质粒转化大肠杆菌-课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/11/13,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/11/13,*,*,质粒转化,大肠杆菌,2020/11/13,1,质粒转化大肠杆菌2020/11/131,1、重组质粒的鉴定,当质粒的重组或其他载体重组后，通常会发生质粒的重组失败，包括质粒的本身环化。因而要求进行筛选，把重组成功的质粒找出来。,在目前常用的质粒和其他载体中含有相应的抗生素抗性基因，若重组成功，或不含质粒的自身环化，抗生素抗性基因表达，被转化的大肠杆菌便具备抵抗相应抗生素的能力，可以在含该抗生素的培养基上生长传代。若重组失败，大肠杆菌便不能抵抗该抗生素而死亡。,2、为扩增质粒和其他载体作准备,由于大肠杆菌繁殖快，在适宜的条件下繁殖一代仅需要20-30min，而且常用质粒可以在大肠杆菌中增殖达到几百个拷贝。因此，通过对转化成功的大肠杆菌培养，可以在短时间内极大的扩增目的质粒。,一、实验,目的,2020/11/13,2,一、实验目的2020/11/132,精品资料,精品资料,你怎么称呼老师？,如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？,你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？,教师的教鞭,“不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘 ”,“太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早”,质粒转化大肠杆菌-课件,二、实验原理,通过,CaCl,2,对特定的大肠杆菌处理，制备感受态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重组质粒，产生510,6,210,7,个转化的菌落。,当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠杆菌的表面，在42时，大肠杆菌出现,热休克,，质粒可通过,大肠杆菌细胞膜上形成的空隙,进入菌体内。随后，加入LB培养液，于37振动培养可使细菌复苏，并且,表达质粒编码的抗生素抗性基因,，提高转化效率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代，形成菌落。,2020/11/13,5,二、实验原理 通过CaCl2对特定的大肠杆菌处理，制备,三、实验流程：,灭活,物,/质粒,转化大肠杆菌,挑菌,摇菌,菌液PCR,2020/11/13,6,三、实验流程：灭活物/质粒转化大肠杆菌挑菌摇菌菌液PCR20,四、实验方法-冻融法,连接产物灭活,7,0，10min,（冰上解冻）大肠杆菌感受态细胞,5,0,l,、,灭火物10,l,混合物，冰上放置,3,0min,42,9,0sec,冰上2min,加入1000,ulLB,液体（无抗）,37，振荡1h,离心10000rpm,1min,RT,去上清800,l,留下200,l上清于1.5ul离心管中重悬,涂板,37恒温箱，倒置培养12h(时间不得超过20h),2020/11/13,7,四、实验方法-冻融法连接产物灭活70，10min（冰上,1、无菌落，失败，或培养条件不充分。,2、菌落布满如苔样，失败，可能是抗生素浓度不够或失效。,3、菌落布满，抗生素浓度太高，失败。,4、出现菌落，符合要求。,（1）,（2）,（3）,（4）,2020/11/13,8,1、无菌落，失败，或培养条件不充分。（1）（2）（3）（4）,五、结果分析和失败原因,（,1）有菌落，说明转化成功，但有两种可能性：其一，质粒自身环化；其二，重组成功。,（2）无菌落，说明实验没成功。,（3）菌落布满如苔样，可能是抗生素浓度不够或失效。,（4）出现大菌斑，大多数是霉菌污染所致。,1、结果分析,2020/11/13,9,五、结果分析和失败原因（1）有菌落，说明转化成功，但有两种可,1、,平板中的抗生素部分失效，长出的克隆是杂菌,。,2、倒Ka平,板时,，,培养基,太烫，应,冷却到50,以下,加Ka抗生素,。,2、,涂板时来回,用力过大,，涂布环或者涂布棒,灼烧,过热,，,或不待冷却就涂,布,。,3、感受态细胞长时间处在常温状态，会严重影响其转化，操作时动作迅速。,4、操作时动作过于剧烈，减少对细胞的机械损伤。,切记感受态细胞比较娇嫩。,5、操作过程不规范，染菌。,2、转化失败的原因,2020/11/13,10,1、平板中的抗生素部分失效，长出的克隆是杂菌。2、转化失败的,六、大肠杆菌感受态细胞的制备,（1）,从LB平板上挑取新活化的,E.coli,TOP10,单菌落,于50ml LB培养基中，37振荡过夜；,（2）将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37振荡培养2-3小时至OD6000.5左右；,（3）将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4下4100rpm离心10,min,。,（4）弃掉上清,加入3,0ml0.1mol/L,预冷的CaCl,2,溶液，重悬，冰上放置15-30min后，4下4100,rpm,离心10,min,；,（5）弃掉上清，加入2ml预冷的0.1mol/L的CaCl，加入无菌甘油300,l,，重悬混匀,冰上放置几分钟；,（6）分装，每管100l，液氮冷冻后,保存于-70冰箱。,2020/11/13,11,六、大肠杆菌感受态细胞的制备（1）从LB平板上挑取新活化的E,七、挑菌、摇菌,（1）离心管标号,（2）每个管内吸入650,l,LB+Ka 抗生素,（3）用牙签挑取单个菌,（4）摇床上摇菌（时间大于8h）,准备：离心管、牙签、镊子、LB+抗生素,2020/11/13,12,七、挑菌、摇菌 准备：离心管、牙签、镊子、LB+抗生素20,八、,蓝白斑筛选原理,蓝白斑筛选,-,筛选重组子：根据载体的遗传特征筛选重组子，如-互补、抗生素基因等。,现在,许多载体都,含,有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS）,。,受体菌则含编码,-半乳糖苷酶C端,aa的序列。当外源基因插入时，二者溶为一体后，有,-半乳糖苷酶,表达,，在生色底物5-溴-4-氯-3吲哚-,-,D-,半乳糖苷,（X-gal）培养基中形成,蓝色,菌落。,而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使lacZ基因,不表达,而形成,白色,菌斑。通过颜色不同而区分重组子和非重组子。,2020/11/13,13,八、蓝白斑筛选原理 蓝白斑筛选-筛选重组子：根,蓝白,斑,筛选,：,（1）,未转化的菌不具有抗性，不生长；,（2）,转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；,（3）,转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。,2020/11/13,14,蓝白斑筛选：2020/11/1314,九、菌液PCR验证,加样：,easy buffer:2.5l样数,DNTP：1.5l样数,M13R:1l样数,M13F:1l样数,easy Taq:0.2,l,样数,混匀、离心,分装,样品,跑电泳,跑PCR,混匀、离心,加菌液1,l,（酒精灯前）,2020/11/13,15,九、菌液PCR验证 加样：混匀、离心 分装样品 跑电,电泳图,：,2020/11/13,16,电泳图：2020/11/1316,谢 谢！,2020/11/13,17,谢 谢！2020/11/1317,