第23章-氧化应激损伤的生物化学诊断课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第五级,*,*,全国高等医药院校医学检验专业规划教材,临床生物化学检验 （第二版）,第二十三章氧化应激损伤的生物化学诊断,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第五级,*,*,全国高等医药院校医学检验专业规划教材,临床生物化学检验 （第二版）,第二十三章氧化应激损伤的生物化学诊断,广东医学院,检验学院刘新光,第二十三章,氧化应激损伤的生物化学诊断,全国高等医药院校医学检验专业规划教材,临床生物化学检验 （第二版）,广东医学院第二十三章 全国高等医药院校医学检验专业规划教材,教学目标与要求,掌握：,自由基、活性氧、氧化应激、歧化反应的概念及脂质过氧化作用。氧化应激指标的种类。,熟悉：,氧化应激的损伤效应；主要活性氧、过氧化脂质、抗氧化酶、,NO,与,NOS,以及常用抗氧化剂的常用检测方法的原理及方法学评价。,了解：,心肌缺血再灌注、衰老的概念；氧化应激的原因，抗氧化损伤的防御系统组成与作用。,2,教学目标与要求 掌握：自由基、活性氧、氧化应激、歧化反应,目录,氧化应激的生物化学基础,1,氧化应激的生物学效应,2,抗氧化应激损伤的防御系统,3,氧化应激与临床疾病的关系,4,氧化应激指标的检测方法及评价,5,小结与展望,6,返回总目录,3,目录 氧化应激的生物化学基础 1氧化应激的生物学效应 2,第一节 氧化应激的生物化学基础,一、氧化应激的概念,氧化应激（,oxidative stress, OS,）,是指多种原因致使体内的,活性氧,(ROS ),、,活性氮,(RNS ),等相关物质产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致分子、细胞和机体的损伤。,4,第一节 氧化应激的生物化学基础 一、氧化应激的概念,活性氧,(reactive oxygen species, ROS ),如：超氧阴离子,( O,2,),、过氧化氢（,H,2,O,2,）、单线态氧（,1,O,2,）、氢过氧化物（,ROOH,）,氧自由基（,oxygen radical,）,活性氮,( reactive nitrogen species, RNS ),如：一氧化氮（,NO,）、过氧亚硝酸根（,ONOO,）,5,活性氧(reactive oxygen species, R,(,一,),外源性因素,1,电离辐射及大气污染 和X射线等 ；,2,药物 解热镇痛药、抗结核药；,3,其他 环境污染的镉、水银、铅等重金属离子,。,二、氧化应激产生的原因,6,(一)外源性因素二、氧化应激产生的原因6,(,二,),内源性因素,1,O,2,的产生,2,OH,的产生,3,吞噬细胞中活性氧的产生,4,脂质过氧化作用,7,(二)内源性因素1O2 的产生 2OH的产生7,1. O,2,的产生,SQ +O,2,Q +O,2,通过线粒体的辅酶,Q,半醌、内质网膜上细胞色素,P,450,和,Hb,、肌红蛋白、肾上腺素等,自氧化作用,均可产生,O,2,8,1. O2的产生 SQ +O2,黄嘌呤氧化酶,黄嘌呤,2O,2,H,2,O,尿酸,2O,2,2H,+,酶促氧化,过程中均可产生,O,2,胞液,中的黄嘌呤氧化酶与醛氧化酶,线粒体,中的黄素蛋白酶,内质网,中的,NADPH-,细胞色素,P,450,还原酶,质膜,上的,NADPH,氧化酶等,9,黄嘌呤氧化酶黄嘌呤2O2H2O,2,OH,的产生,O,2,+ O,2,+ 2H,+,H,2,O,2,+O,2,(,歧化,反应,),过渡金属离子,O,2,H,2,O,2,O,2,OH,OH,(,Fenton,反应,),主要是通过,Fenton,反应由,O,2,直接衍生形成：,歧化反应,是指反应中的某种底物既能作为还原剂供应电子，又可作为氧化剂接受电子。上述反应中的,O,2,就承担这种角色，故属于,歧化反应,。,10,2OH的产生O2 + O2 + 2H+,过氧化物酶体中多种需氧脱氢酶催化生成的,H,2,O,2,，如不迅速被分解，,在,Fe,2+,的催化下也可生,OH,。,H,2,O,2,Fe,2+,+H,+,OH,H,2,O,Fe,3+,11,过氧化物酶体中多种需氧脱氢酶催化生成的H2O2，如不迅速,3,吞噬细胞中活性氧的产生,H,2,O,2,除可生成,OH,外，在,Cl,存在时，经髓过氧化物酶,(,m,yelo,p,er,o,xidase, MPO),的作用，生成活性很强的次氯酸,(HOCl),和,1,O,2,，,1,O,2,是一个强的亲电子性的氧化剂。,MPO,H,2,O,2,Cl,H,2,O,OCl,OCl,H,2,O,2,H,2,O,1,O,2,Cl,MPO,12,3吞噬细胞中活性氧的产生 H,4,脂质过氧化作用,(lipid peroxidation),在过氧化条件下，脂过氧化物,LOOH,是不稳定的，能分解成一系列复杂产物。通常以小分子降解产物的数量来表示,脂质过氧化的程度,。,定义,：,机体产生的活性氧，攻击生物膜磷脂中的多聚不饱和脂肪酸,(,p,oly,u,nsaturated,f,atty,a,cid,PUFA,),引发一种,自由基链式反应,，链式地产生脂质过氧化物，这种作用就称。,返回章目录,13,4脂质过氧化作用 (lipid peroxidation),一、氧化应激对机体的生理作用,第二节 氧化应激的生物学效应,(,一,),吞噬细胞杀灭外来病原微生物,吞噬作用所产生的活性氧如,H,2,O,2,、,O,2,、,OH,、,1,O,2,和,HOCl,等可用来杀灭外来病原微生物。,14,一、氧化应激对机体的生理作用第二节 氧化应激的生物学效应,合成,凝血酶原,时，凝血酶原前体的羧化过程需要,O,2,和,CO,2,反应形成的“活性碳”。,(,二,),参与合成某些重要的生物活性物质,合成,前列腺素,时需要,H,2,O,2,和,O,2,的参与。,参与,第二信使,cAMP,和,cGMP,的,激活,等过程。,15,合成凝血酶原时，凝血酶原前体的羧化过程需要O2(二) 参,氨基酸的氧化脱氨作用需自由基的参与；,核糖核苷的还原过程需自由基的参与。,(,三,),参与许多酶促反应,羟脯氨酸、羟赖氨酸的酶促羟化作用需要,O,2,，,OH,，,H,2,O,2,或,1,O,2,的参与；,(,四,),参与解毒作用,外来物质通过细胞色素,P,450,的羟化作用达到解毒作用，,O,2,参与了羟化作用。,16,氨基酸的氧化脱氨作用需自由基的参与；(三) 参与许多酶促,自由基参与一系列的连锁反应，能引起细胞生物膜上的脂质过氧化，引起,细胞损伤,。,其机制比较复杂，主要有三方面,：,膜脂改变导致膜功能的障碍和膜酶的损伤；,脂质过氧化过程中生成的活性氧对酶和其他成分的损伤；,LOOH,的分解产物特别是醛类产物对细胞及其成分的毒性作用。,二、氧化应激对机体的损害效应,17,自由基参与一系列的连锁反应，能引起细,(,一,),氧化应激对脂类和细胞膜的破坏,膜内不饱和脂肪酸减少；,膜结构遭到破坏，使其流动性、通透性、离子转运及屏障功能受损；,溶酶体酶释放，线粒粒膨胀、酶失活等损伤；,红细胞膜破裂导致溶血；,LOOH,进一步分解产生醛类，尤其是丙二醛,(MDA),可作为交联剂导致分子间的交联聚合。,胞膜的损害则会导致细胞代谢、功能和结构的改变，后者是许多疾病的病理基础，从而可引起许多病变。,18,(一) 氧化应激对脂类和细胞膜的破坏膜内不饱和脂肪酸减少；,(,二,),氧化应激,对蛋白质和酶的损害,直接,作用于蛋白质,（,Pr,） ，与最邻近的氨基酸（,AA,）发生,Pr,过氧化；,通过,LOOH,间接,作用于,Pr,，使多肽链断裂或与个别,AA,发生氧化或使,Pr,交联，从而使,Pr,的结构发生变化，导致细胞功能紊乱。,19,(二) 氧化应激对蛋白质和酶的损害 直接作用于蛋白质（Pr）,脂质过氧化、电离辐射、其他产生的自由基的反应 可通过多种途径,影响酶活性,:,通过自由基链反应，使酶分子发生聚合；,通过,LOOH,中的,MDA,使酶分子发生交联；,通过破坏酶分子中,AA,以及与酶分子中的金属离子反应。,20,脂质过氧化、电离辐射、其他产生的自由基的反应,使,DNA,链断裂或碱基破坏、缺失，使,核酸,分子的完整性和构型受到破坏，造成遗传信息改变；,(,三,),氧化应激对核酸和染色体的损害,自由基对,DNA,的破坏可导致,染色体,变异；,电离辐射和化学物质使受损细胞的,染色体,断裂。,辐射作用于,核酸,环境中的水分子，使其电解产生,OH,和,O,2,，辐射可使,DNA,主链断裂、碱基降解和氢键破坏 ；,21,使DNA链断裂或碱基破坏、缺失，使核酸分子的完整性和构型受到,(,四,),氧化应激对糖分子的损害,使核糖、脱氧核糖形成脱氢自由基，从而造成,DNA,主链断裂或碱基破坏；,使细胞膜中的糖分子羟基化，破坏细胞膜上的多糖结构，影响细胞功能的发挥；,通过氧化降解使多糖破坏，影响组织功能。,脂类、蛋白质、核酸、糖类,一旦受损，生命活动将受到威胁，导致,细胞受损，机体患病,，如动脉粥样硬化、糖尿病、肿瘤、胃肠道功能失调、感染、免疫失调等。,返回章目录,22,(四) 氧化应激对糖分子的损害 使核糖、脱氧核糖形成脱氢自由,一、抗氧化酶类,第三节 抗氧化应激损伤的防御系统,超氧化物歧化酶（,SOD,）,过氧化氢酶（,CAT,）,硒谷胱甘肽过氧化物酶（,SeGSHPx,）,谷胱甘肽硫转移酶（,GST,）,与抗氧化作用相关的其他酶（如醛酮还原酶）,23,一、抗氧化酶类 第三节 抗氧化应激损伤的防御系统 超,超氧化物歧化酶,(,s,uper,o,xide,d,ismutase, SOD),SOD,是金属酶，包括,三种同工酶,CuZn-SOD,在真核细胞胞液中，以,Cu,2+,-Zn,2+,为辅基,Mn-SOD,在原核和真核细胞的线粒体中，以,Mn,2+,为辅基,Fe-SOD,在原核细胞中，以,Fe,3+,为辅基,SOD,2O,2,+ 2H,+,H,2,O,2,+O,2,（歧化反应 ）,24,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,2.,过氧化氢酶,(,cat,alase, CAT),CAT,2H,2,O,2,H,2,O+O,2,可清除,O,2,的歧化产物,H,2,O,2,25,2. 过氧化氢酶(catalase, CAT)CAT2H2O,3.,硒谷胱甘肽过氧化物酶,(,se,lenium dependent,g,lutathione,p,ero,x,idase, SeGSHPx),还发现一新的硒酶：,PHGSHPx,，称,磷脂氢过氧化物谷胱甘,肽过氧化物酶,，能清除生物膜上的磷脂氢过氧化物，防止生,物膜的脂质过氧化,PHGSHPx,是单体酶,SeGSHPx,是由,4,个相同亚基构成的寡聚酶,LOOH(H,2,O,2,),2GSH,LOH(H,2,O)+H,2,O,GSSG,SeGSHPx,可清除,LOOH,或,H,2,O,2,，抑制自由基的生成,26,3. 硒谷胱甘肽过氧化物酶(selenium depende,如醛酮还原酶，可催化脂肪醛和脂肪醛,-,谷胱甘肽加成物的还原，以清除脂质过氧化作用的毒性产物。,4,谷胱甘肽硫转移酶,(,g,lutathione,S,-,t,ransferase, GST),属不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶，只清除,LOOH,，而不能清除,H,2,O,2,。,LOOH,2GSH LOH,H,2,O,GSSG,GST,5,与抗氧化作用相关的其他酶,27,如醛酮还原酶，可催化脂肪醛和脂肪醛-谷胱甘肽加成物,脂溶性抗氧化剂,水溶性小分子抗氧化剂,蛋白性抗氧化剂,二、抗氧化剂,28,脂溶性抗氧化剂 二、抗氧化剂 28,1.,维生素,E,清除,O,2,、,OH,、脂过氧基,LOO,及,1,O,2,，防止脂质过氧化。,2. -,胡萝卜素,清除,1,O,2,、,LOO,、,O,2,、及,OH,，防止脂质过氧化。,3.,辅酶,Q,既参与自由基的生成也具有抗氧化作用，,CoQH,2,较氧化型的抗氧化作用强。,4.,固醇类激素,雌激素,可能与结构中的酚基相关，但大剂量可生成,O,2,，诱导肿瘤发生。,(,一,),脂溶性抗氧化剂,29,1. 维生素E 2. -胡萝卜素3. 辅酶,VC,还可,与,维生素E自由基 ( VE ),反应,，使其恢复为还原型维生素,E,，而本身变成,VC,，后者可由依赖于,NADH,的氧化还原酶系统还原成,VC,。,VC,与,VE,两者有协同作用,。,因此,VC,的总效果与其浓度有关。,VC,的不利作用,：将,Fe,3+,还原成,Fe,2+,，,H,2,O,2,存在时，可通过,Fenton,反应形成,OH,；但它又可清除,OH,。,维生素,C(,又称抗坏血酸,),能,直接与,OH,、,O,2,和,1,O,2,作用,，是机体重要的活性氧清除剂。,(,二,),水溶性小分子抗氧化剂,30,VC还可与维生素E自由基 ( VE )反,H,2,O,2,2GSH GSSG,2H,2,O,LOOH,GSH GSSG,LOH,H,2,O,OH,GSH H,2,O,GS,2GS GSSG,4.,色氨酸代谢产物,3-,羟犬尿酸，黄尿酸和,3-,羟邻氨基苯甲酸等均含有,酚羟基,，抑制脂质过氧化作用。,2.,谷胱甘肽,(GSH),为,H,2,O,2,、,LOOH,、,OH,和,1,O,2,重要清除剂。,3.,尿酸,清除,1,O,2,和,OH,，抑制脂质过氧化。,31,H2O22GSH GSSG2H2,1.,铜蓝蛋白,具有,亚铁氧化酶,活性，能催化,Fe,2+,氧化成,Fe,3+,，抑制由,Fe,2+,催化,H,2,O,2,生成,OH,的反应，从而防止,OH,引发的脂质过氧化作用。,铜蓝蛋白还是吞噬细胞呼吸爆炸生成的,氧代谢产物,O,2,和,OCl,的主要清除剂,。,(,三,),蛋白性抗氧化剂,32,1. 铜蓝蛋白具有亚铁氧化酶活性，能催化Fe2+氧化成Fe,2.,清蛋白结合的胆红素,有效地清除,1,O,2,、,O,2,和,LOO,。,保护与清蛋白结合的,不饱和脂肪酸,和,清蛋白本身,免受活性氧损伤。,肠道的抗氧化剂，保护,维生素,A,和,不饱和脂肪酸,免受氧化破坏。,胆红素在,mol/L,浓度时即能保护,血浆蛋白,免受,过氧亚硝酸致的氧化修饰，或通过清除自由基减轻,血浆蛋白损伤。,33,2. 清蛋白结合的胆红素 保护与清蛋白结合的不饱和脂肪酸和清,3.,其他血浆蛋白,清蛋白,可结合铜离子抑制,OH,形成和有效清除,OCl,。,结合珠蛋白,和,血液结合素,(hemopexin),能与,Hb,结合，,促使,Hb,由受损组织和炎症局部排出，以减轻,Hb,对组织,的损伤作用。,转铁蛋白,和,乳铁蛋白,，对铁催化的脂质过氧化作用是强,氧化剂。,转铁蛋白,还能清除,OCl,。,上述抗氧化酶与抗氧化剂,均属于机体的抗氧化防御系统,34,3. 其他血浆蛋白 清蛋白可结合铜离子抑制OH形成和有效清,2.,二甲亚砜及甘露醇,两者均有清除,OH,的作用。二甲亚砜近来已用于抗脑水肿。,1.,别嘌呤醇,黄嘌呤氧化酶的抑制剂，能降低,O,2,的生成，是心肌缺血再灌注氧自由基抑制剂，但只有在,灌注前用药，才能收到,明显,效果,。,(,四,),近年来发现的抗氧化剂,35,2. 二甲亚砜及甘露醇 两者均有清除OH的作用。二甲亚,4.,白细胞功能抑制剂,前列环素,(PGI,2,),是血管内皮细胞产生的花生四烯酸主要代谢物，能抑制血小板聚集，保护冠状动脉。它还能抑制中性粒细胞激活，减少自由基生成。,(,四,),近年来发现的抗氧化剂,3.,钙拮抗剂,尼可地平、硝苯啶、维拉帕米和硫氮卓铜等有保护细胞和升高,GSH,的作用。,36,4. 白细胞功能抑制剂 前列环素(PGI2)是血管内皮细胞,5. N-,乙酰半胱氨酸,它本身是抗氧化剂，而且还是胞内合成,GSH,的原料。,6.,普罗布可,(Probucol),是一种很强的脂溶性抗氧化剂或自由基清除剂,该药有延缓泡沫细胞发生的的能力，可用于,AS,的辅助治疗。,(,四,),近年来发现的抗氧化剂,返回章目录,37,5. N-乙酰半胱氨酸 它本身是抗氧化剂，而且还是胞内合成,一、氧化应激与心血管疾病,第四节 氧化应激与临床疾病的关系,动脉粥样硬化,(atherosclerosis,AS,),AS,的,发病机制尚未明了。,脂肪浸润、血小板聚集、血栓形成和克隆等,多种学说,从不同角度阐明了其发病机制。,近年来,自由基与,LOOH,在,AS,发病机制中的作用受到普遍关注。,高血压、高血脂、糖尿病、吸烟等,易患因素,均可增加细胞的,脂质过氧化损伤,，促进,AS,形成。,(,一,),氧化应激与动脉粥样硬化,38,一、氧化应激与心血管疾病第四节 氧化应激与临床疾病的关系动脉,自由基和,LOOH,可引起血管内皮细胞,(EC),肿胀和破损，导致动脉硬化发生。,LDL,受到自由基作用，形成过氧化低密度脂蛋白,(Ox-LDL),，大量沉积于,EC,，最终形成,AS,。,Ox-LDL,可导致血小板聚集，促使自由基大量产生，从而加速,AS,发展。,氧化应激与,LOOH,在,AS,发病机制中的作用：,39,自由基和LOOH可引起血管内皮细胞(EC)肿胀和破损，导致动,近年研究进展：,AS,的发生与,OH,和次氯酸致的,蛋白氧化修饰,存在相关性,AS,病灶中,EC,、平滑肌细胞,(SMC),及单核细胞的,SiS,基因表达,氧化应激,刺激血管,SMC,的增殖，,参与了原癌基因的激活及异常表达,从基因水平揭示,:,氧化应激与,AS,之间的密切关系,40,近年研究进展： AS的发生与OH和次氯酸致的蛋白氧化修饰存,(,二,),氧化应激与心肌缺血再灌注损伤,缺血再灌注损伤,在缺血的基础上恢复血流后，组织器官的损伤反而加重的现象。,目前心肌缺血再灌注损伤的,确切机制仍不明了,与自由基作用有关的机制有,:,脂质过氧化,细胞内钙超载,细胞成分间的交联,PGI,2,/TXA,2,失调,微循环障碍,TXA,2,：血栓素,A,2,（,thromboxane A,2,）,41,(二) 氧化应激与心肌缺血再灌注损伤,氧化应激致癌与促癌机制：,1.,氧化应激,对,DNA,的作用,2.,氧化应激,对蛋白质的作用,3.,氧化应激,对脂质的作用,4.,基因损伤与致癌、促癌的关系,42,氧化应激致癌与促癌机制： 1. 氧化应激对DNA的作用 42,1.,氧化应激,对,DNA,的作用,电离辐射可直接作用于,DNA,，产生自由基；,电离辐射也可间接产生羟基,DNA,自由基；,在有氧条件下,DNA,自由基与氧作用成为过氧由基；,这些自由基是造成,DNA,链断裂的原因。,43,1. 氧化应激对DNA的作用 电离辐射可直接作用于DNA，产,主要是修饰氨基酸残基，引起结构和构象的改变，造成,肽键断裂，聚合和交联,，造成细胞选择性生长和改变基因表达。,2.,氧化应激对蛋白质的作用,44,主要是修饰氨基酸残基，引起结构和构象的改变，,3.,氧化应激对脂质的作用,氧化应激不但可通过生物膜中的,PUFA,的过氧化,引起细胞损伤，而且还可通过,LOOH,的分解产物,引起细胞的损伤。,45,3. 氧化应激对脂质的作用,4.,基因损伤与致癌、促癌的关系,致癌物和促癌物均可造成基因损伤。,基因损伤,主要为,DNA,单链或双链的断裂，重排,或碱基修饰。,化学致癌物的最终致癌形成包括某些自由基可,选择性作用于,DNA,的核苷酸而,激活原癌基因。,46,4. 基因损伤与致癌、促癌的关系 致癌物和促癌物均可,它是生物体随着,增龄,而发生的,退行性变化的总和,，表现为机体功能活动的进行性下降，机体维持内环境恒定和对环境的适应能力逐渐降低。,人的生命周期中有一个随时间进展而表现出不断恶化，直到死亡的过程，老年医学将该过程称为,衰老,(aging,或,senscence),。,三 氧化应激与衰老,47,它是生物体随着增龄而发生的退行性变化的,1956,年,Harman,的衰老的自由基学说：,机制,：随着年龄增长，体内有大量过剩的,自由基积累,。,过多的自由基引发胞膜脂质氧化，其产物,MDA,造成细胞内核酸变性及功能障碍。,脂褐素,(lipofuscin),是衰老的基本特征,脂褐素的,形成涉及,脂质过氧化,体内过量的自由基及其所诱导的氧化反应长期使细胞受到损害，导致人体衰老和死亡。,48,1956年 Harman的衰老的自由基学说：机制：随着年龄增,1978,年,Zs-Nagy,提出的衰老膜学说,(the membrane hypothesis of aging, MHA),氧化应激诱导脂质和蛋白质交联以及质膜上所产生的残热可引起,胞膜物理,-,化学特性的改变,，且这种改变是通过随着年龄的增长而变化，从而使整个细胞产生退行性变化。,49,1978年Zs-Nagy提出的衰老膜学说(the memb,1972,年,Harman,又提出,线粒体衰老,概念,20,世纪,80,年代,Miquel,和,Fleming,提出了“,衰老的氧自由基,线粒体损伤,”的二阶段学说,1990,年,Bandy,等,阐明线粒体,DNA,突变可增加线粒体内氧应激水平由此引发衰老的出现,1992,年,Wallace,等,提出氧化磷酸水平下降与衰老和退行性病变，如阿尔茨海默氏病,(AD,亦称早老性痴呆,),与帕金森病等有关。,返回章目录,50,1972年Harman又提出线粒体衰老概念返回章目录50,第五节 氧化应激指标的检测方法及评价,一、主要活性氧的检测,二、一氧化氮与一氧化氮合酶的测定,三、抗氧化酶活性的检测,四、常用抗氧化剂的测定,五、氧化应激损伤的标志物检测,51,第五节 氧化应激指标的检测方法及评价 一、主要活性氧的检测,(,二,) OH,检测,(,三,) H,2,O,2,的检测,(,一,) O,2,的检测,一、主要活性氧的检测,52,(一) O2 的检测 一、主要活性氧的检测 52,NBT,还原法,高铁细胞色素,C,还原法,羟胺氧化法较为常用,1.,物理检测方法,(,一,) O,2,的检测,电子自旋共振,(ESR),波谱分析法直接法,电子顺磁共振,(EPR),波谱分析法间接法,优点：,操作,均,较简单,缺点：,需昂贵的仪器，应用均受到限制,2.,化学检测方法间接法,53,NBT还原法1. 物理检测方法(一) O2 的检测 电,一种较灵敏检测,O,2,的方法，其检测限量可达,1,g/L,。,具有设备简单，试剂便宜易购，操作简便，专一性好，结果较为准确等,优点,，适合于一般实验室的检测。,羟胺氧化法,O,2,能与羟胺溶液反应生成,NO,2,，,NO,2,与对氨基苯磺酸和,-,萘胺显色，在波长,530nm,处有专一吸收峰，其颜色深浅与产生的,O,2,呈量效关系。,【,方法学评价,】,【,注意事项,】,严格控制反应系统,pH,8.0,，尽可能降低反应中的溶解氧及铁含量，这样测出的,O,2,产生速率才更接近实际水平。,54,一种较灵敏检测O2的方法，其检测限量可达1g/L。具有设,(,二,) OH,检测,原理,是无荧光的对苯二甲酸与,OH,反应形成强荧光的羟,-,对苯二甲酸加成物，,315nm,激发，可发射,425nm,荧光，可检测受物理因素及化学因素处理后水溶液中产生的,OH,。,自旋捕捉法,气相色谱法,(GC),高效液相色谱,(HPLC),优点：,准确度较高,缺点：,操作繁琐，仪器,昂贵，,不便推广,优点：,操作简便，测定快速，灵敏度,较高，稳定性较好。,缺点：,特异性不太高，需化学发光仪,分光光度法,荧光分析法,方法简便，易为一般实验室采用,化学发光法,55,(二) OH检测,【,原理,】,利用,H,2,O,2,/Fe,2+,体系通过,Fenton,反应产生的,OH,，使邻二氮菲,-Fe,2+,在,536nm,处的最大吸收峰消失，根据反应前后,A,536,下降值,进行计算。,分光光度法,溴邻苯三酚红光度法,【,原理,】,利用,H,2,O,2,/Fe,2+,体系通过,Fenton,反应产生的,OH,与溴邻苯三酚红,形成有,560nm,处,吸收峰的有色化合物，根据反应前后,A,560,的升高值,进行计算。,邻二氮菲,-Fe,2+,氧化法,细胞色素,C,氧化法,水杨酸比色法,这两种方法稳定性好、操作简便、测定快速。,56,【原理】利用H2O2/Fe2+体系通过Fent,(,三,) H,2,O,2,的检测,碘滴定法,分光光度法,化学发光法,荧光法,通过测定,CAT,和过氧化物酶的活性,也可估测,H,2,O,2,的水平,H,2,O,2,是最稳定的活性氧,检测方法,:,57,(三) H2O2的检测 碘滴定法H2O2是最稳定的活性氧检,1.,分光光度法,过氧化物酶,-,氧化酶法,Fe,2+,-,邻二氮菲分光光法,碘化钾比色法,58,1. 分光光度法过氧化物酶-氧化酶法 碘化钾比色法58,碘化钾比色法,快速、简便、重复性好，适合于溶液中,mol/L,水平的日常测定。,【,原理,】,H,2,O,2,+KI,I,2,钼酸铵,蓝色化合物,淀粉,【,方法学评价,】,59,碘化钾比色法 快速、简便、重复性好，适合于溶液,过氧化物酶,-,氧化酶法,经典的比色法，整个反应过程约,20min,，是一种操作简便、灵敏度较高,(,可达,10,-9,mol/L,水平,),的方法。,【,原理,】,在,弱酸性环境,下，过氧化物酶,-,氧化酶反应中的,NADH,往往被完全消耗。,而在,较高,pH,值环境,下，,NADH,至少在反应的开始阶段并不完全被消耗，测定,A,340,下降值,计算,NADH,被消耗量,。,【,方法学评价,】,60,过氧化物酶-氧化酶法 经典的比色法，整个反,2. NADPH,氧化法,两方法,灵敏度均较高。,前者,无需制作,H,2,O,2,的校正曲线，操作简便，,适用于大批量样品的同时测定。,后者,适用于生物反应体系中微量,H,2,O,2,测定。,【,原理,】,测定体系中,NADPH,的氧化与,H,2,O,2,的含量成正比,GSH-NADPH,氧化法,Scopoletin-NADPH,氧化法,【,方法学评价,】,61,2. NADPH氧化法 两方法灵敏度均较高。 【原理】测定,二、一氧化氮与一氧化氮合酶的测定,(,一,),一氧化氮,(NO),测定,NO,含量少，且极不稳定,较难直接测定其含量。,常用测定,NO,含量的方法多利用,NO,的化学性质，测定其终末产物,NO,3,和,(,或,)NO,2,的含量,来反映组织细胞,NO,的含量。,物理方法,有微电极法和,EPR,法，优点是灵敏度较高，可实时检测，但需昂贵仪器限制了应用。,化学方法,有,Griess,试剂法、硝酸盐还原酶法、荧光分光光度法、催化光度法、化学发光法，其中以,Griess,试剂法最为常用,。,62,二、一氧化氮与一氧化氮合酶的测定 (一) 一氧化氮(NO),1. Griess,试剂法：,A,550,与,NO,2,或,NO,的产量成正比，据此测定,NO,2,+,对氨基苯磺酸 重氮化合物,pH7.5,8.1,重氮化合物,+N-(1-,萘基,)-,乙二胺 紫红色产物,偶联,550nm,本法,稍加修改,即可用于测定样品中的,总硝酸盐含量,(NO,3,与,NO,2,浓度之和,),。,(,一,),一氧化氮,(NO),测定,63,1. Griess试剂法： A550与NO2或NO的产量成,加合物,+N-(1-,萘基,)-,乙二胺,Griess,反应,NO,3,NO,2,铜离子活化镉,NO,2,+,对氨基苯磺酸 加合产物,H,+,测,A,550nm,，即可求出,NO,2,测,NO,3,时可将其先还原成,NO,2,，再测。,因血清中,NO,3,NO,2,，,NO,2,很低,，因而测定结果主要反映血清中,NO,3,的含量。,64,加合物+N-(1-萘基)-乙二胺,无需特殊的设备和昂贵试剂，操作简便迅速，在一般实验室、,均可开展，是目前使用最普遍的方法，适用于大批,量样品测定。,本法测的是,NO,2,含量,属于间接测定,NO,量，其特异性较差。,NO,的还原可采用铜离子活化镉还原法或硝酸盐还原酶法。,【,方法学评价,】,65,无需特殊的设备和昂贵试剂，操作简便迅速，在一般实验室、【方,测定光子量，可代表组织细胞,NO,的含量。,可用,NO,气体制作校正曲线，直接测定样品中的,NO,。,2.,化学发光法,通过酸化或,/,和加入还原剂，使样品中的亚硝酸盐释放,NO,NO+O,3,激发态,NO,2,*,发光,返回基态,样品用量较少，灵敏度较高，测定范围,50,250pmol NaNO,2,易受样品中其他因素的干扰，测定的,NO,含量并不完全代表组织细胞实际的,NO,量。,【,方法学评价,】,66,测定光子量，可代表组织细胞NO的含量。2. 化学发光法,一般的,Griess,法仅测定,NO,2,或,NO,3,的含量，且,Pr,的,NO,衍生物均被脱蛋白的步骤除去。,本法基于所有,NO,相关复合物均可被热裂解为硝酸盐。血浆,Pr,可通过热变性而除去，避免其干扰。,3.,全血,NO,代谢产物的测定,血液中,NO,代谢产物除,NO,3,/NO,2,外，还包括,S-,亚硝基血红蛋白，亚硝酰血红蛋白等,S-,亚硝基,/,亚硝酰化合物，其,总称,为,NO,代谢产物。,67,一般的Griess法仅测定NO2或NO3的含量，且Pr的,激发波长,365nm,，发射波长,426nm,条件下测荧光强度,NO,2,+,2,，,3-,二氨基萘,1-(H)-,萘三唑,H,+,测定血中,NO,代谢产物总量，待测样品可为溶血或全血标本，测定结果可较全面反映,NO,代谢情况。,其他方法因易受,Hb,或其他,Pr,影响，不宜用全血标本测定。,【,方法学评价,】,68,激发波长365nm，发射波长426nm条件下测荧光强度NO2,(,二,) NOS,测定,1.,化学发光法,2.,血红蛋白法,3. NADP,+,检测法,69,(二) NOS测定 1. 化学发光法 69,1.,化学发光法,加入去铁乙胺可消除,H,b,对测定的干扰,NO+L-,瓜氨酸,NOS,O,2,L-,精氨酸,+,NO+,H,2,O,2,ONOO,化学发光,OH,鲁米诺,加入,SOD,可消除,O,2,对测定结果的影响,70,1. 化学发光法 加入去铁乙胺可消除Hb对测定的干扰,2.,血红蛋白法,HbO,2,和,MHb,光谱特性有,pH,依赖性，,pH7.7,时：,HbO,2,于,401nm,有最大光吸收,MHb,与,HbO,2,混合液在,411nm,有等位光吸收峰,测定,A,401,和,A,411,的,变化,可监测,NO,产量的变化，,反映,NOS,活性,NO+HbO,2,MHb,NO+L-,瓜氨酸,NOS,L-,精氨酸,+O,2,71,2. 血红蛋白法HbO2和MHb光谱特性有pH依赖性，pH7,3. NADP,+,检测法,测定,NADP,+,在,370nm,激发波长下产生,465nm,发射波长的荧光强度，可反映样品中,NOS,活性。,NADP,+,的量可依靠酶催化循环扩增，可明显提高对,NADP,+,检测灵敏度。,SQ +O,2,+NADPH+H,+,Q + O,2,+NADP,+,优势是可用于检测含有内源性,Arg,的粗制品,缺点是,NADP,+,的生成缺乏特异性,【,方法学评价,】,NO+L-,瓜氨酸,NOS,L-,精氨酸,+O,2,72,3. NADP+检测法 测定NADP+在370nm激发波长下,三、抗氧化酶活性的检测,(,一,),超氧化物歧化酶,(SOD),测定,(,二,),谷胱甘肽过氧化物酶测定,(,三,),过氧化氢酶,(CAT),测定,73,三、抗氧化酶活性的检测 (一) 超氧化物歧化酶(SOD),直接法,一般化学法,化学发光法,(,一,) SOD,测定,测酶活性,免疫学方法,测酶质量,电泳法,74,直接法(一) SOD测定 测酶活性免疫学方法,特异性强，所需样本量少,(,仅,50,l,),，操作快速简单，重复性好，灵敏度高，试剂简单。,1.,一般化学法,:,邻苯三酚自氧化法,(,改良,Marklund,法,),在碱性条件下，邻苯三酚自氧化成红桔酚，用紫外,-,可见光谱跟踪波长为,325nm,、,420nm,或,650nm(,经典为,420nm),同时产生,O,2,，,SOD,催化,O,2,发生歧化反应从而抑制邻苯三酚的自氧化，样品对邻苯三酚自氧化速率的抑制率，可反映样品中的,SOD,含量。,【,方法学评价,】,75,特异性强，所需样本量少(仅50l)，操作快,属间接法中的经典方法，但本法灵敏度较低。,1.,一般化学法,:,细胞色素,C,还原法,(McCord,法,),【,方法学评价,】,黄嘌呤,-,黄嘌呤氧化酶体系中产生的,O,2,使细胞色素,C,氧化型还原为还原型，后者在,550nm,有最大光吸收。,将抑制反应的百分数与,SOD,浓度作图可得到抑制曲线，由此计算样品中,SOD,活性。,在,SOD,存在时，一部分,O,2,被,SOD,催化而歧化，,O,2,还原细胞色素,C,的反应速度则相应减少。,76,属间接法中的经典方法，但本法灵敏度较低。 1. 一般化学法,2.,化学发光法,可应用于,SOD,的微量测定,灵敏度高，简便易行,特异性准确性与细胞色素,C,还原法类似,黄嘌呤或次黄嘌呤 尿酸,+O,2,黄嘌呤氧化酶,O,O,2,+,鲁米诺 化学发光,SOD,能清除,O,2,从而抑制鲁米诺的化学发光,【,方法学评价,】,77,2. 化学发光法可应用于SOD的微量测定黄嘌呤或次黄嘌呤,4.,免疫学方法,测定,SOD,质量，特异性较好，是,较理想的方法。,只能测定,Ab,相应的,Ag,，对于检测不同种类的,SOD,，则须制备相应的特异性,Ab,，,手续繁琐,。,放射免疫法,化学发光免疫分析法,ELISA,法,【,方法学评价,】,78,4. 免疫学方法 测定SOD质量，特异性较好，是较理想的,(,二,),谷胱甘肽过氧化物酶测定,两者的区别在于其活性结构中是否含硒,non-SeGSHPx,只能催化除,H,2,O,2,外的过氧化物还原,SeGSHPx,则可催化,H,2,O,2,及其他过氧化物还原,谷胱甘肽过氧化物酶,(GSHPx),有,两种,硒谷胱甘肽过氧化物酶,(,SeGSHPx,),非硒谷胱甘肽过氧化物酶,(,non-SeGSHPx,),79,(二) 谷胱甘肽过氧化物酶测定 两者的区别在于其活性结构中,1. DTNB,直接显色法,2.,酶偶联连续监测法,3.,荧光测定法,SeGSHPx,的测定,80,1. DTNB直接显色法 SeGSHPx的测定 80,1. DTNB,直接显色法,测定该离子的浓度即可计算出,GSH,减少量，以此求得,SeGSHPx,活性。,LOOH(H,2,O,2,),2GSH LOH(H,2,O)+H,2,O,GSSG,SeGSHPx,GSH,5,，,5,-,二硫代双，,2-,硝基苯甲酸,黄色,(DTNB),5-,硫代，,2-,硝基苯甲酸,残留的,81,1. DTNB直接显色法 测定该离子,2.,酶偶联连续监测法,LOOH(H,2,O,2,),2GSH LOH(H,2,O),H,2,O,GSSG,SeGSHPx,GSSG + NADPH + H,+,2GSH + NADP,+,GSH,还原酶,特异性强、灵敏度高，适用酶含量不高的样品,GSH,还原酶的成本高是本法,缺点,【,方法学评价,】,340nm,82,2. 酶偶联连续监测法LOOH(H2O2)2GSH,源自,GSH,的荧光分析法,2GSH + H,2,O,2,GSSG +2H,2,O,GSH + OPA,荧光复合物,3.,荧光测定法,随着反应的进行，,GSH,不断被消耗，经一定时间的酶反应后，中止反应。,剩余的,GSH,与邻苯二甲醛,(,OPA,),在一定,pH,条件下生成较特异性的荧光复合物。,通过测定其荧光强度即可测定,SeGSHPx,活性。,83,源自GSH的荧光分析法3. 荧光测定法随着反应的进行，GSH,(,三,),过氧化氢酶,(CAT),测定,1.,钼酸铵比色法,2.,快速简便法,3.,改良比色法,4.,化学发光法,84,(三) 过氧化氢酶(CAT)测定 1. 钼酸铵比色法84,1.,钼酸铵比色法,反应迅速达到平衡，至少稳定,60min,，生成的黄色化合物的,A,405,取决于,H,2,O,2,和钼酸铵的浓度。,CAT,2H,2,O,2,H,2,O+O,2,+,钼酸铵 黄色化合物,405nm,残留的,H,2,O,2,测定波长为,360nm,，测定温度为,25,。,2.,快速简便法,85,1. 钼酸铵比色法 反应迅速达到平,3.,改良比色法,在波长,570,610nm,进行比色测定铬酸醋酸钾的生成量，可反映,H,2,O,2,的含量。,CAT,简便、快速、显色稳定、重复性好，不需特殊试剂及仪器设备，适用于一般实验室使用。,2H,2,O,2,H,2,O+O,2,(,加醋酸重铬酸钾,迅速中止,),570,610nm,剩余的,H,2,O,2,+,醋酸重铬酸钾 铬酸醋酸钾,【,方法学评价,】,86,3. 改良比色法 在波长57061,4.,化学发光法,CAT,可引起化学发光强度减弱，由此计算总,CAT,活性。,CAT,2H,2,O,2,H,2,O+O,2,H,2,O,2,+,鲁米诺,+ Co,2+,发出强烈蓝光,87,4. 化学发光法 CAT可引起化学发光强度减弱，由此计,四、常用抗氧化剂的测定,(,三,),维生素,C,测定,(,一,),还原型谷胱甘肽,(GSH),测定,1,改良比色法,2,荧光测定法,3,HPLC,法,(,二,),维生素,E,测定,1,荧光法,2,HPLC-,分光光度法,3,HPLC-,荧光分析法,1,DNPH,比色法,2,荧光分析法,3,氧化酶法,4,HPLC,法,88,四、常用抗氧化剂的测定 (三) 维生素C测定(一) 还原型,测,A,412,，即可测定巯基,1.,改良比色法,本法适用于血红细胞,GSH,含量的测定，采血量及试剂用量较少，更适用于儿童。,DTNB+2GSH 2-,硝基,-5-,巯基苯甲酸,+GSSG,黄色,【,方法学评价,】,DTNB,：,5,，,5,-,二硫代双，,2-,硝基苯甲酸,(,一,),还原型谷胱甘肽,(GSH),测定,89,测A412，即可测定巯基1. 改良比色法,2.,荧光测定法,灵敏度大大高于分光光度法,本法适用于测定血小板中,GSH,邻苯二醛,(OPT) +GSH GSH-OPT,【,方法学评价,】,在激发波长,345nm,及发射波长,425nm,条件下,测荧光，对,GSH,定量,90,2. 荧光测定法 灵敏度大大高于分光光度法邻苯二醛(OPT),3. HPLC,法,本法样品用量少，测定结果准确，灵敏度高,GSH,最低检出限为,3ng,。,缺点,：需,HPLC,仪，在一般实验室较难完成。,邻苯二醛,(OPT) +GSH GSH-OPT,【,方法学评价,】,HPLC,可有效地用于分离样品液中的,GSH,根据,OPT,荧光法检测,GSH,的原理，通过分离的,GSH,峰测定样品,GSH,。,荧光检测激发波长,338nm,，发射波长,425nm,。,91,3. HPLC法 本法样品用量少，测定结果准确，灵敏度高邻,(,二,),维生素,E,测定,维生素,E,是一族维生素的总称，目前已知有,7,种,常见的有,、,、,和,4,种,本法灵敏度较高，是测定维生素,E,的,经典方法。,【,方法学评价,】,维生素,E,同系物的分子结构中存在相同的共轭双键体系，检测在激发波长,296nm,，发射波长,340nm,条件下的荧光，可对维生素,E,定量。,1.,荧光法,92,(二) 维生素E测定 维生素E是一族维生素的总称，目前已,-,生育酚,于,292nm,有特异性光吸收,胡萝卜素,于,450nm,有较大光吸收,2. HPLC-,分光光度法,生物样品中,-,生育酚及胡萝卜素可经过,HPLC,法较好地分离开来，通过检测不同波长下的光吸收值可测定样品中的它们的含量。,93,-生育酚于292nm有特异性光吸收2. HPLC-分光光,HPLC,分离样品中维生素,E,维生素,E,在激发波长,296nm,下可发射,340nm,的荧光,根据测试对样品纯度要求选择不同的样品处理方法,3. HPLC-,荧光分析法,HPLC,法大大提高了分析的准确度，且能同时,分离和测定各种维生素,E,同系物。,缺点,是仪器设备较昂贵，分析成本高,不适 应于常规检测的要求。,【,方法学评价,】,94,HPLC分离样品中维生素E3. HPLC-荧光分析法 H,1.,2,，,4-,二硝基苯肼,(DNPH),比色法,抗坏血酸 脱氢抗坏血酸,脱氢抗坏血酸,+DNPH 2,，,4-,二硝基苯腙,硫脲及硫酸铜,H,+,520nm,本法测的是样品中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸,总量,如,省去氧化,步骤，样品稳定，则可测脱氢抗坏血酸含量,是分光光度法较为理想的方法之一,特异性不高，其他碳氢化合物可干扰，,加入硫脲,可增加,DNPH,反应的特异性。,【,方法学评价,】,(,三,),维生素,C,的测定,95,1. 2，4-二硝基苯肼(DNPH)比色法抗坏血酸,2.,荧光分析法,抗坏血酸 脱氢抗坏血酸,脱氢抗坏血酸,+,邻苯二胺 脱氢抗坏血酸对,-,氮杂萘,测定在激发波长,350nm,，发射波长,430nm,的荧光,本法测定的是抗坏血酸与脱氢抗坏血酸的总量,96,2. 荧光分析法 抗坏血酸,3.,氧化酶法,抗坏血酸,脱氢抗坏血酸,抗坏血酸氧化酶,脱氢抗坏血酸,+F,e,3+,+2,，,4,，,6-,三,(2-,吡啶基,)-S-,三嗪 生色物,593nm,优点是不必对生物样品进行过多的纯化处理，甚至不用脱蛋白,样品中的,脱氢抗坏血酸,须用其他方法测定,【,方法学评价,】,97,3. 氧化酶法 抗坏血酸,4. HPLC,法,最好的方法,，先层析法将样品中的成分分离，再用柱后检测器检测。,HPLC-,紫外分光光度法,(2) HPLC-,电化学检测法,是此类方法中最为简单的一种,最为理想,的测定生物样品中抗坏血酸含量的,方法,返回章目录,98,4. HPLC法 最好的方法，先层析法将样品,（一）脂质过氧化标志物检测,（丙二醛、脂氢过氧化物）,（二）蛋白质氧化损伤指标检测,（三）,DNA/RNA,损伤检测,五、氧化应激损伤的标志物检测,99,（一）脂质过氧化标志物检测五、氧化应激损伤的标志物检测,1.,丙二醛,(MDA),的测定,TBA,比色法,操作简便、重复性好，是,最常见测定方法,本法的线性范围约在,5.0,20mmol/L,本法回收率较低，约为,60%,80%,本反应,缺乏,特异性，测定结果以,MDA,的相对含量表示,影响因素较多,【,方法学评价,】,过氧化脂质中的,MDA,与硫代巴比妥酸,(TBA),缩合，形成,红色化合物,，在,532nm,处有极大吸收峰。,（一）脂质过氧化标志物检测,100,1. 丙二醛(MDA)的测定TBA比色法 操作简便、重复,灵敏度高，最低检出限,0.16,mol/L,样品中的,G,、,Ch,、,TG,、,Pr,等均,不干扰,测定,操作较简便，结果准确，荧光稳定，不需特殊试剂，,经济方便。,【,方法学评价,】,MDA,可充分与,TBA,形成荧光缩合物,荧光产物的最大激发波长为,525nm,1.,丙二醛,(MDA),的测定,TBA,荧光法,101,灵敏度高，最低检出限0.16mol/L 【方法学评价】,快速简便，特异性很高和灵敏度较高。,易产生干扰，,预先加入,CAT,除去体系中的,H,2,O,2,，可防止测定过程引起的过氧化干扰。,2.,脂氢过氧化物,(LOOH),的测定,SeGSHPx,法,【,方法学评价,】,LOOH(H,2,O,2,),2GSH LOH(H,2,O)+H,2,O,GSSG,SeGSHPx,GSSG+NADPH+H,+,2GSH+NADP,+,GSH,还原酶,102,快速简便，特异性很高和灵敏度较高。2. 脂氢过氧化物(LOO,测,A,580,可反映,LOOH,量,LOOH,Fe,2+,-,二甲酚橙,Fe,3+,-,二甲酚橙复合物,(,FOX,),H,+,440nm,有吸收峰,560,580nm,有吸收峰,2.,脂氢过氧化物,(LOOH),的测定,FOX,法,2.,脂氢过氧化物,(LOOH),的测定,亚甲基蓝法,测定,A,666,可计算,LOOH,含量,LOOH,亚甲基蓝衍生物 产物,血红素或肌球蛋白,666nm,103,测A580可反映LOOH量LOOHFe2+-二甲酚橙,（二）蛋白质氧化损伤指标检测,1.,蛋白质羰基化的,测定,2,4-,二硝基苯肼法：生成苯腙。经典方法,硼氢化钠法：硼氢化钠中,3,H,掺入蛋白质中将羰基还原为醇，通过,3,H,反应物的放射性强度测定,蛋白质羰基含量,荧光素肼法：羰基与荧光素肼反应生成腙类化合物,荧光胺法：羰基与荧光胺反应形成,Schiff,碱，硼氢化钠将,Schiff,碱还原成仲胺，分光光度法测定其含量,酶联