学位移、峰面积、耦合关系等)的分析，来建立中药的,1,H-NMR指纹图谱。,3.核磁共振波谱法（NMR）,33,4.质谱法（MS）,质谱是按照带电粒子（即离子）的质量对电荷的比值（m/z）和其相对丰度大小依次排列形成的图谱。,中药特征提取物置质谱仪中进行电子轰击裂解为不同的碎片，获得提取物中化学成分的MS图，不同中药所含化学成分的种类及组成比例的不同，所得质谱图显示的分子离子峰及进一步裂解的碎片离子峰（m/z）亦不一致，故质谱具指纹性较强的特征，可用于中药指纹图谱的测定。,4.质谱法（MS）,34,三、联用技术,中药复方制剂成分复杂采用联用技术建立,多维多息,特征谱，可较好地解决如何体现中药复方制剂的整体性和复杂性的问题。,所谓多维，,即采用多种分析仪器联用的方式来测定指纹图谱，各谱图间相互补充，可对复杂供试品有更清晰完整的认识。常用的是HPLC或CEDADMS-MS)，所得的多维指纹图谱包括色谱峰图，UV图；一级质谱图(各个成分的质量)和二极质谱图(某成分的特征碎片)。,（可得到更多的化学结构信息）,三、联用技术中药复方制剂成分复杂采用联用技术建立多维多息特征,35,所谓多息，,即指中药复方制剂的特征谱，包括化学和药效两方面的信息。,药效信息,即化学成分和药效相关性，是通过确定中药复方制剂中的各有效部位(药效实验肯定的化学部分) 和其所含的有效成分(各种化合物)间量的比例，,从这些比例变化来推算药物的量效关系。,多维多息特征谱的建立既能较系统、较完整地解决中药复方制剂面临的保证药效和质量的问题，又为中药研究中缺乏标准物质的问题提供了一种新的解决途径。,所谓多息，即指中药复方制剂的特征谱，包括化学和药效两方面的信,36,第三节 中药指纹图谱研究程序及技术要求,一、指纹图谱的要求（三性要求）,中药指纹图谱应满足,特征性(专属性或唯一性),、,重现性,和,可操作性,的要求。,第三节 中药指纹图谱研究程序及技术要求一、指纹图谱的要求（,37,首先具备专属性或唯一性。能够表达某品种特征的性质。,在满足,专属性前提下,要有较好的重现性，指同一品种的同一样品，同一操作条件下，结果的重现性要好，即不同实验室和不同操作者得到的色谱整体特征应有较高的相似度(0.9以上)。,具有可操作性。指针对不同用途，选用不同分析方法来达到不同的要求，选择的方法和试验条件应便于推广和便于操作，要有普遍适用性。,首先具备专属性或唯一性。能够表达某品种特征的性质。,38,当一张指纹图谱不足以表现其全部特征，可用,几张指纹图谱,来表现某种中药(药材或复方)的各个不同侧面的特征，从而构成其全貌。对每一张图谱都应有其特征性。,当一张指纹图谱不足以表现其全部特征，可,39,指纹图谱II (203nm),指纹图谱I (280nm),丹参滴丸多元HPLC指纹图谱,指纹图谱II (203nm)指纹图谱I (280nm)丹参滴,40,中药未知检品,图谱测试、分析,品质评价,方法检验,评价标准,计算,机信,息处,理图,谱评,价,不同品种来源、产地、采收期或加工炮制的中药,药效学试验,中药指纹图谱,确定图谱参数,选择测试条件,方法建立及考察,10批次以上中药样品,固定品种来源、产地、采收期和加工炮制的中药,代表性,均一性,预处理,供试品溶液,预处理,图谱信息,图谱分析,相关性,二、 指纹图谱的研究程序,图5-1 中药指纹图谱的构建程序示意图,中药未知检品 图谱测试、分析方法检验评价,41,样品收集：,要求有一定的数量，以保证供试品的,代表性和均一性,方法建立,：指选取适当的方法建立指纹图谱并进行考察,数据分析：,对研究过程中所获得数据进行处理，找出,共性和不同点，,确定评价指标,样品评价：,指按所确定指标对样品进行品质评价,方法检验 ：是指在方法确立后的一段长时间内对更多未知样品进行检验，进一步考察方法的可行性和实用性。,样品收集：要求有一定的数量，以保证供试品的代表性和均一性,42,（一）样品收集,样品收集是研究指纹图谱最初也是最关键,的步骤，收集的样品要,有足够的代表性,。要求,收集,10批次以上,的样品。,样品数越多越好，使,得到的指纹图谱更具生物统计学意义。,（一）样品收集,43,注意：,收集药材样品“批次”，其含义与工业产品“批次”的含义是完全不同的，,它是指相互独立的样品，即不能将同一地点或同一渠道同一时间获得的样品分成若干批次样品,。,不同产地或同一产地不同等级规格的样品，均可视作不同批次。,同一产地的样品，存在不同的种植园和地块之差异，也均可视作不同批次。,注意：收集药材样品“批次”，其含义与工业产品“批次”的含义是,44,1样品收集的基本要求,（1）药材样品首先要经品种鉴定，中药材及其饮片或炮制品，应符合国家药典、部颁标准、地方标准或饮片炮制规范的规定。样品应选用正品优质道地中药材，或选用规范化栽培基地生产的中药材。,中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）,1样品收集的基本要求中药注射剂指纹图谱研究的技术要求,45,(2)动、植物药材样品均应固定品种、药用部位、产地、采收期、产地加工和炮制方法，矿物药材样品应固定产地和炮制、加工方法。对于多品种来源或多药用部位的中药材，应固定单一品种或单一药用部位，同时要进行不同品种来源或不同药用部位的代表性样品指纹图谱分析比较，找出各品种或各药用部位之间指纹图谱的共性和特性，,采用其共性指纹标定该种药材的质量，特征指纹标定药材的品种或药用部位和该品种或药用部位药材的质量。,通常固定一个产地或一个采收季节，如固定多个产地或多个采收季节，必须考察不同产地或不同采收季节的代表性样品指纹图谱的一致性。,中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）,(2)动、植物药材样品均应固定品种、药用部位、产地、,46,(3)样品应保证其真实性，应有完整采样原始记录，内容包括：,药材名称： 药材名及其基源（原植、动物的科名、中文名、拉丁学名及药用部位，或矿物的类、族、矿石名及主要成分）,样品来源： 真实记录样品来自何处，传统产地收集或是资源丰富的产地收集，或者来自GAP基地供应；还是产地购买、市场购买或委托购买等，以便于生产原料的采购选择和测试数据的可追溯。,收集时间及收集人： 样品收集时间及收集人姓名。,货源情况调查： 货源是否充足和稳定等。,中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）,(3)样品应保证其真实性，应有完整采样原始记录，内容包括：中,47,基源鉴定及鉴定人： 产地或GAP基地收集的药材结合植物形态鉴定品种。如缺原植物，由熟练的专业人员凭性状或显微特征鉴别。商品混乱的品种产区的选择应缩小范围，并结合资源选用药典收载品种中的一种。复方制剂中的君药及处方量大的药材必需重点注意品种的鉴定，以避免今后执行指纹图谱过程中出现难以预料的困难。,中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）,基源鉴定及鉴定人： 产地或GAP基地收集的药材结合植物形,48,质量评估： 为了便于对色谱的正确分析，减少试验结果的判断误差，首先药材需符合药典或部颁标准规定，并详细记录。所有药材样品均须编号，必要时附药材外形照片。,样品的留样、贮藏和标签： 由于指纹图谱研究周期较长，样品必须在干燥、低温、避光处贮藏，标签必须有编号，收集样品的编号应与贮藏样品、试验样品的编号一致。留样数量应不少于试验实际用量的3倍。以保证试验结果有异议时的可追溯。,中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）,质量评估： 为了便于对色谱的正确分析，减少试验结果的判断,49,（二）供试品溶液制备,根据中药中所含化学成分的理化性质和检测方法的要求，选择适宜的制备方法。,制备方法必须确保中药中的主要化学成分或有效成分在指纹图谱中得以体现。,（二）供试品溶液制备 根据中药中所含化学成分的,50,1. 原药材、饮片或提取物供试品溶液的制备,建立原药材指纹图谱的主要目的:,考察原药材本身的质量情况；,以原药材的指纹图谱为参比，提取物及制剂的指纹图谱与之比较，以考察制剂与原药材的相关性。,中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）,1. 原药材、饮片或提取物供试品溶液的制备中药注射剂,51,2. 半成品(中间体)供试品溶液的制备,根据提取物或中间体中所含化学成分的理化性质和检测方法的要求，参考制剂和相关产品制备工艺，选择适宜的方法进行制备。,中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）,2. 半成品(中间体)供试品溶液的制备中药注射剂指纹,52,3. 各类制剂和相关产品供试品溶液的制备,建立中药成品指纹图谱的目的是控制最终产品中的成分，使批与批之间能保持稳定和一致，确保成品的质量。,可采用直接使用、稀释或者溶剂提取的方式制备相应的供试品溶液。,中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）,3. 各类制剂和相关产品供试品溶液的制备中药注射剂指,53,(三) 对照品(参照物)溶液制备,建立指纹图谱应设立参照物或参照峰。,对照品作为参照物：常为供试品中主要成分,内标物作为参照物,稳定的指纹峰,制备：根据检测方法的需要，选择适宜的方法进行。,(三) 对照品(参照物)溶液制备 建立指纹图谱,54,(四)指纹图谱试验研究,指纹图谱试验方法和试验条件的优选，是通过比较试验，从中选取相对简单易行的方法和条件，获取足以代表品种特征的指纹图谱，以满足指纹图谱的专属性、重现性和可操作性的要求，并须经过方法学验证。,(四)指纹图谱试验研究 指纹图谱试,55,首选色谱方法，其中HPLC,法适用范围广，对含生物碱、蒽醌、黄酮、有机酸、酚类、木脂素等成分的中药均可采用。,提取条件、色谱条件需进行优化，使供试品中所含成分尽可能地被提取并获得分离，即,分得的色谱峰越多越好,，使中药的内在特性都显现出来，为中药指纹图谱评价及其品质鉴定提供足够的信息。,首选色谱方法，其中HPLC法适用范围,56,(五)样品测试及方法学验证,中药材样品按优化的提取分离方法制备供试品溶,液，在优化的色谱条件下进样测试,。,为了验证测试结果的可靠性，,仪器精密度、供试品稳定性、实验方法重复性,必须经过严格的方法学,验证。,(五)样品测试及方法学验证,57,1. 精密度试验：,主要考察仪器的精密度。取同一供试品溶液，,连续进样5次以上,进行检测，,各共有峰峰面积比值的,RSD3，,各共有峰的相对保留时间应在,平均相对保留时间1min内,。,或用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，,相似度应大于0.9,。,1. 精密度试验：,58,2.稳定性试验：,主要考察供试品的稳定性。取同一供试品溶液，分别在不同时间（0、1、2、4、8、12、24、36、48h）检测，,考察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性，确定检测时间。,或用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，,相似度应大于0.9,。,2.稳定性试验：,59,3.重复性试验：,主要考察实验方法的重复性。取同一批号的样品,5份以上,，分别按照选定的提取分离方法制备供试品溶液，并在选定的色谱条件下进行检测，,各共有峰峰面积比值的,RSD3，,各共有峰的相对保留时间应在,平均相对保留时间1min以内,。或用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，,相似度应大于0.9,。,3.重复性试验：,60,指纹图谱的记录时间：采用HPLC或GC法,一般为60min,。但,实验中，应记录2小时的色谱图，考察1小时以后的色谱峰情况，以确定记录时间。,指纹图谱的记录时间：采用HPLC或GC法一,61,六、指纹图谱的建立和辨认,根据足够样品数（10批次以上）测试结果所给出的峰数、峰值（积分值）和峰位（保留时间）等相关参数，确定共有指纹峰（相对保留时间、峰面积比值），选取特征指纹峰群（色谱峰组合），制定指纹图谱。采用阿拉伯数字标示共有峰，,用“S” 标示参照物峰。,六、指纹图谱的建立和辨认 根据足够样品数（10,62,中药材指纹图谱要对不同产地、不同等级规格,或不同采收季节等的代表性样品进行分析比较，,从中,归纳出中药材共有的、峰面积相对稳定的色谱峰作为,特征指纹峰。,对于多来源的中药材，必须考察品种间,的特异性。,再将药材、半成品、成品之间的图谱进行比较。,中药材指纹图谱要对不同产地、不同等级规格,63,指纹图谱的辨认应注意指纹特征的整体性，从,整体的角度综合考虑，注意各具有指纹意义的谱峰,之间相互的依存关系。,指纹图谱的评价指标是供试品指纹图谱与该品,种对照用指纹图谱(共有模式)及供试品之间指纹图,谱的相似性。,相似性比较可以用“,相似度,”表达，一般指纹图,谱相似度计算结果在,0.91.0,(或以90100表示)之间,即符合要求。,指纹图谱的辨认应注意指纹特征的整体性，从,64,指纹图谱的相似性从两个方面考虑:,色谱的整体“面貌是否相似，以判断样品的真实性；,供试品与对照样品或“对照用指纹图谱”之间及不同批次样品指纹图谱之间,总积分值作量化比较,，如总积分面积相差较大(如20%)，则说明同样量的样品含有的内在物质有较明显的“量”的差异，这种差异是否允许，应视具体品种、具体工艺的实际情况，并结合含量测定项目综合判断。,这种比较应在同一台仪器平行进行测定。,指纹图谱的相似性从两个方面考虑:,65,第四节 中药指纹图谱分析及评价,根据指纹图谱所获取的信息，建立指纹图谱分析比较的重要参数，如共有峰、重叠率、n强峰、特征指纹等；计算特征指纹的相似率与差异率，进行指纹图谱评价；应用主成分分析、,聚类分析,、人工神经网络或,相似度分析,等计算机技术，进行解析、识别图谱信息以及图谱相似度评价，以建立可行、实用的HPLC指纹图谱量化评价标准。,第四节 中药指纹图谱分析及评价 根,66,一、重要参数的建立,1. 共有指纹峰,中药指纹图谱中，,多个样品所具有的相同相对保留值的色,谱峰，,即为共有指纹峰。,(1) 指纹峰的相对保留时间：,相对保留时间=tR/tRs。,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,没食子酸,大黄素,图5-2 大黄HPLC指纹图谱,一、重要参数的建立 1. 共有指纹峰123456,67,(2) 指纹峰面积比值：,指纹峰面积比值=A/As,各共有指纹峰的面积比值必须相对固定。,未达基线分离的共有峰，以该组峰的总峰面积,计，同时标定该组各峰的相对保留时间。,非供有峰：,供试品的图谱与指纹图谱比较，共有指纹峰以外的相对保留值不同的色谱峰。,(2) 指纹峰面积比值：指纹峰面积比值=A/As,68,2. 重叠率,中药供试品图谱与指纹图谱中的共有峰数乘以2，占有两者色谱峰总数的百分率，称为重叠率。其计算公式为：,重叠率反映指纹图谱的相似程度，重叠率愈大，指纹图,谱愈相似。,在实际工作中，应根据具体情况，给重叠率规定一,个合理的区间范围。,重叠率是重要的定性依据，为中药品种鉴,定提供了可靠的证据。,2. 重叠率 中药供试品图谱与指纹图谱中,69,3.,n,强峰,n,强峰应视实际的出峰情况、峰面积值而定。n值取决于：,(1),n,强峰一般以总峰数的1/51/3为宜；,(2),n,个强峰总峰面积之和应占整个峰面积之和70%以上。,应注意,n,强峰中各色谱峰在中药供试品中出现的频次和所列的次序。,n,强峰反映了中药供试品中各主要成分的相对含量的情,况，是评价中药质量提供重要的信息和依据。,3. n强峰,70,4. 特征指纹峰,所有供试品图谱中均存在的色谱峰,，可以认为,它们是,该中药品种所特有,，故又称之为,特征指纹峰,。,特征指纹,是指由,一系列特征指纹峰所组成的固定,峰群,，从多组分的角度来反映中药内在特征，为原药,材或饮片品种鉴定，特别是同属不同种或含相同有效,成分不同种的药材的鉴别，提供更多更细致的信息和,依据。,4. 特征指纹峰,71,二、特征指纹的相似率与差异率,相似率与差异率是一个表示中药供试品图谱与指纹图谱间相似程度的数值，它将定性信息与定量数据综合于一体，作为最终鉴定的重要依据。,相似率,是以特征指纹为基础，求出中药供试品图谱与指纹图谱之间的相似程度，通过它可显示出两者在特征指纹上的相似性。首先计算每个特征指纹峰间的相似率，其计算公式为：,式中 A,i,供,为供试品图谱中某特征指纹峰峰面积值；,A,i,指,为指纹图谱中某特征指纹峰峰面积值；,二、特征指纹的相似率与差异率 相似率与差异率是,72,式中:,n,表示特征指纹峰的总数；,为求和符号。,特征指纹总相似率应等于或小于1，当相似率等于1时，表,示两者完全相同；当小于1时，则表示两者的相似程度。若相,似率大于1，则失去计算相似率的意义。,然后对所有的特征指纹峰相似率求和计算特征指纹总相似率，其计算公式为：,式中: n表示特征指纹峰的总数； 然后对所有,73,差异率,是以供试品图谱中每个特征指纹峰与其相应的指纹,图谱中特征指纹峰的峰面积值间的差与指纹图谱中该特征指纹,峰的峰面积值的比值，,表示该特征指纹峰的差异程度。,特征指,纹总差异率是将每个特征指纹峰的差异率求和即得，显示出两,者在特征指纹上的差异性。其计算公式为：,差异率是以供试品图谱中每个特征指纹峰与其相应的,74,第五节 中药指纹图谱研究实例,例1 中药大黄指纹图谱研究,(一) 基源,为蓼科植物掌叶大黄,Rheum Palmatum,L.、唐古特大黄,Rheum tanguticum,Maxim. ex Balf.或药用大黄,Rheum officinale,Baill.的干燥根及根茎。,(二) 产地,掌叶大黄主产于甘肃、青海、西藏、四川等地；唐古特大黄主产于青海、甘肃、西藏及四川等地。二者商品均称为“西大黄”、“北大黄”。药用大黄主产于四川、贵州、云南、湖北、陕西等地，商品称为“南大黄”、“川大黄”。商品以掌叶大黄产量大，唐古特大黄次之，药用大黄少见。,第五节 中药指纹图谱研究实例例1 中药大黄指纹,75,据产地考察及调查，甘肃庄浪、礼县大黄种植面积约6666.67km,2,，年产量约5万吨，资源十分丰富。,甘肃主产区大黄资源分布图,据产地考察及调查，甘肃庄浪、礼县大黄种植面积,76,(三) 化学成分,主含蒽醌类成分：大黄酸(rhein)、大黄素(emodin)、大黄酚(chrysophanol) 、芦荟大黄素(aloe-emodin)、大黄素甲醚(physcion)、番泻苷A、B、C、D、E、F(sennoside A、B、C、D、E、F)、大黄酸-8-葡萄糖苷(rhein-8-mono-D-glucoside)、大黄素甲醚葡萄糖苷(physcion monoglucoside)、芦荟大黄素葡萄糖苷(aloe-emodin monoglucoside)、大黄素葡萄糖苷(emodin monoglucoside)、大黄酚-1-葡萄糖苷(chrysophanol-1-monoglucoside)。还含苯丁酮苷类、鞣质及相关的多元酚类等成分。部分蒽醌及没食子酸化学结构式如下：,(三) 化学成分,77,R,1,R,2,大黄素 CH,3,H,大黄酚 CH,3,OH,芦荟大黄素 CH,2,OH H,大黄酸 COOH H,大黄素甲醚 CH,3,OCH,3,R1,78,1010,番泻叶苷A R=COOH threo,番泻叶苷B R=COOH erythro,番泻叶苷C R=CH,2,OH threo,番泻叶苷D R=CH,2,OH erythro,没食子酸,79,(四) 实验仪器和材料,仪器:,Agilent1100液相色谱仪，DAD检测器；,样品:,大黄采自甘肃省华亭、庄浪、礼县、宕昌四县，共15份样品，采集时间为2001年11月，经品种鉴定为掌叶大黄。,对照品:,没食子酸(gallic acid)、大黄素(emodin)均由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用，纯度分别为98.14%、99.02%。,试剂:,乙腈（美国Tedia公司，色谱纯）、甲醇（上海化学试剂有限公司，分析纯；Tedia公司，色谱纯）、冰醋酸（南京化学试剂一厂，分析纯）、重蒸去离子水（实验室制备）。,(四) 实验仪器和材料,80,(五)供试品溶液制备,精密称取大黄供试品粉末(过20目筛) 2g，加入甲醇50ml，水浴(80)加热回流1h，滤过。残渣加甲醇50ml，水浴(80)加热回流1h，滤过，合并两次滤液。置蒸发皿中，水浴挥去部分溶剂，加甲醇溶解并定容至25ml。用微孔滤膜（孔径为0.45,m）滤过，滤液作为供试品溶液。,(六)参照物溶液制备,精密称取没食子酸、大黄素对照品各5mg，用甲醇溶解并定容至25ml，配成0.2mg/ml的溶液，再将该溶液稀释10倍，作为参照物溶液。,(五)供试品溶液制备,81,(七)色谱条件,色谱柱:Inertsil,ODS-3分析柱(250mm,4.6mm，5,m),流动相: (A)1%HAc-H,2,O与(B)1%HAc-CH,3,CN梯度洗脱,055min B（）025,5575min B（）2555,7590min B（）5585,流量:1.0ml/min,柱温: 30,检测波长: 280nm,参比波长:380nm,分析时间: 90min,(七)色谱条件,82,(八)方法学考察,1. 精密度试验,取同一批次供试品（9号样品：庄浪大黄），连续进样5次，考察色谱峰相似度的一致性，用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，结果相似度大于0.9，表明仪器精密度良好。,2. 重复性试验,取同一批次样品（9号样品：庄浪大黄），按上法分别制备5份供试品，平行测定，考察色谱峰相似度的一致性，用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，结果相似度大于0.9，表明实验重复性良好。,(八)方法学考察,83,3.稳定性试验,取同一批次供试品溶液（9号样品：庄浪大黄），分别在0，2，4，7，11，16，22，29，36h不同时间点进行检测，用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，结果相似度大于0.9，表明供试品在36h内稳定。,(九)供试品溶液测定,同一上述实验条件，测定10批次供试品HPLC色谱图。,3.稳定性试验,84,(十)指纹图谱及技术参数,1.指纹图谱的建立,根据10批次供试品溶液测定结果所给出的峰数、峰值（积分值）和峰位（相对保留时间）等相关参数，进行分析比较，制定优化大黄指纹图谱。见图5-2，彩图5。,(十)指纹图谱及技术参数,85,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,没食子酸,大黄素,图5-2 大黄HPLC指纹图谱,彩图5,大黄三维HPLC,指纹图谱,12345678910没食子酸大黄素图5-2 大黄HPL,86,2.共有指纹峰的保留时间及峰面积,大黄HPLC可分离出约90个色谱峰，经与参照物对照以及比较所有测定记录的色谱图，选取其中10个共有峰作为指纹图谱的特征峰。其保留时间（min）、峰面积见下表：,峰序号,1,2,3,4,5,保留时间,7.25,8.95,18.04,30.77,42.54,峰面积,965.14,207.61,898.25,5824.05,8354.54,峰序号,6,7,8,9,10,保留时间,51.61,52.65,53.06,60.71,76.44,峰面积,972.54,201.89,2852.43,1336.58,229.68,2.共有指纹峰的保留时间及峰面积峰序号12345保留时间7,87,3. 共有指纹峰标定,根据10批次供试品溶液测定结果，标定共有指纹峰。大黄HPLC指纹图谱中，共有指纹峰10个。与大黄素参照物S峰（10号峰）相比，其他9个共有指纹峰相对保留时间依次为：0.095(1)、0.117(2)、0.2369(3)、0.403(4)、0.557(5)、0.675(6)、0.689(7)、0.694(8)、0.794(9)。,4. 共有指纹峰面积比,4、5号共有指纹峰面积为共有指纹峰总峰面积的65%，规定4号峰相对峰面积比值为13.736025.5096。5号峰相对峰面积比值为19.704136.5933。,3. 共有指纹峰标定,88,5. 相似度评价,将测试数据导入中药指纹图谱相似度计算软件，经选峰，设定匹配模板，将谱峰自动匹配；然后设定标准模板，进行谱峰差异性评价和整体相似性评价。掌叶大黄HPLC指纹谱共有模式如图5-3；华亭、庄浪、礼县、宕昌四地样品的相似度较高，大多在0.850.95之间，说明四地大黄之间既有较好的相关性，又有区别。,5. 相似度评价,89,图5-3 掌叶大黄HPLC指纹谱共有模式图,图5-3 掌叶大黄HPLC指纹谱共有模式图,90,主成分分析,将色谱数据矩阵的奇异值分解为两个正交矩阵（U，V）和对角矩阵（S）的乘积，即得3个数值的乘积，取其中2个数值作为投影图的纵横坐标。另一数值即为落在投影图上的投影点。根据投影点位置的不同，可以判别图谱中主成分变化的规律。在大黄15个样本中可分为两类，一类远偏离主体，其余在主体范围内（其中样本13、样本14为宕昌大黄，样本11、样本15为采收期2000年的样品）。为进一步弄清它们之间的差别，将样本1（华亭大黄）、样本10、样本11、样本13、样本14和样本15抽出来直接观察它们的指纹图谱，结果示于单个的色谱图中。从单个六图中可以看出，它们的差别主要由保留时间约为42min（星号所注）的色谱峰的大小来决定，因为该峰占总峰面积比较大，对药材提取物总量的影响较大即权重系数较大，故该峰的大小影响着整个药材提取物的总量。,主成分分析 将色谱数据矩阵的奇异值分解为两个正交矩阵（U，,91,从六张图的比较可以看出该峰在样本1、样本14、样本13、样本10、样本11和样本15中逐渐增大，而最大的是样本11和样本15，可能是前一年的样品经贮藏引起化学变化，由其它物质转化而使该峰增大，使得样本11和样本15离主体范围较远；样本14、样本13中该峰大小虽和样本1差不多，但由于其它成分浓度的影响，整体相似度与样本1相差较大，使得样本14和样本13离主体范围较远；而样本1和样本10虽整体相似度接近，但保留时间约为42min的色谱峰大小有差异，因此在投影图上有一定距离。值得提出的是，总量较低的样本它在主成分投影图中处于最左端，随着在主成分投影图中的样本点从左往右移动时，整个色谱指纹图谱中总峰面积也在不断提高。,从六张图的比较可以看出该峰在样本1、样本14、样本13、样本,92,实例1 盐生肉苁蓉种植基地药材补肾助阳整体特征成分的指纹图谱,肉苁蓉是我国传统的名贵补益类中药，在历代补肾助阳方剂中出现的频率最高。新疆是肉苁蓉生长的重要产区之一，在新疆东部和北部主要产盐生肉苁蓉。苯乙醇苷类成分为肉苁蓉属植物中研究报道最多的一类化合物，在盐生肉苁蓉中也如此。药理实验已基本明确此类化合物是肉苁蓉补肾助阳的主要活性成分。本实例采用RP-HPLC技术，设计了一份能全面反映盐尘肉苁蓉种植基地药材补肾助阳整体特征成分的指纹图谱，该指纹图谱对肉苁蓉中的苯乙醇苷类成分进行了较为精细的表达，解析和识别了多个色谱共有峰，在反映功能性和指示成分特性方面要高于普通的指纹图谱，为药材全面的质量控制和种植基地GAP生产提供了理论支持和实验依据。项目符合中药现代化发展的方向，具有积极的现实意义。,实例1 盐生肉苁蓉种植基地药材补肾助阳整体特征成分的指纹图,93,1.补肾助阳功能整体特征成分的HPLC色谱表达与解读,1.1 补肾助阳功能整体特征成分的指纹图谱研究方法,1.1.1 检测方法的确定,本实例选择HPLC-UV联用技术作为种植基地药材补肾助阳整体特征成分的指纹图谱研究方法，主要是基于以下考虑：首先，HPLC具有分离效率高、分析速度快、重现性好等特点，能给出高分辨的轮廓图谱，且由于是封闭的系统色谱，在线操作，受外界影响因素少，因此非常适合于构建中药的指纹图谱；其次，苯乙醇苷是肉苁蓉补肾助阳的主要活性成分，此类成分苷元部分为苯乙醇类，与苷元相连中心葡萄糖的4位或6位连有苯丙烯酰基，2位偶有乙酰基相连，这些特征显示其分子结构具有数个共轭体系，表明该类成分具有较强的紫外吸收，非常适用于紫外检测器的检测。,1.补肾助阳功能整体特征成分的HPLC色谱表达与解读,94,1.1.2 仪器与材料,1.1.2.1 仪器,Waters2690高效液相色谱仪(带自动进样器)；Waters2487双波长可见紫外检测器；Millennium32色谱工作站美国(Waters公司)；Hypersil ODS-2色谱柱(4.6mmx250mm，5m；大连依利特有限公司)，SymmetryShieldRPs色谱柱(4.6mmxl50mm，5m；美国Waters公司)；BSll0S电子天平(德国Sartorius)；SB3200超声振荡仪(上海Branson)。,1.1.2.2 试药与样品,1.1.2.2.1 试药,1.1.2 仪器与材料,95,色谱纯甲醇和乙腈(Fisher公司)，重蒸水(乐百氏公司)，其它试剂均为分析纯。对照品松果菊苷、肉苁蓉苷A、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、2-乙酰基毛蕊花糖苷、管花苷B均从盐生肉苁蓉中分离制备，UV、IR、EI-MS、IHNMR、13CNMR数据符合文献值，含量经,HPLC面积归一化法测定纯度大于97。,1.1.2.2.2 样品的采集与加工,肉苁蓉药材来源见表3-1，所有药材均经新疆中药民族药研究所李佳政研究员鉴定。将肉苁蓉药材洗净，切成薄片，置阳光下晒干(约10天)，把晒干的药材粉碎，过40目筛，置50烘箱干燥至恒重，作为待测样品。,色谱纯甲醇和乙腈(Fisher公司)，重蒸水(乐百氏公司)，,96,表4 肉苁蓉药材样品,Tab.4 Origin of diffrent species of Genus Cistanche samples,编号 品 名 产地或收集地 生长状态 采收日期,1 盐生肉苁蓉 吉木萨尔种植基地 未山土，栽培品 2004-05,C.salsa,2 盐生肉苁蓉 吉木萨尔种植基地 刚出土未开花，栽培品 2004-05,C.salsa,3 盐生肉苁蓉 吉木萨尔种植基地 刚出土未开花，栽培品 2004-05,C.salsa,4 盐生肉苁蓉 吉木萨尔种植基地 刚山土未开花，栽培品 2004-05,C.salsa,5 盐生肉苁蓉 吉木萨尔种植基地 刚山土未开花，栽培品 2004-05,表4 肉苁蓉药材样品,97,6 盐生肉苁蓉 吉木萨尔种植基地 刚山土未开花，栽培品 2005-04,C.salsa,7 盐生肉苁蓉 吉木萨尔种植基地 刚出土未开花，栽培品 2005-04,C.salsa,8 盐生肉苁蓉 吉木萨尔种植基地 刚山土未开花，栽培品 2005-04,C.salsa,9 盐生肉苁蓉 吉木萨尔种植基地 刚出土未开花，栽培品 2005-04,C.salsa,10 盐生肉苁蓉 吉木萨尔种植基地 未山土，栽培品 2005-04,C.salsa,11 盐生肉苁蓉 吉木萨尔种植基地 未山土，野生品 2004-05,C.salsa,12 盐生肉苁蓉 吉木萨尔地区 刚出土米开花，野生品 2004-05,C.salsa,13 盐生肉苁蓉 吉木萨尔地区 刚山土未开花，野生品 2005-04,C.salsa,14 盐生肉苁蓉 吉木萨尔地区 刚出土未开花，野生品 2005-04,6 盐生肉苁蓉 吉木萨尔种植基,98,15 盐生肉苁蓉 吉木萨尔地区 未山土，野生品 2005-04,C.salsa,16 盐生肉苁蓉 吉木萨尔地区 未山土，栽培品 2004-05,C.salsa,17 盐生肉苁蓉 吉木萨尔种植基地 未山土，栽培品 2005-04,C.salsa,18 盐生肉苁蓉 吉木萨尔种植基地 未出土，栽培品 2005-05,C.salsa,19 盐生肉苁蓉 吉木萨尔种植基地 已开花，栽培品 2004-05,C.salsa,20 盐生肉苁蓉 吉木萨尔种植基地 已开花，栽培品 2004-05,C.salsa,21 盐生肉从蓉 吉木萨尔种植基地 已开花，栽培品 2005-04,C.salsa,22 盐生肉从蓉 吉木萨尔种植基地 已开花，栽培品 2005-04,15 盐生肉苁蓉 吉木萨尔地区,99,23 盐生肉苁蓉 吉木萨尔种植基地 已开花，栽培品 2005-04,C.salsa,24* 盐生肉苁蓉 吉木萨尔种植基地 刚出土未开花，栽培品 2005-04,C.salsa,25* 盐生肉从蓉 吉木萨尔种植基地 刚山土未开花，栽培品 2005-04,C.salsa,26* 盐生肉苁蓉 吉木萨尔种植基地 刚出土未开花，栽培品 2005-04,C.salsa,27 管花肉苁蓉 民丰种植基地 通货 2005-04,C.tubulosa,28 荒漠肉苁蓉 新疆精河地区 饮片 2004-05,C.deserticola,23 盐生肉苁蓉 吉木萨尔种,100,*24、25、26号样品分别为同一植株的基部、中部和顶部。,1.1.3 实验方法与结果,1.1.3.1 色谱条件,色谱柱：Hypersil ODS-2柱(4.6mmx250mm，5pm)；流动相：乙,腈-0.4磷酸水溶液梯度洗脱；流速：0.75mLmin；柱温：25；检测波长：333nm。,1.1.3.2 对照品溶液的制备,分别精密称取松果菊苷、肉苁蓉苷A、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、2-乙酰基毛蕊花糖苷