液相色谱-质谱联用技术及使用注意事项课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2019/1/22,#,液相色谱,-,质谱联用技术及使用注意事项,液相色谱-质谱联用技术及使用注意事项,1,主要内容,液相色谱,-,质谱联用技术简介,我们的仪器,测试准备阶段的注意事项,结果的解读,主要内容液相色谱-质谱联用技术简介,2,第一章 液相色谱,-,质谱联用技术简介,质谱基本原理,质谱分析法是通过对被测样品离子质荷比的测定来进行分析的一种分析方法。,电离装置把样品电离为离子,质量分析器把不同质荷比的离子分开,检测器检测,第一章 液相色谱-质谱联用技术简介质谱基本原理,3,色谱,-,质谱联用技术,体现了色谱和质谱优势的互补，它将,色谱对复杂样品的高分离能力,与,质谱的高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息,的优点结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。,气相色,谱,-,质,谱联,用技术,(,GC-MS,),液,相色,谱,-,质,谱联,用技术,(,LC-MS,),以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。,第一章,LC-MS,技术简介,色谱-质谱联用技术 体现了色谱和质,4,液相色谱,-,质谱联用仪,LC-MS,LC-ITMS, LC-TOF,LC-QqQ, LC-Q-TOF, LC-IT-TOF, LC-Q-IT,等,适用于不挥发性化合物、极性化合物、热不稳定化合物、大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定,第一章,LC-MS,技术简介,液相色谱-质谱联用仪LC-MS, LC-ITMS, LC-T,5,液相色谱,-,质谱联用仪,LC,离子源,离子传输系统,质量分析器,检测器,数据系统,真空系统,大气,第一章,LC-MS,技术简介,液相色谱-质谱联用仪LC离子源离子传输系统质量分析器检测器数,6,与质谱联用的液相色谱,液相色谱柱,规格：,502.1mm,、,1002.1mm,、,1502.1mm,、,1504.6mm,，,2504.6mm,填料粒径：,亚二微米（,1.7-1.9m,）、,2.5 m,、,3m,、,3.5m,、,5m,填料类型：,C,18,、,C,8,、,-NH,2,、,-CN,等,第一章,LC-MS,技术简介,与质谱联用的液相色谱液相色谱柱第一章 LC-MS技术简介,7,与质谱联用的液相色谱,流动相,溶剂,推荐使用,水,、,甲醇,、,乙腈,、异丙醇,不能使用四氢呋喃、二氯甲烷、正己烷、氯仿,酸,不能使用无机酸,(,可能会导致腐蚀,),推荐使用,醋酸,和,甲酸,三氟乙酸（,TFA,）会产生离子抑制作用,第一章,LC-MS,技术简介,与质谱联用的液相色谱流动相第一章 LC-MS技术简介,8,与质谱联用的液相色谱,流动相,碱,不要使用碱金属碱,(,可能会导致腐蚀,),推荐使用,氨水,三乙胺,/,三甲胺,（,TEA/TMA,）有助于形成负离子,表面活性剂,清洁剂和其他表面活性剂会产生离子抑制,缓冲盐,避免使用非挥发性盐，特别是碱金属磷酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐等。,推荐使用,甲酸铵,、,乙酸铵,第一章,LC-MS,技术简介,不能使用,与质谱联用的液相色谱流动相第一章 LC-MS技术简介不能使,9,与质谱联用的液相色谱,流动相的流速,样品分离的需要,柱子内径,离子源类型,第一章,LC-MS,技术简介,Column ID,Flow Rate,4.6 mm,1.0 mL/min,3.0 mm,0.5 mL/min,2.1 mm,0.2 mL/min,1.0 mm,50,L/min,Capillary, 10,L/min,与质谱联用的液相色谱流动相的流速样品分离的需要第一章 LC,10,液相色谱,-,质谱联用仪,LC,离子源,离子传输系统,质量分析器,检测器,数据系统,真空系统,大气,第一章,LC-MS,技术简介,液相色谱-质谱联用仪LC离子源离子传输系统质量分析器检测器数,11,液质联用仪的离子源,离子源的作用,去溶剂,离子化,真空过渡,去除干扰,大气压电离源（,Atmosphere pressure ionization,，,API,）,电喷雾电离源（,Electrospray ionization,，,ESI,）,大气压化学电离源（,Atmosphere pressure chemicel ionization,，,APCI,）,第一章,LC-MS,技术简介,液相色谱与质谱的接口,液质联用仪的离子源离子源的作用第一章 LC-MS技术简介液,12,液质联用仪的离子源,正离子,模式：,ESI(+),或,APCI(+),适合于,碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式。,负离子模式,：,ESI,(-),或,APCI,(-),适合于,酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。样品中含有较多的强负电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式,。,第一章,LC-MS,技术简介,液质联用仪的离子源正离子模式：ESI(+)或APCI(+)第,13,离子源与液相色谱的流速,ESI,1 ,L/min - 1mL/min,最佳使用流速,: 200,L/min,一般来说,高流速需要高的毛细管温度和鞘气、辅助气流量。,APCI,200 ,L/min - 2mL/min,最佳使用流速,: 500 L/min,一般来说，高流速需要更高的鞘气和辅助气流量，但不需要提高毛细管温度,第一章,LC-MS,技术简介,高流速需进行分流,离子源与液相色谱的流速ESIAPCI第一章 LC-MS技术,14,电喷雾电离源,(ESI),第一章,LC-MS,技术简介,电喷雾电离源(ESI) 第一章 LC-MS技术简介,15,电喷雾电离源,(ESI),第一章,LC-MS,技术简介,电喷雾电离源(ESI) 第一章 LC-MS技术简介,16,大气压化学电离源,(APCI),第一章,LC-MS,技术简介,大气压化学电离源(APCI)第一章 LC-MS技术简介,17,液质联用仪的离子源,ESI,离子在液态产生,有益于热不稳定化合物的分析,有益于中等到高极性化合物的分析,有益于大分子（蛋白,/,多肽）的分析,APCI,离子在气态产生,不利于热不稳定化合物的分析,有益于低极性到中等极性化合物的分析,适合于小分子分析,第一章,LC-MS,技术简介,液质联用仪的离子源ESIAPCI第一章 LC-MS技术简介,18,离子源,第一章,LC-MS,技术简介,离子源第一章 LC-MS技术简介,19,液相色谱,-,质谱联用仪,LC,离子源,离子传输系统,质量分析器,检测器,数据系统,真空系统,大气,第一章,LC-MS,技术简介,液相色谱-质谱联用仪LC离子源离子传输系统质量分析器检测器数,20,质量分析器,质量分析器的作用,将离子源产生的离子按,m/z,顺序分开并排列成谱,主要技术参数,所能测定的质荷比范围,分辨率,质量分析器的种类,四极杆分析器,（,Quadrupole,）,离子阱分析器,（,Ion trap,）,扇形磁分析器,飞行时间分析器（,TOF),傅里叶离子回旋共振变换分析器,第一章,LC-MS,技术简介,对选择离子分析具有较高的灵敏度,在全扫描模式下仍然具有较高灵敏度；可实现多级质谱,(MSn),的功能,质量分析器质量分析器的作用第一章 LC-MS技术简介对选择,21,单级质谱和串联质谱,单级质谱：,LC-MS, LC-TOF,串联质,谱,空间串联质谱：,LC-QqQ, LC-Q-TOF, LC-IT-TOF,LC-Q-IT,时间串联质谱：,LC-ITMS,第一章,LC-MS,技术简介,Q1,q2,Q2,MS1,碰撞室,MS2,单级质谱和串联质谱单级质谱：LC-MS, LC-TOF第一章,22,质谱扫描类型,全扫描（,Full Scan,）,选择离子监测（,Select ion Monitoring,，,SIM,）,子离子扫描（,Product Ion Scan,）,母离子扫描（,Precursor Ion Scan,，,Parent Ion Scan,）,中性丢失扫描（,Neutral Loss Scan,）,选择反应监测（,Select Reaction Monitoring,，,SRM,）或多,反应监测（,Multiple Reaction Monitoring,，,MRM,）,第一章,LC-MS,技术简介,质谱扫描类型全扫描（Full Scan）第一章 LC-MS,23,质谱扫描类型,全扫描（,Full Scan,）,全扫描数据采集可以得到化合物的准分子离子，从而可判断出化合物的分子量，用于鉴别是否有未知物，并确认一些判断不清的,化合物,，如合成化合物的质量及结构,。,第一章,LC-MS,技术简介,质谱扫描类型全扫描（Full Scan）第一章 LC-MS,24,质谱扫描类型,选择,离子监测（,Select ion Monitoring,，,SIM,）,SIM,用于检测已知或目标化合物，比全扫描方式能得到更高的灵敏度。这种数据采集的方式一般用在定量目标化合物之前，而且往往需要已知化合物的性质,。,第一章,LC-MS,技术简介,m/z,209,m/z,254,质谱扫描类型选择离子监测（Select ion Monito,25,质谱扫描类型,子离子扫描,（,Product Ion Scan,）,用于结构,判断和,选择,离,子,对作多反应,监测,第一章,LC-MS,技术简介,质谱扫描类型子离子扫描（Product Ion Scan）第,26,质谱扫描类型,母离子扫描,（,Precursor Ion Scan,，,Parent Ion Scan,）,母离子分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，尽管它们的母离子的质量可以不同，但在分裂过程中会生成共同的子离子，这种扫描功能在药物代谢研究中十分重要。,第一章,LC-MS,技术简介,质谱扫描类型母离子扫描（Precursor Ion Scan,27,m/z 271,m/z,287,m/z,301,m/z,303,m/z,317,某植物提取物,的母离子扫描谱图,第一章,LC-MS,技术简介,m/z 271m/z 287m/z 301m/z 303m/,28,质谱扫描类型,中性丢失扫描,（,Neutral Loss Scan,）,中性丢失扫描分析可用来鉴定和确认类型已知的,化合物。,也可以帮助进行未知物结构判断，例如有中性丢失,18Da,的意味着,-H,2,O,，,28-CO,，,30-HCOH,，,32-CH,3,OH,，,44-CO,2,等等。,第一章,LC-MS,技术简介,质谱扫描类型中性丢失扫描（Neutral Loss Scan,29,质谱扫描类型,多反应监测,（,Multiple Reaction Monitoring,，,MRM,）,适用于待测组分含量低，体系组份复杂且干扰严重的样品分析。,常用于,定量分析。,第一章,LC-MS,技术简介,质谱扫描类型多反应监测（Multiple Reaction,30,第二章 我们的液质联用仪,液相色谱,-,离子阱质谱联用仪,LCQ Fleet,液相色谱仪,-,三重四极杆串联质谱仪,TSQ Quantum Access MAX,第二章 我们的液质联用仪液相色谱-离子阱质谱联用仪液相色谱仪,31,第二,章 我们的液质联用仪,LC-ITMS,LC-QqQ,液相色谱仪,仪器型号,Surveyor,MS Plus (HPLC),Accela 1250 (UPLC),压力范围,0-400 bar,0-1250 bar,色谱柱长度,250mm,，,150mm,150mm,，,100mm,，,50mm,色谱柱粒径,4.6,m,，,3.5m,3.5,m,，,2.5m,，,1.7-1.9m,离子源,ESI,，,APCI,HESI-II,，,APCI,质量分析器,离子阱,四极杆（串联质谱）,质量范围,50-2000,15-3000,扫描类型,全扫描，子离子扫描（,10,级），选择离子监测,全扫描，选择离子监测，,子离子扫描（,MS/MS,），母离子扫描，中性丢失扫描，多反应监测,用途,复杂基质中痕量物质的定性，目标物的结构鉴定,复杂基质中痕量物质的定量，多目标物的分类,两台液质联用仪的比较,第二章 我们的液质联用仪LC-ITMSLC-QqQ液相色谱,32,第三章 样品准备的,注意,事项,提供尽可能多的样品信息,目标分析物信息,分子式,结构,(,官能团,),分子量,溶解性, pKa,稳定性,储存,是否有标准品,浓度水平和范围,基质信息,:,类型,状态,(,液体,固体,),溶解性,不同成份,第三章 样品准备的注意事项提供尽可能多的样品信息 基质信息,33,第三章 样品准备的,注意,事项,确定样品测试的目的,定性还是定量,单一组分样品还是复杂样品,目标,化合物结构是否已知,是否需要多级质谱扫描,样品的准备,样品体积最好在,200-500L,之间；如少于,100L,建议使用内插管,应使用针式过滤器过滤后再装入样品瓶送,样,第三章 样品准备的注意事项,液相色谱分离条件（色谱柱、流动相）,第三章 样品准备的注意事项确定样品测试的目的第三章 样品准,34,第四章 谱图的解读,概念和术语,质荷比,：,离子质量与它所带电荷的比值，写作,m/z,质量范围,：质谱仪所能测定的离子质荷比的范围,质谱图,：以离子丰度为纵坐标，离子质荷比,（,m/z,）,为横坐标所作的,图,第四章 谱图的解读概念和术语,35,第四章 谱图的解读,概念和术语,质荷比,质量范围,质谱图,第四章 谱图的解读概念和术语,36,第四章 谱图的解读,概念和术语,准分子离子,：指与分子存在简单关系的离子，通过它可以确定分子量。,正离子模式：,M+H,+,、,M+Na,+,、,M+K,+,、,M+NH,4,+,、,2M+H,+,、,2M+Na,+,等,负离子模式：,M-H,-,第四章 谱图的解读,第四章 谱图的解读概念和术语第四章 谱图的解读,37,M+Na,+,2M+H,+,2M+Na,+,3M+Na,+,M,78.01,第四章 谱图的解读,M+Na+2M+H+2M+Na+3M+Na+,38,第四章 谱图的解读,概念和术语,碎片离子,：准分子离子经过一级或多级裂解生成的产物离子,。,第四章 谱图的解读,第四章 谱图的解读概念和术语第四章 谱图的解读,39,第四章 谱图的解读,概念和术语,总离子流,图,（,Total ion chromatogram,，,TIC,）,在,选定的质量范围内，计算机把采集到的每个质谱的所有离子相加得到总离子强度，总离子强度随时间变化的曲线就是总离子流图，也叫总离子色谱图,。,第四章 谱图的解读,第四章 谱图的解读概念和术语第四章 谱图的解读,40,第四章 谱图的解读,总离子流图,第四章 谱图的解读总离子流图,41,第四章 谱图的解读,第四章 谱图的解读,42,第四章 谱图的解读,概念和术语,质量,色谱图：,某,一质荷比的离子的强度随时间变化的曲线，也叫提取离子色谱图,。,第四章 谱图的解读,第四章 谱图的解读概念和术语第四章 谱图的解读,43,质量色谱图,第四章 谱图的解读,质量色谱图第四章 谱图的解读,44,质量色谱图,第四章 谱图的解读,m/z,341,m/z,479,m/z,309,质量色谱图第四章 谱图的解读m/z 341m/z 47,45,谱图实例,1.,色谱图和总离子流图,第四章 谱图的解读,NL:,6.02E5,Total Scan PDA,GZY-LJJ110717 acid,NL:,4.89E5,TIC F: ITMS+C ESI Full ms 100-1000 ms,GZY-LJJ110717 acid,谱图实例1. 色谱图和总离子流图第四章 谱图的解读NL:,46,谱图实例,2.,一级质谱图,第四章 谱图的解读,GZY-LJJ110717 acid RT: 16.02 NL: 2.78E4,F: ITMS+c ESI Full ms,100.00-1000.00,谱图实例2. 一级质谱图第四章 谱图的解读GZY-LJJ,47,谱图实例,3,.,二级质谱图,第四章 谱图的解读,Sample-ms2-45 RT: 2.64-2.90 NL: 1.03E3,F: ITMS+c ESI Full ms2 249.00cid 45 65.00-300.00,谱图实例3. 二级质谱图第四章 谱图的解读Sample-,48,谱图实例,4.,三,级质谱图,第四章 谱图的解读,P11-MS3 RT: 13.12 NL: 1.56E2,F: ITMS+c ESI Full ms3 324.00cid 35.00 279.00cid 35.00 75.00-400.00,谱图实例4. 三级质谱图第四章 谱图的解读P11-MS3,49,谱图实例,5,.,质量色谱图,第四章 谱图的解读,Base Peak m/z=340.50-341.50,F: ITMS +c ESI Full ms 100.00-1000.00 ms,GZY-LJJ-110719-acid,谱图实例5. 质量色谱图第四章 谱图的解读Base Pe,50,谱图实例,6.,选择离子监测图,第四章 谱图的解读,NL: 5.68 E2,TIC F: ITMS+c ESI SIM ms 771.00-775.00 MS 130830-SIM2,谱图实例6. 选择离子监测图第四章 谱图的解读NL: 5,51,谱图实例,7,.,母离子扫描谱图,第四章 谱图的解读,NL: 1.52 E6,TIC F: +c ESI Full pr 97.000 100.000-1500.000 MS ICIS SLS2-2,谱图实例7. 母离子扫描谱图第四章 谱图的解读NL: 1,52,谱图实例,8.,多反应监测谱图,第四章 谱图的解读,NL: 2.27 E5,TIC F: +c ESI SRM ms2 254.000 107.800-108.800,，,155.600-156.600 MS SD6,谱图实例8. 多反应监测谱图第四章 谱图的解读NL: 2,53,谢谢大家！,谢谢大家！,54,