血清学诊断在结核病中的临床应用价值课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Clinical Applications of Serological Diagnostics in Tuberculosis,血清学检测在结核病中的诊断价值,Clinical Applications of Serol,结核病的历史,纪元前一万年,纪元前,500,年,汉唐隋时代,1650,年,命名结核,1865,年,证实结核病具有传染性,1882,年,发现,结核菌,1921,年,卡介苗,1944,年,1908,年,结核菌素皮试,链霉素,1952,年,异烟肼,1966,年,利福平,1971,年,短程化疗,1995,年,DOTS,策略,STOP TB,策略,2005,年,结核病的历史 纪元前一万年 纪元前500年 汉唐隋时代 16,结核病的今天,全球范围内结核病疫情急剧恶化,结核病与艾滋病同时流行,结核菌耐药现象益发严重,人口大规模流动,我国是世界上仅低于印度的第二结核病大国,结核菌感染率,44.5%,新发活动性结核患者,130,万,/,年,死亡,13,万,/,年,早期快速诊断与治疗成为制约结核病控制的关键,常规实验室诊断结核病方法阳性率不到,60%,结核病的今天全球范围内结核病疫情急剧恶化,结核病的数字,全世界约,1/3,的人口（近,20,亿）携带结核菌。,自,1882,年以来已经有,2,亿人,死于结核病。,每年有,2000,万人,患活动性结核病。,每年约有,300,万人,死于结核病。,结核病每,15,秒钟,就杀死,1,人。,预计未来,20,年还将有,3600,万人,死于结核病。,结核病的数字全世界约1/3的人口（近20亿）携带结核菌。,结核分枝杆菌,结核分枝杆菌,(M.tuberculosis),生物学主要特点：,1. 细胞壁中含有大量脂质,2.引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽肿,3.抗酸染色阳性,结核分枝杆菌结核分枝杆菌(M.tuberculosis)生物,实验室检查方法的历史,1880,sTubercle bacilli,的发现,Ziehl-Neelsen,染色方法,1900sMantoux test (TST with tuberculin),1920s,Petragnani,medium,Purified Protein Derivative,（,PPD,）,1930sLewenstein-Jensen,培养基,1940sDubos agar, Ogawa,培养基,1950sMiddlebrook 7H9,1990s,核酸扩增方法,2000sELISPOT, QuantiFERON,20XX?,实验室检查方法的历史1880sTubercle bacil,当前结核研究的热点,新型抗结核药物,(50%),新型快速诊断技术,(40%),新型结核疫苗,(10%),当前结核研究的热点新型抗结核药物(50%),结核病的实验室诊断,细菌学,涂片：,敏感性低,传统固体培养：所需时间长，,23,月,分子生物学,TB-DNA,TB-RNA,HAIN,技术,Xpert MTB/RIF,DNA,微阵芯片,血清,/,免疫学,IGRA,：有望替代,TST,，但不能区分活动性,TB,与潜伏感染,血清学：存在抗原纯度和特异性差等方面的问题,液体培养及药敏试验：平均时间,20,天,结核病的实验室诊断 细菌学涂片：传统固体培养：所需时间,血清学诊断技术,血清学诊断技术优势：是一种对疾病进行早期诊断的理想方法。,无需活细胞培养和特殊仪器设备,操作简便,结果显示快速,目前用于血清学诊断的主要方法,:,酶联免疫吸附试验,(ELlSA),斑点金免疫渗滤法,(DIGFA),免疫印迹法,(Western Blotting),等等,血清学诊断技术血清学诊断技术优势：是一种对疾病进行早期诊断的,脂阿拉伯甘露聚糖,(LAM),抗原,脂阿拉伯甘露聚糖是分枝杆菌细胞壁的重要组成部分，是属特异性抗原，具有较强的免疫原性和免疫调节功能，可刺激机体产生相应的抗体，因而是结核病的血清学诊断应用较广的抗原。,有关,LAM,抗原的应用报道很多, Antunes,等用美国生产的结明,(MycoDot TM),试剂盒检测活动性肺结核病人的敏感性为,63.0%,，特异性为,92.4%,，认为检测,LAM,抗体是结核病一项有效的辅助诊断方法。,脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)抗原 脂阿拉伯甘露聚糖是分枝杆菌细,A60(antigen 60),A60,是从牛分枝杆菌胞浆中提取的一种大分子物质，是脂质蛋白和多糖的复合抗原。,Wu,等用,ELISA,法检测了,178,例活动性肺结核患者和,151,例其他疾病患者血清中的,IgG A60,，根据受试者工作特性曲线,(ROC),取,261.2,单位为截切值,(cutoff point),，其敏感性和特异性分别为,49.4%,和,79.5%,，认为胸部,X,片异常的患者结合,IgG A60,阳性将有助于肺结核病的准确临床诊断。,A60(antigen 60) A60是从牛分枝杆菌胞浆中提,结核菌糖脂,(TBGL),抗原,结核菌糖脂抗原是分枝杆菌细胞壁上的糖脂类物质，具有菌属特异性。近年来的研究表明，糖脂类抗原在诊断方面有很大的优势。,Maekura,等建立了糖脂类抗原抗体快速检测方法，并做了临床评价，对痰涂片阴性的活动性肺结核的灵敏度为,56.8,，对痰培养阴性的活动性肺结核的灵敏度为,51.2,。将,TBGL,与核酸扩增方法,(NAA),联合用于检测，检出率比两者单独使用时进一步提高。,Tiwari,等用脂质体颗粒作为载体，利用纯化的,TBGL,抗原特异的与结核病患者血清中的,TBGL,抗体结合，形成蓝色凝集颗粒来诊断活动性结核病，其敏感性、特异性分别达,94%,和,98.3%,。该方法快速,(4min),、经济，且可以区别活动性肺结核、卡介苗,(BCG),免疫接种者与健康人群，可用于人群大规模筛选肺结核病人。,结核菌糖脂(TBGL)抗原 结核菌糖脂抗原是分枝杆菌细胞壁上,38kDa,蛋白,38kDa,蛋白是一定位在质膜上的磷酸盐转运蛋白，只在分枝杆菌复合体中表达，,BCG,合成,38kDa,蛋白的量仅为结核分枝杆菌的十分之一。,38kDa,蛋白为一分泌蛋白，可刺激,T,细胞和,B,细胞免疫反应，广泛应用于结核病的血清学试验。,英国公司生产的,OMEGA,结核抗体定量检测,Myco G,、,A,、,M,试剂盒联合应用,38kDa,和脂多糖,(LPS),抗原，而,TB Complex Plus,试剂盒选用的是,38kDa,和,16kDa,抗原。,Butt,等对,OMEGA,试剂盒进行了评价，认为具有种特异性的,TB Complex Plus,和有属特异性的,Myco M,联合应用可取得最好的效果，检测肺结核的敏感性和特异性分别为,87%,和,93%,。,38kDa,对活动性肺结核的诊断非常有效，但和大肠埃希菌同源蛋白有,30%,以上的交叉，所以对不同人群的灵敏度波动较大，尤其对涂片阴性和合并,HIV,感染的结核病患者效果较差。,38kDa蛋白 38kDa蛋白是一定位在质膜上的磷酸盐转运蛋,Ag85,抗原,85,复合体,(Ag85),是一组具有较强细胞免疫及体液免疫活性的分枝杆菌分泌性蛋白，分子量约为,30,32kDa,。分枝杆菌各菌株均可分泌,Ag85,。结核分枝杆菌,Ag85,中至少包括三种蛋白成分,Ag85A,、,Ag85B,和,Ag85C,，其中有免疫作用的主要为,Ag85A,和,Ag85B,。,Ag85,具有分枝菌酸转移酶的活性，在分枝杆菌细胞壁合成的最后阶段发挥必要的作用。它还能和人纤连蛋白,(FN),相结合，有助于结核菌入侵宿主细胞。,Ag85,可能发展成为结核病的血清学诊断抗原。活动性结核病人血清中的,Ag85,抗体平均水平比其他分枝杆菌疾病患者和健康对照者高,50,150,倍，可通过检测血循环中,Ag85,抗体，对活动性结核加以诊断。,Kashyap,等用间接,ELISA,法检测,89%,疑似结核性脑膜炎患者脑脊液中存在,Ag85,抗体，认为检测,Ag85,抗体为结核性脑膜炎的早期和确定性诊断提供了一个更灵敏的选择。,Ag85 抗原85复合体(Ag85) 是一组具有较强细胞免疫,ESAT-6,和,CFP10,ESAT-6,即,6kDa,早期分泌性抗原，是从结核分枝杆菌短期培养滤液中分离纯化出的一种低分子量分泌性蛋白，具有较强的细胞免疫活性，在抗结核感染的免疫回忆应答中起重要作用。,ESAT-6,仅存在于致病性分枝杆菌中，包括人型结核杆菌、牛型结核杆菌、非洲分枝杆菌以及苏尔加分枝杆菌、海水分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌等非典型分枝杆菌，而,BCG,及其他非致病性分枝杆菌缺失。,CFP-10,即培养滤液蛋白,10,，与,ESAT-6,位于同一基因簇上，两者分布相同，都是,RDl,区编码的。,ESAT-6,和,CFP10,能刺激机体产生特异性,IgG,，利用,ESAT-6,和,CFP10,蛋白抗原能与结核分枝杆菌感染者血中特异性,IgG,结合的特点，采用,ELISA,等方法可特异性区分是真正的结核分枝杆菌感染或是接种,BCG,后所致敏，该方法明显优于,PPD,作包被抗原的,ELISA,法。,陈全等以,CFP10-ESAT-6,融合蛋白为抗原，用,ELISA,法检测豚鼠血清中抗结核分枝杆菌抗体，,11,份,H37Rv,感染豚鼠血清全部呈阳性反应，,11,份,BCG,免疫豚鼠血清仅,1,份呈阳性反应。,ESAT-6和CFP10 ESAT-6即6kDa早期分泌性抗,U1,蛋白,Mukherjee,等收集结核分枝杆菌,H37Rv,株静脉感染,C57BL/6,小鼠早期,(10,14d),尿液分离到一种结核抗原，氨基酸测序鉴定后，克隆并表达相应的基因，纯化得到可溶的重组蛋白命名为,U1,蛋白,(Urine Protein 1),，分子量大约为,16.8kDa,。,进一步用,ELISA,法检测肺结核病人血清中,U1,抗体的敏感性为,60%,，检测合并,HIV,感染的结核病患者其敏感性为,87%,，而正常人血清不与,U1,蛋白反应。将,U1,蛋白与,Mtb81,联合用于检测合并,HIV,感染的结核病患者的敏感性为,93.6%,。,同时检测了,12,名,HIV,感染的非结核病人，其中,9,名患者血清中无可检测的,U1,抗体，另外,3,名,U1,抗体的水平处于,ELISA,法检测的临界点。因此认为，检测,U1,抗体可增加结核病血清学诊断的敏感性，尤其对合并,HIV,感染的结核病患者。,U1蛋白 Mukherjee等收集结核分枝杆菌H37Rv株静,其它抗原,Weldingh,等在大肠埃希菌中克隆表达了,4,种超抗原,TB9.7,、,TB15.3,、,TB16.3,和,TB51,，并用它们来检测痰涂片阳性和涂片阴性的结核病人，灵敏度为,36%,93%,，而特异性超过,97%,，其中,TB16.3,最为有效，,TB16.3,与,TB9.7,联合检测合并,HIV,感染的结核病患者其敏感性超过,85%,。,Bahk,等基因重组表达,Rv3369,和,Rv3874,两个基因，并用它们做抗原检测结核病患者的敏感性分别为,60%,、,74%,特异性分别为,96%,、,97%,，表明是有价值的结核病血清学诊断抗原。,其它抗原，如,MPT64,、,P90,、,TB4,等，也曾被做为快速血清学检测的侯选抗原加以研究，但大都未达到诊断灵敏度的要求。,其它抗原 Weldingh等在大肠埃希菌中克隆表达了4种超抗,摘自：阳幼荣等,结核分枝杆菌,12,种抗原在结核病血清学诊断中应用价值的研究,结核分枝杆菌,12,种抗原在结核病血清学诊断中应用价值的研究,摘自：阳幼荣等结核分枝杆菌12 种抗原在结核病血清学诊断中,血清学诊断在结核病中的临床应用价值课件,血清学诊断的关键是寻找灵敏度高、特异性强的理想抗原。但这方面的应用似乎并不理想。对于结核病的血清学诊断技术的研发，到现在已经有,100,多年的历史，但至今还没有一种血清学诊断方法可以替代结核病痰涂片镜检。,WHO,对来自不同国家的,19,种试剂盒产品进行评估，结果表明：与痰培养相比，这些试剂盒检测的灵敏度为,1%60%,，特异度为,5399%,1,。,原因：由于所用的测定方法、使用的试剂种类或抗原、抗体的不同等，导致测定结果差异较大，并且缺乏可比性。,WHO,认为现有的血清学诊断试剂的敏感度和特异度都有待进一步提高，不推荐其作为一种快速诊断的方法在临床使用。,1,WHO World Health Organization. Diagnosis evaluation series No.2: laboratory-based evalution of 19 commercially available rapid diagnostic tests for tuberculosis.2008.,血清学检测,血清学诊断的关键是寻找灵敏度高、特异性强的理想抗原。但这方面,结核抗体测定存在的问题,1.,假阳性：,3%15%,。,假阳性的发生原因：,1),共同抗原所致的交叉反应；,2),隐性结核菌感染包括初染、再染、非结核分支杆菌感染、卡介苗接种、结核杆菌,L,型感染等，结果均可致结核抗体短期或较长时期的升高；,3),实验操作,/,试剂质量。,结核抗体测定存在的问题1. 假阳性：3%15%。,2.,假阴性：,30%2%,。,假阴性,发生的,原因：,1),机体方面所致的假阴性：如某些临床确诊的活动性结核患者，而体液免疫测定结果则为阴性，其原因可能与个体的免疫功能异常有关。上述原因均可导致机体不产生或仅产生少量特异性结核抗体，以致于无法与正常人群的结核抗体水平相区分。,2),特异性免疫复合物的形成：由于活动性结核患者体内产生的特异性抗体，可与结核抗原结合，形成免疫复合物，从而导致结核抗体测定为阴性。,3),方法方面的因素所致的假阴性：如测定方法本身灵敏度不够、仪器不够灵敏和影响技术条件的各种因素均可导致假。,4),试剂质量和操作因素：试剂灵敏度偏低是造成假阴性的主要原因之一，操作人员的业务素质也是影响因素之一。,2. 假阴性：30%2%。,WHO不推荐血清学检测方法,诊断活动性结核病,2011,年,WHO,正式公告：,由于目前的商业血清学试剂在结核检测中存在较大差异，且检测结果很高比例的假阳性和假阴性，因此不建议使用血清学方法作为结核杆菌的诊断实验,1,。,1,WHO Commercial Serodiagnostic Tests for Diagnosis of Tuberculosis.,http:/whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241502054_eng.pdf,不能早期诊断！容易漏诊、误诊！,WHO不推荐血清学检测方法2011年WHO正式公告：由于目前,2012,年,4,月,16,日，,SFDA,发布了,关于进一步加强结核病血液检测试剂监管有关事宜的通知,（食药监办械,【2012】48,号），要求各省、自治区、直辖市食品药品监督管理局按照通知要求对行政区域内有关结核病血液检测试剂的注册审评情况开展检查，试图通过对国内生产结核病诊断血清学制品的企业进行一次背景调查。,分析目前国内核病血清学检测试剂在生产过程质量控制和在临床评价中存在的问题及解决问题的方法。,2012年4月16日，SFDA发布了关于进一步加强结核病血,我国目前结核病血清学检测试剂的情况,1.,我国结核病血清学检测试剂现状,市场上销售的结核病血清学诊断试剂有近百家，经国家食品药品监督管理局批准的国产诊断制品抗体检测试剂盒,29,个，其中经国家级批准的,26,个，省级批准的,1,个，进口制品,1,个。抗原检测试剂盒,3,个，其中省级批准的,1,个。,大多数未经批准的结核病血清学诊断试剂游离于国家监管范围之外，值得引起国家有关部门及人员的关注与重视。,我国目前结核病血清学检测试剂的情况1.我国结核病血清学检测试,2.,结核病血清学诊断试剂生产企业背景调查情况,调查资料的内容主要包括试剂盒背景资料、试剂盒成品检测、试剂盒检测参考品制备与标化，参考品使用情况及临床研究等方面；,通过对各生产企业报送的资料进行分析，共收回调查问卷,29,份,.,我国目前结核病血清学诊断制品的品种与近,3,年的数量见下表,.,由于无法掌握未经批准的结核病血清学诊断试剂的非法销售情况，结果并不能代表国内实际销售状况。,2. 结核病血清学诊断试剂生产企业背景调查情况,存在的问题：,1.,阳性参考品的选择,多数企业在阳性参考品选择时通常只选择菌阳患者抗体强阳性血清，如果试剂某批次质量出现问题，敏感度偏低时，若阳性参考品中全部使用强阳性血清，所有阳性参考品反应均呈阳性，则无法反映该试剂的真实敏感度。如标准品中有弱阳性血清的反应可能呈阴性，提示试剂敏感度可能存在问题。因此，血清学抗体检测试剂在质量控制中需要强、中、弱三种不同效价的血清用于敏感度的质量控制。同理，在试剂制备过程出现问题，可能产生假阳性时。如果阴性参考血清都选择本底极低的样品，可能无法检出，因此阴性参考品应含有临界阴性参考血清。,存在的问题：1.阳性参考品的选择,2.,参考品的标化,为获得阳性与阴性不同效价的血清，获得血清后应先进行初筛，再用不同的方法学对血清进行效价标定，确定血清的效价，从中选择不同反应强度的样本，作为阳性或阴性参考品。但多数企业未进行细致的效价标化，通常以试剂盒筛选后就作为检测参考品。,标准品的建立应有规范的操作细则，至少样品采集、检测与标化的过程中所有的实验操作均需先制定,SOP,，再 严 格 遵 循,SOP,进行操作，并有对应的原始记录。从已收到的资料来看，多数企业存在不足之处,。,2.参考品的标化,3.,参考品的制备,结核病体外诊断试剂参考品通常由阳性参考品、阴性参考品、最低检出量或最低检出限参考品和精密性或重复性参考品组成，用来控制试剂盒的敏感度、特异度、检出限和精密度等。但部分试剂厂家仅有阳性与阴性检测参考品。,由于参考品用于体外诊断试剂质量控制，所以参考物质原料的选择取决于诊断试剂的预期用途。原料应与试剂盒的使用要求相一致或尽可能接近，这样可以消除方法基体效应引入的系统误差，阳性参考品应包括痰菌阴性和痰菌阳性患者的血清，但个别企业仅采用采血站筛选的抗体阳性血清作为阳性参考品。,3.参考品的制备,4.,参考品的稳定性,参考物质的均一性和稳定性：,均一性可保证一批原料所制备的参考品均匀一致，即在不同空间检测结果的一致性和可比性；,稳定性可使一批参考品长期分发使用，为企业或科研院所提供用于质量评价的参考品，保证在不同时间检测结果的一致性和可比性。稳定性考察一般需要观察在不同温度下放置不同时间，或经过反复冻融后，观察效价降低的情况。通过测定不同温度，不同冻融次数时特征活性的降低速率，从而确定贮存的适宜温度和时间，或反复冻融的次数。,4.参考品的稳定性,临床检验中发现的问题,：,1.,敏感度与特异度虚高,WHO,评估结果显示，市售不同厂家的血液（血清学诊断）试剂的敏感度和特异度变化很大，敏感度变化范围为,0100%,，特异度变化范围为,31100%,。,根据收集的各企业临床资料显示，我国血液诊断试剂的敏感度平均值为,80%,左右，高于,70%,的占,79%,；特异度平均值为,92%,，高于,90%,的占,95%,。,2.,临床评价仅采用与同类制品进行比较评价的缺陷,部分企 业 根 据,体 外 诊 断 试 剂 临 床 研 究 技 术 指 导 原则,，“已有同品种批准上市,”,品的临床研究可采用已批准上市质量较好的产品作为对比试剂，进行对比试验研究。,3.,临床研究的规范性,多数未规范进行临床研究，不能随机入选客观评价，数据经处理修改痕迹明显，这是导致临床研究的特异度与敏感度不真实的主要因素。,临床检验中发现的问题：1.敏感度与特异度虚高,32,/45,近期结核病诊断方法的相关研究,JID 2012:205 (Suppl 2), S147.,近期结核病诊断方法的相关研究JID 2012:205 (Su,结核感染者体内存在特异的效应,T,淋巴细胞，效应,T,淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（,IFN-,）。因此，检测效应,T,淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。,由于效应,T,细胞,存活时间很短,，而且,具有特异性,，因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。,基于,IGRA,原理的产品目前已被,美国、加拿大、英国、德国、意大利、瑞士、法国、荷兰、日本,等二十余个国家写入本国的结核诊疗指南中,。,目前应用的进口IGRA主要有两种商品化的试剂：,1,）,澳大利亚,Cellestis公司的,Quanti FERON-TB GOLD In Tube（QFT-GIT）,2,）,英国,Oxford Immunotec公司的T-SPOT.TB,蛋白水平分子诊断,:,-干扰素释放实验（,IGRA),结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受,-干扰素释放实验（IGRA）,干扰素,检测阴性,干扰素,检测阳性,TB,抗原多肽,T,细胞,活化,T,细胞,干扰素,-干扰素释放实验（IGRA） 干扰素干扰素TB抗原多肽,T-SPOT,.,TB,原理,T-SPOT,.,TB,是以拥有专利的特异抗原（,ESAT-6/CFP-10,），通过酶联免疫斑点技术（,ELISPOT,）检测受试者体内是否存在结核效应,T,淋巴细胞，从而判断目前该受试者是否感染结核杆菌（现症感染）的新方法。,结核杆菌特异抗原：,早期分泌抗原靶,6,（,Early Secreted Antigenic Rarget 6,，,ESAT-6,）,培养滤液蛋白,10,（,Culture Filtrate Protein 10,，,CFP 10,）,T-SPOT.TB原理T-SPOT.TB是以拥有专利的特,结核杆菌特异抗原,由结核杆菌基因组,RD1,区相同的操纵子编码的蛋白,所有的卡介苗（,BCG,）均丢失该基因序列,绝大多数的环境分枝杆菌也不存在,RD1,区,ESAT-6,与,CFP,-,10,抗原,结核杆菌特异抗原由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋,结核杆菌特异抗原,苏氏,海,堪萨斯,戈登,牛,非洲,结核杆菌特异抗原苏氏海堪萨斯戈登牛非洲,酶联免疫斑点技术,结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即,ELISA,技术），能够在,单细胞水平,检测细胞因子的分泌情况，,灵敏度高,。,酶联免疫斑点技术结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即EL,准确,T-SPOT,.,TB,临床性能指标,特异性,只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（,BCG,）无交叉反应,美国,FDA,数据：特异性,97.1%(297/306),国内临床数据：特异性,94.1%(478/508),灵敏度,基本不受免疫力低下,/,受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率,美国,FDA,数据：灵敏度,95.6%(175/183),国内临床数据：灵敏度,95.3%(624/655),准确T-SPOT.TB临床性能指标 特异性,灵 敏 度,Reference,Sensitivity,Jafari et al 2006 AJRCCM 174;9:1048-53,100.0% (12/12),Ferrara et al Lancet 2006 376;1328-34*,83.3% (20/24),Lee et al Eur Respir J 2006 28;24-30*,96.6% (84/87),Goletti et al Clin Microbiol Infect 2006 12;6:544-50*,91.3% (21/23),Meier et al EJCMID 2005 24;529-536,95.9% (70/73),Kang et al Chest. 2007 Sep;132(3):959-65*,92.2% (59/64),Janssens et al ERJ 2007 30(4):722-8,98.3% (57/58),Clarke et al Clin Exp Immunol 2007 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Epub ahead of print*,95.9% (47/49),TOTAL,92.0% (1139/1238),灵 敏 度ReferenceSensitivity Jaf,特 异 性,特 异 性,可信,T-SPOT,.,TB,国外指南,T-SPOT,.,TB,是采用,-,干扰素释放试验（,IGRA,）原理，获得美国,FDA,认证、欧盟,CE,认证和中国,SFDA,认证的唯一商业化产品,列入美国、英国等欧美,25,个国家结核诊疗指南,2011,年英国,NICE,指南、,2010,年美国最新结核诊疗指南、,2010,年加拿大结核指南,美国,CDC,推荐,卡介苗（,BCG,）接种人群结核感染检测首选,可信 T-SPOT.TB国外指南T-SPOT.TB是采,各国对潜伏感染风险人群的筛查指南,风险人群,美国指南,加拿大指南,英国指南,免疫力抑制人群（例如，,HIV,感染者，使用强的松或,TNF-,抑制剂治疗）,TST,或,IGRA,；如果是阴性或高度怀疑的，,TST,和,IGRA,都要检查,TST,，如果,TST,阴性要用,IGRA,确认,TST,或,IGRA,BCG,接种者（如果也属于其它风险人群）,推荐用,IGRA,没有特定的推荐,TST,或,IGRA,与传染性肺结核患者密切接触,TST,或,IGRA,TST,，用,IGRA,进一步确认,TST,阳性,TST,，用,IGRA,进一步确认,TST,阳性,医务工作者,TST,或,IGRA,推荐用,TST,TST,或,IGRA,，视情况而定,无法再来确认,TST,结果的人群（例如，流浪汉，注射吸毒者或交通不方便）,推荐用,IGRA,没有特定的推荐,推荐用,IGRA,国外出生的人群,只筛查过去,5,年内移民的人群；,TST,或者,IGRA,只筛查过去,2,年内小于,15,岁的移民；,TST,，用,IGRA,进一步确认,TST,阳性,只筛查新移民；,TST,筛查,5,至,15,岁移民，用,IGRA,进一步确认,TST,阳性；,IGRA,筛查,16,至,35,岁移民,其它风险人群,TST,或,IGRA,TST,，用,IGRA,进一步确认,TST,阳性,TST,，用,IGRA,进一步确认,TST,阳性,各国对潜伏感染风险人群的筛查指南风险人群美国指南加拿大指南英,快速,T-SPOT,.TB,的实验步骤,用,BD CPT,管或,Ficoll,提取液收集外周血单个核细胞,结核特异抗原（,ESAT-6/CFP 10,）刺激结核特异的效应,T,淋巴细胞使其分泌,-,干扰素,效应,T,淋巴细胞分泌的,-,干扰素与膜板预包被的抗,-,干扰素抗体结合并固定在细胞周围,1,个斑点,=1,个效应,T,细胞,加入显色液，观察结果,过夜孵育，洗板，加入酶标二抗,快速T-SPOT.TB的实验步骤用BD CPT 管或Fi,快速,实验效果图,阴性结果,阳性结果,空白对照,抗原,A,ESAT-6,抗原,B,CFP10,阳性对照,（,PHA,）,快速实验效果图阴性结果阳性结果空白对照,方法学的,优点,检测特异性的提高,帮助临床区分卡介苗接种和环境分枝杆菌感染引起的“假阳性”，避免了临床的无效用药,检测灵敏度的提高,有利于临床对结核病的早发现、早治疗，避免了疾病的传播与扩散,快速,48,小时出结果,方法学的优点检测特异性的提高,方法学的,局限,不能区分活动性,TB,与潜伏感染,不能够提示临床患者的病变部位，需要结合临床的判断,目前还不能够根据斑点数量的多少来判断患者是活动性结核病或是潜伏感染者,检测收费高,（800,元,/,次）,方法学的局限不能区分活动性TB与潜伏感染,实验结果解释,阴性结果,提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应,T,细胞。假阴性结果：,感染阶段不同；少数免疫系统功能不全,/,疾病；实验非正常操作。,阳性结果,提示患者体内存在针对结核杆菌特异的效应,T,细胞，患者存在结核感染。但是否是活动性结核病，需结合临床症状和其它检测指标综合判断。假阳性结果：,4,种环境分枝杆菌感染时：,M.kansasii,（堪萨斯）、,M.szulgai,（苏氏）、,M.marinum,（海）、,M.gordonae,（戈登）,实验结果解释 阴性结果,假阴性/假阳性结果的原因分析,假阴性结果分析：,方法学局限性,受试者因素：免疫力,实验：人员、设备问题,假阳性结果分析：,判断标准,环境分枝杆菌感染,实验污染,假阴性/假阳性结果的原因分析假阴性结果分析：,武汉,海吉力公司开发的结核杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒是准确、快速诊断结核感染的新结核诊断方法和技术,HGN-IGRA.TB,二项专利授权,1、一种诊断结核病的检测试剂盒,授权公告号 CN 102175875 B,2、全血INF-的特异性抗原蛋白、其制备方法及用途,授权公告号 CN 102174114 B,武汉海吉力公司开发的结核杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒是,第一天：体外全血刺激,第二天：,ELISA,定量检测,IFN-,含量,HGN-IGRA.TB操作流程概况,第一天：体外全血刺激第二天：ELISA定量检测IFN-含量,1.,现有的血清学诊断试剂的厂家良莠不齐，试剂的敏感度和特异度都有待进一步提高，不推荐其作为一种快速诊断的方法在临床使用；,2.,结核感染,T,细胞检测（,IGRA/TSPOT,）是目前,MTB,感染最好的筛查手段。,3.,临床医生谨慎对待结核抗体阳性患者,!,小 结,1.现有的血清学诊断试剂的厂家良莠不齐，试剂的敏感度和特异度,感 谢,聆 听！,感 谢 聆 听！,后面内容直接删除就行,资料可以编辑修改使用,资料可以编辑修改使用,资料仅供参考，实际情况实际分析,后面内容直接删除就行,主要经营：,课件设计，文档制作，,网络软件设计、图文设计制作、发布广告等,秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！,致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、,PPT,设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求,主要经营：课件设计，文档制作，网络软件设计、图文设计制作、发,感谢您的观看和下载,The user can demonstrate on a projector or computer, or print the presentation and make it into a film to be used in a wider field,感谢您的观看和下载The user can demonstr,