克隆与组装技术课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,DNA,克隆与组装技术,1,DNA克隆与组装技术1,提纲,非典型酶切连接技术,二,PCR,技术,三,同源重组技术,四,单链退火技术,五,典型酶切连接技术,一,2024/8/22,2,提纲非典型酶切连接技术二PCR技术三同源重组技术四单链退火技,典型酶切连接技术,一,连接处存在疤痕,多片段连接效率低,依赖于序列,缺点,方法成熟,简单方便,优点,2024/8/22,3,典型酶切连接技术一连接处存在疤痕缺点方法成熟优点2023/8,非典型酶切连接技术,二,BioBrick,TM,技术,Golden Gate cloning,技术,2024/8/22,4,非典型酶切连接技术二BioBrickTM技术2023/8/3,BioBrick,TM,技术,Xba1,Spe1,连接处存在疤痕,缺点,2024/8/22,5,BioBrickTM技术Xba1Spe1连接处存在疤痕缺点2,Golden Gate cloning,技术,对序列有一定依赖性,缺点,2024/8/22,6,Golden Gate cloning 技术对序列有一定依赖,自从,20,世纪,90,年代,PCR (Polymerase chain reaction),技术被用于基因合成以来，一系列依赖于,PCR,的,DNA,克隆和组装技术也逐渐发展起来了。例如重叠延伸,PCR (Overlap extension PCR,，,OE-PCR),和环形聚合酶延伸克隆,(Circular polymerase extension cloning,，,CPEC),技术，这些技术都可以解决上述典型和非典型酶切连接对于序列依赖的问题，达到无痕、非序列依赖性的效果。,PCR,技术,三,2024/8/22,7,自从 20 世纪 90 年代 PCR (Polymerase,OE-PCR,技术,依赖于聚合酶保真度,组装长度有限,缺点,无痕连接,不依赖序列,优点,2024/8/22,8,OE-PCR技术依赖于聚合酶保真度缺点无痕连接优点2023/,CPEC,技术,2024/8/22,9,CPEC技术2023/8/309,同源重组是指含有重叠序列的,DNA,分子之间或分子内部的重新组合，其已经广泛应用于分子生物学研究中。当操作较大的,DNA,分子时，,DNA,体外组装就会变得较为困难，这时就需要体内大片段,DNA,组装方法， 例如目前最常用的酿酒酵母体内的转化耦联重组技术,(Transformation-associated recombination,，,TAR),和大肠杆菌体内的,Red/Rec,同源重组技术。,同源重组技术,四,2024/8/22,10,同源重组是指含有重叠序列的 DNA 分子之间或分子内部的重新,TAR,技术,(transformation assisted recombination),2024/8/22,11,TAR技术(transformation assisted,Red/Rec,技术是一种基于,噬菌体,Red,操纵子和,Rec,噬菌体,RecE/RecT,同源重组系统的,DNA,克隆技术。,Red,同源重组系统主要由,Exo,、,Beta,、,Gam,蛋白组成，分别由,噬菌体,exo,、,bet,、,gam,基因编码。其中，,Exo,具有,53,双链核酸外切酶活性，能够形成末端,DNA,单链；,Beta,是单链结合蛋白，能够促进,DNA,分子间退火；,Gam,能够阻止单链,DNA,片段的降解，提高单链,DNA,分子的稳定性，从而间接提高同源重组的效率。,Rec,同源重组系统中除上述,Gam,蛋白外，,Rec,噬菌体编码的,RecE,和,RecT,蛋白也能高效促进同源重组。,Red/Rec,技术,2024/8/22,12,Red/Rec 技术是一种基于 噬菌体 Red 操纵子和,2024/8/22,13,2023/8/3013,单链退火拼接技术，即所谓的,Chew-back,组装，是指创造,DNA,分子之间的重叠区，通过连接或聚合的思想实现分子间的拼接。这种技术既跳出了限制酶的使用，利用,DNA,外切酶产生了较长的黏性末端；又应用等级化组装模式很好地规避了逐级添加的耗时耗力与一次性组装可能不正确的拼接，使得无论在组装的,DNA,片段数目还是尺度上变得更为高效。例如目前最常用的,Gibson assembly,和,SLIC,技术。,单链退火技术,五,2024/8/22,14,单链退火拼接技术，即所谓的 Chew-back 组装，是指创,J. Craig Venter,研究所的,Daniel G. Gibson,描述了一种强大的基于外切核酸酶的方法，可以无缝地以正确的顺序组装,DNA,，即,Gibson Assembly,。 该反应使用三种酶活性在等温条件下进行：,5,外切核酸酶产生长突出端，聚合酶填充退火的单链区域的间隙，,DNA,连接酶密封退火和填充间隙的缺口。 该方法已被广泛采用，并且是全世界合成生物学项目的主要工具。,Gibson Assembly,技术,组装片段自身不能含有重复片段,缺点,多条长片段一次组装,高效易操作,优点,2024/8/22,15,J. Craig Venter研究所的Daniel G. G,2024/8/22,16,2023/8/3016,SLIC,是一种不依赖于序列和连接反应的克隆方法， 主要利用,T4 DNA,聚合酶在无,dNTPs,存在的情况下发挥,35,核酸外切酶活性， 将,DNA,片段消化产生含有末端重叠序列的,5,黏性末端，然后,DNA,片段之间或,DNA,片段与载体之间依靠重叠序列退火,(Rec A,可提高重组效率,),，形成环状中间体，最后直接转化大肠杆菌感受态细胞，利用大肠杆菌本身的修复系统修复成完整的环状重组质粒,(,图,8),。,SLIC,技术,2024/8/22,17,SLIC 是一种不依赖于序列和连接反应的克隆方法， 主要利用,比较两种方法,2024/8/22,18,比较两种方法2023/8/3018,技术,优点,缺点,传统内切酶连接,方法成熟，简单方便,连接处存在疤痕，多片段连接效率低，依赖于序列,Biobrick,模块化便捷,存在疤痕，较依赖于序列,Golden Gate cloning,高效，无痕，多片段一次连接,较依赖于序列,OE-PCR,高效，无痕,依赖于保真率，组装片段大小受限,OPEC,同上,同上,TAR,最高效，组装片段最长的技术,片段过大，或存在重复片段时，易断裂缺失，,GC,含量不能过高,Red/Rec,高效，可组装中等尺度大片段,同上,Gibson Assembly,高效，无痕，大片段一次组装,存在重复片段时难以组装,SLIC,高效，无痕,片段大小不能太大,总结,2024/8/22,19,技术优点缺点传统内切酶连接方法成熟，简单方便连接处存在疤痕，,主要参考文献,史晏榕等，,DNA,克隆和组装技术研究进展 ，,微生物学通报,，,2015, Vol.42, No.11 , 2229-2237;,赵鹃等，合成生物学中的,DNA,组装技术，,生命科学,2013, Vol.25, No.11, 983-992;,李雷等，,DNA,组装新方法的研究进展，,生物工程学报,2013. Vol.29, No.8, 1113-1122;,Daniel G. Gibson,et al,One-step assembly in yeast of 25 overlapping DNA fragments to form a complete synthetic Mycoplasma genitalium genome,PNAS (2008) vol. 105 no. 51 2040420409,;,Carola Engler,et al, Golden Gate Shuffling: A One-Pot DNA Shuffling Method Based on Type IIs Restriction Enzymes, Plos one (May 2009) Volume 4 Issue 5,;,Jiayuan Quan,et al, Circular Polymerase Extension Cloning of Complex Gene Libraries and Pathways,Plos one July 2009 Volume 4 Issue 7,;,2024/8/22,20,主要参考文献史晏榕等， DNA 克隆和组装技术研究进展 ，,欢迎提出宝贵意见,2024/8/22,21,欢迎提出宝贵意见2023/8/3021,