第-10-章-基因诊断-课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1,第,10,章 基因诊断,Gene diagnosis,1 第 10 章 基因诊断,2,本章内容提示,基因诊断概念,基因诊断方法,直接诊断（,Southern,）,间接诊断（,PCR-RFLP,）,DNA,多态,基因诊断 实例：,2 本章内容提示 基因诊断概念,3,第一节 基因诊断技术,第二节 基因诊断方法及实例,3第一节 基因诊断技术,4,基因诊断：,利用分子生物学技术从,DNA,水平检测人类遗,传性疾病的基因缺陷，又称,DNA,分析法。,传统的诊断：表现型基因型,基 因 诊 断：基因型表现型,（ 逆向诊断）,4,5,基因诊断的特征：,1,不受材料来源影响,外周血、活体穿刺组织、孕妇外周血、血斑等,2,症状前诊断,尤其对于一些延迟显性疾病如,Huntingtong,舞蹈病,3,产前诊断,避免患儿出生，提高人口质量,5基因诊断的特征：1 不受材料来源影响,6,第一节 基 因 诊 断 技 术,Southern,印迹杂交,6第一节 基 因 诊 断 技 术Southern印迹杂交,7,基 因 诊 断 技 术,Northern,印迹杂交,7基 因 诊 断 技 术Northern印迹杂交,8,基 因 诊 断 技 术,斑 点 杂 交,点样,Probe-,32,P,检测,A,B,1 2 3 4,8基 因 诊 断 技 术斑 点 杂 交点样Probe-,9,基 因 诊 断 技 术,荧光原位杂交,9基 因 诊 断 技 术荧光原位杂交,10,基 因 诊 断 技 术,荧光原位杂交,10基 因 诊 断 技 术荧光原位杂交,11,基 因 诊 断 技 术,聚合酶链反应,11基 因 诊 断 技 术聚合酶链反应,12,基 因 诊 断 技 术,聚合酶链反应,12基 因 诊 断 技 术聚合酶链反应,13,基 因 诊 断 技 术,多重,PCR,在一个,PCR,体系中加入数对,PCR,引物，覆盖区域不重叠,用于检测同一基因多个外显子的缺失,E1 E2 E3,13基 因 诊 断 技 术 多重PCR在一个PCR体系中加,14,基 因 诊 断 技 术,RT-PCR,以,mRNA,为模板，经逆转录酶合成,cDNA,用于研究基因表达,使微量,mRNA,迅速扩增，提高,mRNA,检出的灵敏度,14基 因 诊 断 技 术 RT-PCR以mRNA为模板，,15,基 因 诊 断 技 术,PCR-SSCP,（,Single Strand Conformation Polymorphism,）,单链,DNA,由于碱基序列不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链,DNA,电泳迁移率的不同。据此，可用于,DNA,中单个碱基的替代、微小的缺失或插入的检测。,15基 因 诊 断 技 术 PCR-SSCP单链DNA由于,16,基 因 诊 断 技 术,- primer,-, 32,P-dNTP,掺入,PCR,扩增,产物,变性,单链,DNA,中性聚丙烯酰胺凝胶电泳,1 2 3 4 5,自显影,1,为正常,结果分析,2,、,4,、,5,为纯合患者,3,为杂合子,.,16基 因 诊 断 技 术 -,17,基 因 诊 断 技 术,生 物 芯 片,17基 因 诊 断 技 术生 物 芯 片,18,第二节 基 因 诊 断 方 法及实例,直接诊断,直接,检测致病基因的突变,基因突变类型,缺失、点突变、重复、插入等,间接诊断,应用,DNA,多态为遗传标记进行连锁 分析，确定待测者是否得到带有致病的染色体，从而,间接,地作出诊断,DNA,多态,RFLP,、,VNTR,、,SNP,18第二节 基 因 诊 断 方 法及实例直接诊断,19,一,DNA,多态,DNA,多态（,DNA Polymorphism,）：,群体中每个个体,DNA,区域中等位基因（或片段）存在,两种,或,两种以上,的形式,，对,基因功能没有影响,，称,DNA,多态,。,它通过孟德尔方式遗传。常用做遗传分析中的标记。,19一 DNA多态DNA多态（DNA Polymorph,20,DNA,分析中常用的遗传性多态性标记有,3,类：,1,）,RFLP,：,称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记；,2,）,重复序列多态性（,VNTR,）,：如短串联重复序列（,STR,），为第二代多态性标记；,3,）,单碱基多态性（,SNP,）,：,DNA,序列的,单个,核苷酸的差别，为第三代多态性标记。,20DNA分析中常用的遗传性多态性标记有3类：1）RFLP：,21,一,),限制性片段长度多态性,Restriction Fragment Length Polymorphism,，,RFLP,由于碱基变异可能导致限制酶切点,消失,或新的酶切点,出现,，引起不同个体,DNA,在用同一限制酶切割时，产生不同长度的,DNA,片段，称,RFLP,RFLP,按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有用的遗传标记。,21一) 限制性片段长度多态性 Restriction F,22,Allele II,产生了新的酶切点,Allele I,Allele II,12Kb,8Kb,4Kb,probe,12Kb,8Kb,RFLP,Southern,blot,检测结果,22Allele II 产生了新的酶切点 Allele I,23,AlleleII,酶切位点消失,23AlleleII酶切位点消失,24,二,),数目变异串联重复，,variable number tandem repeats, VNTR,）,重复序列以各自的,核心序列,（重复单元），首尾相连,多次重复,，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态即,VNTR,。,散在分布于染色体上。,重复单位,625bp,长，,称为小卫星,DNA,。,重复单位,26bp,长，如（,TA,）,n, (CGG)n,等，,称为微卫星,DNA,。,24二)数目变异串联重复，variable number t,25,VNTR,两侧酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。,DNA,多态可以通过,PCR,扩增后电泳来检出，称,扩增,片段长度多态,（,amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP,）,25VNTR两侧酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数,26,VNTR,酶切，电泳后的检测结果,大,小,26VNTR 酶切，电泳后的检测结果大小,27,PCR-VNTR,检测,27PCR-VNTR检测,28,PCR-VNTR,28PCR-VNTR,29,29,30,三,),单核苷酸多态性（,SNP,）,（,Single Nucleiotide Polymorphism,）,SNP,：发生在基因组中的单个核苷酸的替代,根据,SNP,在基因中的位置，分为：,基因编码区,SNP,基因周边,SNP,基因间,SNP,在人类基因组中每,100300,个核苷酸就有一个,SNP,30三)单核苷酸多态性（SNP）SNP：发生在基因组中的单个,31,二、基诊断方法及实例,直接检测致病基因本身的异常。通常使用基因,本身或邻近,DNA,序列,作为探针，进行,Southern,杂交,，或通过,PCR,扩增产物,，以检测基因点突变、缺失、插入等异常及性质。主要适用于已知基因异常疾病的诊断。,直接,基因诊断及实例,31二、基诊断方法及实例 直接检测致病基因,32,直接基因诊断,突变型,遗传病的,直接,基因诊断,e.g.,镰形细胞贫血的,Gene,诊断,32直接基因诊断 突变型遗传病的直接基因,33,1,）,Southern blot,珠蛋白链基因第,6,位密码子发生突变,G,A,GG,T,G,谷,Aa,缬,Aa,e.g.,镰形细胞贫血的,Gene,诊断,331）Southern blote.g. 镰形细胞贫血的G,34,已知限制酶,Mst 1,识别序列 （,CCTNAGG,）,CCTG,A,GG,CCTG,T,GG,突变后不能识别，,酶切位点消失，限制酶切片段长度发生变化。,34已知限制酶Mst 1识别序列 （CCTNAGG）,35,2) ASO,探针诊断,已知突变,Gene,部位和性质，合成寡核苷酸探针，,32,P,标记，进行斑点杂交。,Normal ,Gene Probe,与正常,Probe ,杂交稳定,Mutation ,S,Gene Probe,与异常,S,杂交 稳定,352) ASO探针诊断 已知突变Gene部位和性质,36,等位基因特异性寡核苷酸探针（,ASO,）,（,Allele-specific-oligonucleotide,）,36等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO）,37,斑点杂交结果：,/,/,S,S,/,S,正常探针,突变探针,突变,型,遗传病的,直接,基因诊断,37斑点杂交结果： / /S,38,突变,型,遗传病的,直接,基因诊断,38突变型遗传病的直接基因诊断,39,BamHI,BamHI,2,1,2,10 kb,14 kb,probe,1,） ,地中海贫血的基因诊断,基因不同程度的缺失可引起不同类型的,地中海贫血。,直接基因诊断,缺失,型,遗传病的,直接,基因诊断,39BamHIBamHI212 10 kb14 kbp,40,Southern blot,检测结果：,/ /- /- - - /- - - - / - -,正常 缺,1,缺,2,缺,3,缺,4,14kb,10kb,缺失,型,遗传病的,直接,基因诊断,40Southern blot 检测结果： /,41,2,）,地贫的,Gene,诊断,珠蛋白基因两侧有,pst1,酶切位点，,pst1,酶切正常可得到,4.4kb,片段,珠蛋白基因缺失,0.7kb,片段，,pst1,酶切则得到,3.7 kb,片段为,0,缺失,型,遗传病的,直接,基因诊断,41缺失型遗传病的直接基因诊断,42,以,Gene,为探针，,Southern blot,方法检测,/,A,/,0,0,/,0,4.4kb,3.7kb,缺失,型,遗传病的,直接,基因诊断,42以Gene为探针，Southern blot 方法检测,43,3,）,DMD,的基因诊断,DMD,属,XR,DMD,基因是最大的基因，有,79,个外显子,DMD,基因突变主要以,缺失,为主，可涉及基因的不同部位,E1 E2 E3,缺失,型,遗传病的,直接,基因诊断,433） DMD的基因诊断DMD属XRE1,44,病例,外显子,1 2 3 4 5 6 7 8,Pm,3,43,50,13,6,47,60,52,bp,535,113,缺失,型,遗传病的,直接,基因诊断,44病例外显子 1 2 3,45,二）间接基因诊断方法及实例,当,致病基因,虽然已知，但其,异常性质未知,时，或疾病,Gene,本身尚未知,时，主要通过,Gene,和,DNA,多态的连锁分析,间接地,作出诊断。,45二）间接基因诊断方法及实例 当致病基,46,连锁分析基于,遗传标记,与,Gene,在染色体上连锁， 通过对受检者及其家系进行连锁分析，分析子代获得某种,遗传标记,与,疾病,的关系，间接推断受检,子代是否获得带有致病基因的染色体,，间接地判断并做出诊断。,遗传标记是基因组中的,DNA,多态,如：,RFLP,，,VNTR,等。,间接基因诊断,46 连锁分析基于遗传标记与Gene在染色体上连,47,遗传标记,相关基因,表型分析,间接基因诊断,47遗传标记相关基因表型分析间接基因诊断,48,1,Southern blot,-RFLP,诊断,(PKU),PAH,基因两侧有,Msp1,酶切位点,用该酶消化可产生,23kb,、,19kb,两种等位片段，以,PAHcDNA,为探针与,PKU,家系成员外周血,DNA,杂交。,间接基因诊断,481 Southern blot-RFLP诊断(PKU),49,患者为,19kb,片段的纯合子,说明患者缺陷的,PAH,基因与,19kb,片段连锁,其父、母亲缺陷的,PAH,基因与,19kb,片段连锁，其,23kb,片段与正常,PAH,基因连锁。,II2,为,23kb,和,19kb,片段的杂合子，为表型正常的致病基因携带者。,间接基因诊断,49患者为19kb片段的纯合子,说明患者缺陷的PAH基因与1,50,2,成年型多囊肾病的诊断,例：成年型多囊肾病,APKD,，,AD,，临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。,APKD,Gene,定位,16p13,，但,致病基因,尚未克隆,，,基因产物,的生化性质和疾病发病机理也,尚未阐明,，但已证实,APKD Gene,与,珠蛋白基因,3,端附近的一段,小卫星,DNA,序列,（,3HVR,）,紧密连锁,，因此，可以通过连锁分析进行诊断。,间接基因诊断,502 成年型多囊肾病的诊断例：成年型多囊肾病APKD，,51,以,3HVR,为探针，与,PvuII,酶切后的家系有关成员的基因组,DNA,进行,Southern Blot,基因组,DNA,PvuII,酶切,DNA,片段,变性,转膜,探针,变性,杂交,结果分析,间接基因诊断,51 以3HVR为探针，与PvuII酶切后的家系有关,52,1 2,1 2 3 4 5,5.7kb,3.4kb,2.3kb,间接基因诊断,52 1 2间接,53,结果分析,患者（,I1,、,II1,和,II2,）有,3.4kb,片段，说明致病基因与,3.4kb,片段连锁，并按孟德尔方式遗传。,II5,不含,3.4kb,片段，产前诊断正常。,间接基因诊断,53结果分析间接基因诊断,54,3,甲型血友病,诊断（,PCRRFLP,）,甲型血友病,的基因诊断：已知甲型血友病,XR,，获得家系成员基因组,DNA,。,PCR 142 bp,BcLI,142bp 99 bp 43bp,电泳,结果分析,p1,p2,142bp,99bp,43bp,Bcl I,Bcl I -,Bcl I +,间接基因诊断,543 甲型血友病诊断（PCRRFLP）p1p2142bp,55,间接基因诊断,55间接基因诊断,56,142bp,99bp,1 2,1,2,3,III,1,间接基因诊断,56142bp99bp1 2123II,57,结果分析,1,）先症者,II 1,具有,99bp,片段而发病，该片段来自母亲。,2,）,II2,有,142bp/99bp,，为杂合子。,142bp,来自父亲，为正常片段，,99bp,片段是来自母亲而成为携带者。,3,）,1,为,99bp,片段,如果是 男性 为患者（,99bp,片段来自母亲）；女性为携带者（来自父母双方）,间接基因诊断,57结果分析1）先症者II 1具有99bp片段而发病，该片段,58,单体型分析,有时用一种酶和一个探针不能提供可供分析的信息，需采用一种以上的酶结合几个基因探针杂交分析,。,根据同一条染色体上限制性位点的丢失或获得而出现的,一组,多态位点所构成的,不同片段长度的组合类型,进行分析，该分析方法称,单体型分析,（,Haplotyping),间接基因诊断,58单体型分析有时用一种酶和一个探针不能提供可供分析的信息，,59,举例：,PKU,家系,Hind ,酶切：,患儿,4.2/4.0kb,杂合体,父母,4.2/4.0kb,杂合体,均为杂合体，无法分析。,再用,sph,酶切：,患儿,纯合,7.0kb,父亲,纯合,7.0kb,母亲,9.7kb,和,7.0kb,杂合体,间接基因诊断,59 举例：PKU家系间接基因诊断,60,结 果,1 2,1 2 3,4.2kb,4.0kb,11kb,9.7kb,7.0kb,I,II,Hind ,Sph ,间接基因诊断,60结 果 1,61,分析,：,患儿,1,从母亲和父亲各获得一个,7.0kb,突变型,从,Hind ,酶切结果看出：,正常同胞,3,为纯合,4.0kb,，也是,sph 7.0kb,纯合体，故母亲,H 4.0kb S 7.0kb,构成单体型，母亲,7.0kb,为突变型，因此，,母亲,H 4.0kb S 7.0kb,为突变单体型。,间接基因诊断,61分析：间接基因诊断,62,患儿,1,为,Hind 4.2/4.0kb,杂合体，,故,父亲,H 4.2kb S 7.0kb,为突变单体型,母亲,H 4.2kb S 9.7kb,和父亲,H 4.0kb S 7.0kb,为,正常,单体型。,2,两个单体型分别为,H 4.2kb S 9.7kb,（母）和,H 4.0kb S 7.0kb,（父）,正常个体,3,两个单体型分别为,H,4.0kb S 7.0kb,（,母）和,H 4.0kb S 7.0kb,（父）,携带者,间接基因诊断,62患儿1为Hind 4.2/4.0kb杂合体，间接基,63,基因诊断意义,现症病人的诊断：争取有效、针对性治疗。,产前诊断：意义更为重要，预防遗传病患儿的出生,END,63基因诊断意义现症病人的诊断：争取有效、针对性治疗。EN,