味精生产工艺课件

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,味精生产工艺,主讲：赵广斌,第,一,节 氨基酸,氨基酸的用途,调味,营养强化,氨基酸的生产方法,发酵法，包括以葡萄糖为原料的直接发酵法和添加前体物质的发酵法；,化学合成法；,酶促合成法；,水解抽提法。,由于发酵法生产本钱低，原料来源丰富，所以是目前氨基酸生产的主要方法。,味精生产工艺,我国味精产量开展很快近几年产量如下：1991年全国味精产量为25万吨，1995年为52万吨，1998年65万吨。，技术水平提高也较快，我国谷氨酸发酵产酸水平曾长期徘徊在6左右，近年来不少厂家产酸已达8以上，转化率50以上，一次冷冻等电收率7880；假设采用等电离交新工艺，提取收率9096。但与世界先进水平相比仍存在较大差距 .,味精生产全过程,味精生产全过程可分为五个局部：,淀粉水解糖的制取；,谷氨酸生产菌的扩大培养；,谷氨酸发酵；,谷氨酸的提取别离；,由谷氨酸制味精。,味精生产工艺,味精生产工艺流程,一、淀粉水解糖的制备,将淀粉质原料如淀粉、大米等转化为葡萄糖的过程称作糖化工艺。所制得的糖液称淀粉水解糖.,淀粉水解糖中主要是葡萄糖，另有数量不等的少量麦芽糖及其他一些二糖、低聚糖等复合糖类。,此外，原料带来的杂质如蛋白质、脂肪等及其分解产物也混于糖液中。,淀粉水解糖的制备方法,水解淀粉为葡萄糖的方法有酸解法、酶酸法、酶解法双酶法三种。,不同糖化工艺各有其优缺点，但从水解糖液的质量及降低粮耗、提高原料利用率方面来考虑那么以双酶法最好，其次是酸酶法酶酸法，酸水解法最差。,波美度,(Be),是表示液体浓度,(,比重,),的一种方法，,标定,:,常用,20,作为标准,蒸馏水中为,0,Be,，,重表,:,在纯浓硫酸,(,相对密度,1.8427),为,66,Be,。其余刻度等分。测量比重,1,液体。,轻表,:,比重为,0.9351,的溶液中,为,10,Be,。,其余刻度等分。测量比重,1,的液体,液体浓度,Be,的概念,其和液体比重之间有以下关系：,轻表,重表,Bx：表示溶液的比重的方法,定义：20时,1%纯蔗糖溶液为1Bx.即: 溶液的Bx，表示该溶液的比重和相同浓度为Bx%的蔗糖溶液的比重相等。,注意： Bx的概念不同于波美度，他与比重之间是没有计算公式的，但是可以查找有关换算关系。,淀粉水解糖,糖化：淀粉水解为葡萄糖的过程为淀粉的糖化。,淀粉水解糖：糖化制备的溶液叫淀粉水解糖。,DE值(葡萄糖值)指所有测得的复原糖都当作葡萄糖占干物质的百分数。,原料：薯类、玉米、大米、小麦等,酸解法,以酸为催化剂，在高温下将淀粉水解转化为葡萄糖的方法。,120,以上，,0.2MPa,的压力,优点,缺点,水解时间短,生产方便,设备要求简便,需高压、高温、酸等条件设备需耐高压、高温、酸,原料,:,要求颗粒大小要适当,水解糖的质量不太高,酶解法,用专一性很强的淀粉酶及糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的工艺。,淀粉,糊精、低聚糖,葡萄糖,a-,淀粉酶,糖化酶,优点,缺点,不需高压、高温、耐酸设备,反应专一，出糖率高。,糖液质量好，纯净。,时间长,需设备较多,液化,糖化,酸酶结合法,A,酸酶法,酸,水解,糖化,适用谷类原料，颗粒坚硬用,a-,淀粉酶液化需时间长。,B,酶酸法,a-,淀粉酶,水解,酸糖化,适用原料碎米颗粒大小不均匀。,淀粉酸水解原理及工艺,一淀粉酸水解原理,二淀粉酸水解工艺,一淀粉酸水解原理,(C6H10O5)n (C6H10O5)x C12H22O11 C6H12O6,淀粉 各种糊精 麦芽糖 葡萄糖,同时在整个水解过程中由于受到酸和热的作用，一局部葡萄糖发生复合反响和分解反响，影响葡萄糖的产率和生产本钱。,淀粉, ,葡萄糖,5-,羟基糠醛,有机酸、有色物质,复合二糖,复合低聚糖,淀粉水解反响,分解反响,复合反响,7%,，,a1.6,异麦芽糖,1.6,龙胆二糖,9192%,1%,淀粉水解过程的变化,：,干淀粉 吸水膨胀黏度,可溶性淀粉,葡萄糖 麦芽糖 无色糊精 变红糊精,(C,6,H,10,O,5,)n+nH,2,O n C,6,H,12,O,6,164.14 18.02 180.16,理论转化率,=180.16164.14=111.11%,聚合度,3035,聚合度,46,葡萄糖聚合度与碘液的呈色表,葡萄糖聚合度,与碘液呈色,最高吸收波长（,nm),78,无色,16,淡红色,480,21,红色,510,28,红紫色,540,34,紫色,560,41,兰紫色,580,61,兰色,600,120,兰色,620,330,兰色,630,二淀粉酸水解工艺,1,淀粉酸水解工艺流程,2,淀粉酸水解条件的控制及对糖液质量的影响,3,糖化设备对糖液质量的影响,4,水解糖液的中和脱色除杂,1,淀粉酸水解工艺流程,淀粉,水 调浆 糖化 冷却 中和、脱色,盐酸,调浆锅 糖化锅,过滤除杂,糖液,某味精厂的酸法制糖流程,2 淀粉酸水解条件的控制及对糖液质量的影响确定最正确工艺条件,1淀粉乳浓度的选择,淀粉乳浓度与DE值之间的关系,淀粉乳浓度,Bx,26,24,22,20,19,18,17,16,DE,值,89.17,89.27,89.92,91.1,91.3,92.77,92.81,93.01,2酸的种类和用量,盐酸：高效，但中和后产生氯化物，增加糖液灰分，对葡萄糖的结晶，别离及收率会有影响。用量盐酸占干淀粉的0.60.8%， 1011Be，pH值1.5,硫酸：能力仅次于盐酸，用碳酸钙中和，经脱色，离子交换可除去。,草酸：能力低，用石灰中和生成草酸钙，脱色过滤易除去，非强酸，减少了复合反响。,3糖化的压力和时间,水解压力MPa 表压 0.3 0.35 0.4,水解时间 min 26 18 9,*蒸汽加热，压力越高水解速度越快。,*时间：糖化终点，,控制好时间,放料时间。,3,糖化设备对糖液质量的影响,糖化锅：容积,径高比=11.5左右,附属设施原那么：尽量缩短加料、放料、升温、升压等辅助时间。,4,水解糖液的中和脱色除杂,(1)中和,调pH 1.71.9到4.65.0，温度140150 降到6070,加纯碱Na2CO3)和烧碱,HCl+ Na2CO3 2NaCl+H2O+CO2 ,(2)脱色、除杂,活性炭、离子交换树脂,(3)压滤,双酶水解法制,糖,工艺,一液化-淀粉液化的条件及液化程度的控制,淀粉的糊化与老化,糊化,：淀粉受热后吸水膨胀、糊化，晶体结构消失，互相接触变成糊状液体，即使停止搅拌，淀粉也不再沉淀的现象。,老化：,是分子间氢键已断裂的糊化淀粉又重新形成氢键的过程，也就是复结晶过程。,液化的方法与选择,间歇液化法直接升温,升温方法不同 半连续液化法高温液化,喷射液化法,一次加酶液化法,加酶方法不同 二次加酶液化法,三次加酶液化法,酶耐温性不同 中酶法、高酶法、高温中酶法,原料粗细不同 淀粉质原料直接液化、,精制淀粉液化,3,、工艺及条件,蒸汽喷射液化工艺流程：,调浆 配料 一次喷射液化 液化保温,95-97 60min,二次喷射 高温维持 二次液化,145 3-5min 95-97,30min,冷却 糖化,碳酸钠调,pH,、,CaCl,2,、,酶,水,一次升温液化工艺流程,：,调浆 配料 液化锅,(,液化保温,),水,88-90 15-20min,糖化 冷却 高温灭酶,100 5min,碳酸钠调,pH,、,CaCl,2,、,酶,淀粉液化条件,a-,淀粉酶活力与,pH,值,的关系,a-,淀粉酶活力与,温度,的关系,液化温度与保护剂有关,CaCl2 、Ca2+ 0.01mol/L(浓度，8u/g淀粉,国产7658淀粉酶85-87 活力最高,国外报道淀粉酶110 、5-10分钟,液化程度控制：,低黏度大、淀粉易老化,高不利于糖化酶作用,掌握在DE值10-20之间,二糖化,1,糖化酶的水解作用,2,糖化工艺条件及控制,1. 糖化酶的水解作用,糖化是利用糖化酶也称葡萄糖淀粉酶将淀粉液化产物糊精及低聚糖进一步水解成葡萄糖的过程。,2,糖化工艺条件及控制,1糖化工艺过程,液化 糖化 灭酶 过滤,发酵 贮糖计量,调温度,60,加糖化酶,60,保温无水酒精检验,pH4.8-5,加热,90,保温,30,分钟,降温,60-70,温度,35,左右 接种发酵,2糖化工艺条件,酶的用量：80-100U/g淀粉计,糖化条件 温度 pH值,根霉糖化酶 55 5.0,曲霉糖化酶,黑曲霉,* 加1,6糖苷键葡萄糖苷酶，抑制糖化酶催化复合反响的作用，DE值99%。,酸解法与酶解法糖液质量比较,项目,酸解法,酶解法,项目,酸解法,酶解法,葡萄糖值,葡萄糖含量,灰分,蛋白质,烃甲基糠醛,色度,淀粉转化率,工艺条件,91,86%,1.6%,0.08%,0.3%,10.,90%,高温高压,98,97%,0.1%,0.1%,0.003,%0.2,98%,高温,过程能耗,副产品,生产周期,设备规模,防腐要求,葡萄糖收得率,适合发酵工艺,情况,多,多,短,小,高,较低,差,少,少,长,大,低,高,10%,有利,淀粉制糖过程考察的指标,1,葡萄糖的理论收率,(C,6,H,10,O,5,)n+nH,2,O nC,6,H,12,O,6,180.16/162.14100%=,111.0%,2,实际收率,=,3,淀粉转化率,=,糖液量,L,糖液中葡萄糖含量,%,投入淀粉量,Kg ,原料淀粉中含纯淀粉的量,%,100%,糖液量,L,糖液中葡萄糖含量,%,投入淀粉量,Kg,原料淀粉中含纯淀粉的量,%,111%,100%,4 葡萄糖值DE值淀粉糖的含糖量，,指测得的复原糖的含量都当作葡萄糖占干物质的百分率。,DE值= 100%,5 DX值,糖化液中葡萄糖含量占干物质的百分率.,DX值= 100%,复原糖含量干物质含量,葡萄糖含量干物质含量,糖化的过程检测,检验液化：是否有淀粉，用碘液，是否呈兰色；,检验糖化：是否水解完全,测定复原糖；,用无水酒精。,淀粉水解过程的反响,主反响：糖化水解作用,副反响：,复合反响在酸和热作用下，局部葡萄糖经1，6键结合成龙胆二糖，异麦芽糖和其他低聚糖。,分解反响葡萄糖分解为羟甲基糠醛，有机酸和有色物质等非糖产物,糖化方法的比较,水解时间：酸法短，酶法长,水解程度：酶法高,糖液杂质：酶法低，酸法高,综合,1水解糖液的质量要求,色泽：呈强黄色透明液,糊精反响：无,复原糖含量，18左右,DE值：90以上,透光率：6080左右650纳米,pH值：4.64.8,淀粉转化率：92%以上实际产量/理论产量,水解糖液的质量要求和控制要点,2水解糖液质量的控制要点,合理控制淀粉乳浓度,糖液要清,溶液中不模糊精,糖液要新鲜,糖液贮存容器一定要保持清洁，定期清理和清洗，防止酵母菌等浸入,二、谷氨酸生产菌种及生产菌的培养,一国内谷氨酸生产菌株,目前国内各味精厂所用的谷氨酸生产菌主要有：,(1)天津短杆菌T613及其诱变株FM8209、FM-415、CMTC6282、TG863、TG866、S9114、D85等菌株；,(2)钝齿棒杆菌AS1.542及其诱变株B9、B9-17-36、F-263等菌株；,(3)北京棒杆菌AS1.299及其诱变株7338、D110、WTH-1等菌株。,现在多数厂家生产上常用的菌株是T613、FM-415、S9114、CMTC6282等。,谷氨酸生产菌的共同特征,现有谷氨酸生产菌在形态及生理方面有许多共同的特征：,细胞形态为球形、棒形以至短杆形。,革兰氏染色阳性，无芽孢，无鞭毛，不能运动。,都是需氧型微生物。,谷氨酸生产菌的共同特征,(,续,),都是生物素缺陷型。,脲酶强阳性。,不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白以及明胶等。,发酵中菌体发生明显的形态变化，同时发生细胞膜渗透性的变化。,CO2固定反响酶系活力强。,异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，乙醛酸循环弱。,谷氨酸生产菌的共同特征,(,续,),-酮戊二酸氧化能力缺失或微弱。,复原型辅酶NADPH2进入呼吸链能力弱。,柠檬酸合成酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶以及谷氨酸脱氢酶活力强。,能利用醋酸、不能利用石蜡。,能向环境中分泌谷氨酸。,不分解利用谷氨酸，并能耐高浓度的谷氨酸，产谷氨酸5以上。,二谷氨酸生产菌的比较 1.天津短杆菌T613与钝齿棒杆菌B9的比较,在实际生产中，T613菌株与B9菌株的主要区别如下：,(1)细胞大小 T613菌细胞比B9菌小且多，因此T613菌发酵时泡沫稍大，同时提取谷氨酸要比B9菌困难。,(2)菌体形态 斜面上T613菌淡白，而B9菌近草黄色；发酵过程中，T613菌体形态变化比B9菌还大，T613菌发酵前期(10h以前)细胞比较短，圆滚滚的，似仙人掌上的仙人球，16h以后细胞明显拉长3倍以上。,天津短杆菌T613与钝齿棒杆菌B9的比较(续),(3)发酵温度 T613菌发酵温度可以控制高一些，一般发酵前期可控制在3234，中后期可控制在3638，这对夏天降温条件差的工厂有利。而B9菌发酵温度较低，一般发酵前期可控制在3032，中后期可控制在3435。,(4)脲酶活力 T613菌脲酶活力比B9菌更强，一般初尿为0.50.6，流加尿素采用少量屡次为宜。,天津短杆菌T613与钝齿棒杆菌B9的比较(续),(5),生物素用量 在发酵培养基中，,T613,菌的生物素用量可比,B9,菌低一些，一般少用,20,左右；有的工厂用量甚至比,B9,菌低,30,50,。当然在高糖发酵时要相应增加生物素的用量。,(6),糖酸转化率 在正常情况下，,T613,菌的糖酸转化率一般可达,45,以上，而,B9,菌的糖酸转化率通常在,40,45,之间。,(7),噬菌体类型 能侵染,B9,菌的噬菌体也可以感染,T613,菌，因此，当,T613,菌严重感染噬菌体时，不能换用,B9,菌，以调换,7338,菌为好。,天津短杆菌T613与钝齿棒杆菌B9的比较(续),(8)胶体量 T613菌在发酵过程中分泌的胶体较多，这些胶体物质能干扰等电点谷氨酸结晶和菌体的别离，使母液中谷氨酸残存量增加，提取率下降。在正常发酵时，B9菌分泌的胶体量那么较少。,(9)菌体本身的等电点 T613菌体的等电点接近谷氨酸结晶的等电点，约在pH4.23.0之间，大量沉降的菌体会影响谷氨酸结晶及其别离。而B9菌提取收率较高，谷氨酸的质量较好。,2.北京棒杆菌(7338)与钝齿棒杆菌(B9)的比较,(1)细胞大小与细胞形态 B菌的细胞明显大于7338菌，故在发酵液提取谷氨酸时容易与菌体别离，提取容易，收率稳定。而7338菌因菌体细胞小，相对受噬菌体的污染稍轻。B9菌在发酵过程中有明显的菌体形态变化，菌体发生伸长、膨大，而7338菌在发酵过程中的形态变化相对不够明显。,(2)菌体本身的等电点 7338菌的等电点接近谷氨酸结晶的等电点，约在pH4.23.0之间，在该范围内，特别是在pH3.53.0左右时，菌体大量沉降，而此时的pH值也是谷氨酸最大结晶时期，这样往往会出现谷氨酸结晶与菌体别离困难。而B9菌体等电点不在该pH值范围内，因此，用B9菌发酵后道提取容易，一般收率较高，谷氨酸质量较好。,北京棒杆菌(7338)与钝齿棒杆菌(B9)的比较,(3)菌落的颜色 7338菌的菌落为乳白色，实践中发现菌落发白的突变淡白或乳白，常会提高产酸。而B9菌的菌落近草黄色，因此，7338菌的发酵液颜色比B9菌浅。由此可见，B9菌发酵过程中分泌色素较多，而7338菌发酵过程中分泌色素较少。,(4)脲酶活力 7338菌的脲酶活力比B9菌低，因此对尿素的耐受力较强，发酵初尿一般可到达1.82.0，流加尿素一般为23次。而B9菌由于脲酶活力强，对尿素耐受力自然也就相对较弱，所以初尿只能用0.8左右，流加尿素一般为46次。,北京棒杆菌(7338)与钝齿棒杆菌(B9)的比较,(5)生物素用量 7338菌的生物素要求范围比较狭窄，一般要求45g/L左右。而B9菌比7338菌粗放，生物素用量幅度大，在58g/L 内均能适应根据初糖浓度而定。,(6)生长因子 都以生物素为必需生长因子，但B9菌仅需生物素，而7338菌除此之外还要同时给予硫胺素才能生长更好。,(7)发酵周期 7338菌在整个发酵过程中，后劲比较足，而前期却不明显，所以7338菌发酵周期稍长，如果发酵时间过短，那么产酸和转化率均不够理想。,北京棒杆菌(7338)与钝齿棒杆菌(B9)的比较,(8),噬菌体类型,7338,菌与,B9,菌各自感染噬菌体的类型不同，不发生交叉感染。因此，当出现,B9,菌严重感染噬菌体时，可调换使用,7338,菌。,(9),酯酶谱带、蛋白酶谱带与代谢产物,7338,菌和,B9,菌各自的酯酶谱带和蛋白酶谱带都不相同，发酵中代谢产物的层析谱也不尽相同。,三谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化,人们发现，谷氨酸生产菌在发酵过程中会发生明显的菌体形态变化。,实践证明，在发酵过程中菌体形态有明显变化时正是发酵液中谷氨酸激增时间。,在发酵培养基含有过剩生物素时菌体那么没有明显变化，而是呈现耗糖、长菌、不产谷氨酸的异常发酵。,1.,种子的菌体形态,将斜面和一、二级种子培养的菌体，细胞形态根本相似，稍有差异。斜面培养的菌体较细小，一、二级种子比斜面菌体大而粗壮，革兰氏染色深。,菌体细胞多为短杆至棒杆状，有的微呈弯曲状，两端钝圆，无分枝；细胞排列呈单个，成对及字形，也有栅状或不规那么聚块；折断分裂的细胞大小为0.70.91.03.4m。,2.,发酵不同阶段的菌体形态,从谷氨酸发酵中菌体形态的变化来看，大致可以分为长菌型细胞、转移期细胞和产酸型细胞三种不同时期的细胞形态。以发酵周期为3036h 的正常谷氨酸发酵为例，分述如下：,发酵08h或010h为长菌型细胞，细胞形态与二级种子根本相似。这种细胞多为短杆至棒状，有的微呈弯曲状，细胞排列呈单个、成对及字形。,发酵不同阶段的菌体形态,(,续,),发酵818h或1020h时为转移期细胞，此阶段细胞形态急剧变化，细胞开始伸长、膨大，在生物素贫乏的条件下，通过再度倍增，谷氨酸非积累型细胞转变成谷氨酸积累型细胞产酸型细胞。转移期有长菌型细胞，也有产酸型细胞，产酸速度逐渐加快。,发酵不同阶段的菌体形态,(,续,),发酵1620h以后为产酸型细胞，细胞为含磷脂缺乏的异常形态，呈现伸长、膨大、不规那么，缺乏字形排列，有的呈弯曲形，边缘颜色浅，稍模糊；有的边缘折绉及至残缺不全，但菌体形态根本清楚。在发酵后期，细胞细长，多呈现有明显横隔13个甚至更多的多节细胞，类似花生状，产酸高，在糖酸转化率高时尤甚。,发酵不同阶段的菌体形态,(,续,),在有过量生物素的培养条件下，不同阶段的细胞形态那么根本上没有明显的变化。菌体比较粗壮、短胖，类似于种子培养阶段的细胞形态，多为短杆至棒状，细胞排列呈单个、成对及字形，形成的细胞为谷氨酸非积累型细胞。其发酵过程呈现典型的异常发酵，长菌体、耗糖快、耗尿素快、发酵周期短、低酸可不产谷氨酸。,3.,谷氨酸发酵感染噬菌体后的菌体形态,感染噬菌体的时期不同，菌体形态变化也不一样。,(1)发酵前期感染噬菌体,菌体细胞明显减少，细胞不规那么、发圆、发胖，缺乏字形排列，视野中有明显的细胞碎片，严重时出现拉丝、拉网，互相堆在一起，几乎找不到完整的菌体细胞，类似蛛网或鱼翅状。,在生产上表现为排气口CO2迅速下降，相继出现OD值下跌、pH上升或不上升、耗糖缓和慢等异常发酵。,当生产上出现上述情况时，应立即停止发酵，进行抢救。,谷氨酸发酵感染噬菌体后的菌体形态,(2)发酵中、后期感染噬菌体,菌体细胞形态不规那么，边缘不整齐，有的边缘似乎有许多毛刺状的东西，有细胞碎片，不同于正常发酵的产酸细胞。,OD值虽有下降，也常伴有泡沫多、粘度大、耗糖缓慢等异常现象。,有时产酸会反而偏高，以至发酵中、后期感染噬菌体被无视。,四谷氨酸生产菌的分纯、保藏和代谢控制育种,1.,定期分纯,一般,1,2,个月分纯一次，把产酸高、生长快、无噬菌体感染的菌株挑出来。,四谷氨酸生产菌的分纯、保藏和代谢控制育种,2.菌种保藏,斜面菌种的保藏法,石蜡油封存法,真空冷冻枯燥保藏方法,在一定时间内使菌种不死、不变、不乱,根本要求：,根本方法：,生活态,休眠态,培养基传代培养,寄主传代培养,冷冻,枯燥,斜面、平板,液氮、低温冰箱,沙土管、冷冻真空枯燥,微生物菌种保藏,1,斜面保藏法,方法：接种适宜斜面培养基,培养, 4,保藏,措施：低温：,4,适用：各大类,保藏期：,16,个月,用橡皮塞代替棉塞，可适当延长保藏时间,2,石蜡油封藏法,方法：斜面或半固体接种,培养,加无菌液蜡高出培养 基,1cm415,保藏,措施：低温，隔氧,适用：不能利用石油的各大类,保藏期：,12,年,优点：简便,菌种保藏方法,3 砂土管保藏法,方法：孢子或芽孢悬液 参加无菌砂土管中 枯燥 封口 保藏,措施：无营养，缺氧，枯燥,适用：产孢子芽孢微生物,保藏期：110年,4 冷冻枯燥保藏,方法：菌种培养 用保护剂悬浮 参加安醅管中低温冻结-25-40抽真空至0.01mmHg 真空封口 检查真空度 保藏,措施：低温、枯燥，缺氧，有保护剂,适用：各大类,保藏期：515年或更长,菌种保藏方法,5 甘油悬液低温冷冻保藏法,方法：菌种培养 1530%甘油缓冲液悬浮 参加保藏管中 置 -70冰箱保藏,措施：低温-70、保护剂1550%甘油,适用：细菌、酵母菌,保藏期：约10年,6 液氮保藏法,方法：菌种培养 保护剂悬浮 参加保藏管中 置液氮瓶中,措施：超低温-196、保护剂,适用：各大类,保藏期：15年,菌种保藏方法,3.,谷氨酸生产菌的代谢控制育种,(1)选育耐高渗透压菌株,(2)选育不分解利用谷氨酸的突变株,(3)选育细胞渗透性好的突变株,(4)选育强化CO2固定反响的突变株,(5)选育减弱乙醛酸循环的突变株,谷氨酸生产菌的代谢控制育种,(,续,),(6)选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到-酮戊二酸代谢的突变株,(7)选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反响调节的突变株,(8)选育强化能量代谢的突变株,(9)选育减弱HMP途径后段酶活性的突变株,(10)其他遗传标记的突变株,4.,应用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌,随着分子生物学和分子遗传学的开展，应用生物工程新技术的育种方法也被用于谷氨酸生产菌的选育，如原生质体融合法、转化、转导、原生质体转化、重级DNA技术等。,五谷氨酸生产菌种的扩大培养,三、谷氨酸发酵,一谷氨酸发酵机制,1.谷氨酸的生物合成途径,谷氨酸的生物合成包括酵解途径(EMP)、磷酸己糖途径(HMP)、三羧酸循环(TCA)、伍德-沃克曼反响CO2的固定反响等。在谷氨酸发酵中，生成谷氨酸的主要酶反响有以下三种：,(1)谷氨酸脱氢酶GHD所催化的复原氨基化反响,-酮戊二酸NH3NADPHH+L-谷氨酸 2ONADP+,(2)转氨酶(AT)催化的转氨反响,-酮戊二酸RCH(NH2)COOHL-谷氨酸RCOCOOH,(3)谷氨酸合成酶GS催化的反响,-酮戊二酸谷氨酰胺NADPH+H+2谷氨酸NADP+,在这三个反响中，复原氨基化是主导性反响，-酮戊二酸由三羧酸循环产生。,糖酵解,在谷氨酸发酵时，糖酵解经过,EMP,和,HMP,两个途径进行。生物素充足时,HMP,途径所占比例约为,38,；控制生物素亚适量，发酵产酸期,EMP,途径所占比例更大，,HMP,途径所占比例约为,26,。,四碳二羧酸的供给,如果在菌体生长后，四碳二羧酸100通过CO2固定反响供给，那么理想的发酵按如下反响进行：C6H12O6NH31/2O2谷氨酸CO23H2O，谷氨酸对葡萄糖的理论产率为81.7。,如果四碳二羧酸完全通过乙醛酸循环供给，那么由葡萄糖生成谷氨酸的总反响为：,3C6H12O62NH39O22谷氨酸8CO212H2O理论产率仅为54.4。,实际谷氨酸发酵时，由于菌体的形成，微量副产物和生物合成消耗的能量等，收率处于中间值。,四碳二羧酸的来源,在生产菌中检出CO2固定反响酶活性,磷酸烯醇丙酮酸,(PEF),羧化酶和苹果酸,酶,谷氨酸对糖的转化率到达81.7%,DCA,循环,标志酶：异柠檬酸裂解酶,在谷氨酸发酵中，,DCA,环一方面可以作为,TCA,循环有缺陷时,C4,二羧酸的补充,在谷氨基酸生产菌的生长中提供能量,作用,谷氨酸生成期中要封闭,DCA,环？,通过,DCA,环提供,C4,二羧酸时谷氨酸对糖的转化率仅为,54.4%,异柠檬酸脱氢酶活力强,提供NADPH,用于复原-酮戊二酸生成谷氨酸，形成氧化复原共扼体系,氨的导入,合成谷氨酸的反响有3种：,-,酮戊二酸,+,NH,4,+,NADPH,+,谷氨酸,H,2,O,NADP,+,+,谷氨酸脱氢酶,-,酮戊二酸,+,天冬氨酸或丙氨酸,谷氨酸转氨酶,谷氨酸,草酰乙酸,+,-,酮戊二酸,+,谷氨酰胺,NADPH,+,2,谷氨酸,NADP,+,谷氨酸合成酶,生产菌中,谷氨酸转氨酶活力低，转氨作用可以不考虑,谷氨酸合成酶由于不受高浓度谷氨酸抑制，其作用值得重视,谷氨酸脱氢酶是合成积累谷氨酸的主要酶,氨的导入时,生物素缺乏，,NH,4,+,影响糖代谢速度：提高糖代谢速度,高效合成谷氨酸,生物素充足时，,NH,4,+,不影响糖代谢速度,谷氨酸合成的调节机制,Glu,比天冬,aa,优先合成,Glu,脱氢酶,Glu对其反响抑制和反响阻遏,柠檬酸合成酶,TCA的关键酶，受能荷调节，Glu反响阻遏，乌头酸反响抑制,异柠檬酸脱氢酶,-酮戊二酸反响抑制,-,酮戊二酸脱氢酶先天丧失或微弱,PEP受Asp反响抑制，受Glu和Asp反响阻遏,细胞膜通透性控制,生物素,阻断脂肪酸的合成,影响细胞膜的合成,外表活性剂,对生物素有拮抗,阻断脂肪酸的合成,影响细胞膜的合成,在对数生长期添加青霉素,抑制细胞壁合成,细胞膜损伤,甘油缺陷型,磷脂的合成受阻,影响细胞膜的合成,油酸缺陷型,阻断不饱和脂肪酸的合成,影响细胞膜的合成,控制细胞膜渗透性的方法,(1),化学控制方法,(2),物理控制方法,控制细胞膜渗透性的方法,(1),化学控制方法,通过控制发酵培养基中的化学成分，到达控制磷脂、细胞膜的形成或阻碍细胞壁正常的生物合成，使谷氨酸生产菌处于异常的生理状态，以解除细胞对谷氨酸向胞外漏出的渗透障碍。,A.通过控制磷脂的合成，导致形成磷脂合成缺乏的不完全的细胞膜。,.阻碍谷氨酸生产菌细胞壁的合成，形成不完全的细胞壁，使细胞膜处于无保护状态进而导致细胞膜的物理损伤而增大谷氨酸向胞外的渗透性。,例如在菌体对数生长期的早期添加青霉素或头孢霉素等抗生素可到达此目的。添加青霉素可以抑制谷氨酸生产菌细胞壁的后期合成，主要是抑制糖肽转肽酶，影响细胞壁糖肽的生物合成，结果形成不完全的细胞壁。,A 通过控制磷脂的合成，导致形成磷脂合成缺乏的不完全的细胞膜,生物素缺陷型,使用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵时通过控制生物素的浓度使形成有利于谷氨酸向外渗透的磷脂合成缺乏的细胞膜。,生物素作为脂肪酸生物合成的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合成。当生物素缺乏而使磷脂合成减少到正常量的1/2左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外渗出，积累于发酵液中。,A通过控制磷脂的合成，导致形成磷脂合成缺乏的不完全的细胞膜,添加外表活性剂如吐温60或饱和脂肪酸(C1618)。,使用生物素过量的糖蜜原料发酵生产谷氨酸时，通过添加外表活性剂或高级饱和脂肪酸及其亲水聚醇酯类，同样能改变细胞膜对谷氨酸的渗透性。,在不饱和脂肪酸合成过程中，外表活性剂等作为抗代谢物具有抑制作用，对生物素有拮抗作用，因此也导致磷脂合成缺乏而形成磷脂缺乏的细胞膜，提高了细胞膜对谷氨酸的渗透性。,控制的关键是添加外表活性剂等的时间与浓度，参加药剂后让菌再次进行分裂与增殖，形成处于异常生理状态的产酸型细胞。,A通过控制磷脂的合成，导致形成磷脂合成缺乏的不完全的细胞膜,油酸缺陷型,通过限制发酵培养基中的油酸的浓度来控制细胞膜的渗透性。由于油酸缺陷型菌株丧失了自身合成油酸的能力，必须由外界供给油酸才能生长，故培养基中油酸含量的多少直接影响到磷脂合成量的多少和细胞膜的渗透性。,通过控制磷脂的合成，导致形成磷脂合成缺乏的不完全的细胞膜,甘油缺陷型：通过限制发酵培养基中甘油的浓度来控制细胞膜的渗透性。甘油缺陷型菌株不能合成-磷酸甘油和磷脂，必须由外界供给甘油才能生长。在甘油限量供给下，由于控制了细胞膜中与渗透性有直接关系的磷脂含量，使谷氨酸得以积累。,二谷氨酸发酵工艺,谷氨酸发酵工艺条件的控制,谷氨酸发酵过程可分为三个阶段,长菌阶段,转化阶段长菌型细胞向产酸型细胞转化,产酸阶段,发酵条件控制一般包括：温度、pH、种龄与接种量、泡沫、排气CO2、通风及OD值的控制。,噬菌体感染和处理方法,利用细菌或放线菌进行的发酵容易感染噬菌体。,噬菌体是病毒的一种，直径约,0,1,微米，可以通过细菌过滤器，所以通用的空气过滤器不易将其除去。,引起噬菌体感染的原因,设备的渗漏,空气系统、培养基灭菌不彻底,预防噬菌体感染的措施,发酵罐的排气管要用汽封或引入药液,(,如高锰酸钾、漂白粉或石灰水等溶液,),槽中。,取样、洗罐或倒罐的带菌液体要处理后才允许排入下水道。,把好种子关，实现严格的无菌操作。,搞好生产场地的环境卫生。车间四周要经常进行检查，如发现噬菌体即时用药液喷洒。,感染噬菌体后采用的方法,轮换使用专一性不同的菌株,加化学药物(如谷氨酸发酵可加24ppm氯霉素，0.1%三聚磷酸钠，0.6%柠檬酸钠或铵等)。,将培养液重新灭菌再接种(噬菌体不耐热，7080C经5分钟即可杀死)。,其他方法：如谷氨酸发酵在初期感染噬茵体，可以利用噬菌体只能在生长阶段的细胞(即幼龄细胞)中繁殖的特点，将发酵正常并已培养了1618小时(此时菌体己生长好并肯定不染菌)的发酵液参加感染噬菌体的发酵液中，以等体积混合后再分开发酵。实践证明，在谷氨酸发酵中，采用这个方法可获得较好的效果。,