免疫酶组织化学技术课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第三章,免疫酶组织化学技术,第三章,1,免疫酶组织化学技术,酶,辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶.,酶标记已知Ab(或Ag)+组织细胞内相应的Ag(或Ab),抗原抗体复合物(酶标),底物,有色沉淀,定位;,图像分析仪半定量,免疫酶组织化学技术,2,免疫组化方法,酶标抗体免疫组织化学,直接法,间接法,非酶标抗体免疫组织化学,酶桥法,PAP法、 APAAP法,免疫组化方法,3,酶标抗体免疫组织化学染色法,(一)原理直接法和间接法,直接法,是将酶标记在第一抗体上,直接检测细胞内特异性抗原。,间接法一两步法,抗:是细胞组织内抗原的特异性抗体;,二抗:是抗一抗的抗体,并且已用酶标记,(注意:第二抗体与第一抗体须是不同种属动物制备的,因,为第二抗体往往是用第一种动物的IgG所制备。),酶标抗体免疫组织化学染色法,4,酶标抗体法-直接法,原理:将酶直接标记在一抗上,过氧化粉,然后直接与相应抗原特异地结合。,形成抗原一抗体_酶复合物,最后,用底物显色剂显色,第一体,优点:简便、快速、特异性强,非特异性背景反应低,缺点:浪费抗体、敏感性极低,围1兔组化直法,依靠化学连接(共价键)对酶及,抗体活性有影响。,每种抗原必须分别用其抗体的酶,标记物。,酶标抗体法-直接法,5,酶标抗体法-间接法,二抗,原理:将酶标记在二抗上,先将,一抗与相应的抗原结合,形成抗,过化原抗体复合物,再用二抗(酶标抗,体)与复合物中的特异抗体结合,第一抗,形成抗原-抗体-酶标抗体复合物,最后用底物显色剂显色,优点:只需一种酶标抗体即可。,一mE块:教感性低,但优于直接法,围22免疫组化国接法,依靠化学连接对酶及抗体活性有,影响。,酶标抗体法-间接法,6,令免疫酶组织化学方法最终的生成物是带有酶标记,的抗原抗体复合物,再依据酶与底物作用生成不溶,性的有色产物沉积在抗原抗体反应原位,并借此确,定该抗原的性质、存在的部位和含量。,令显色反应:,令酶+底物=不溶性的色素,标记酶:辣根过氧化物酶(HRP),碱性磷酸酶(ALP),葡萄糖氧化酶(GOD),-D-半乳糖苷酶.,令免疫酶组织化学方法最终的生成物是带有酶标记,7,1辣根过氧化物酶HRP,显色:产物棕褐色,HRP与底物过氧化氢和DAB作用产物棕褐色,有嗜锇性,DAB性质:,电子供体,较敏感,室温时较稳定,显色后切片可长期,保存。可致癌,可将DAB制成10倍浓度储存液,分装后-20,贮存,注意事项:孵育时间和配置方式易产生背景着色,浓缩的DAB按照说明书;注意校正蒸馏水的PH值;,粉剂DAB溶解时滤去不溶性颗粒;,现用现配保存时可产生氧化物沉积在切片上,形成斑点。,临用前加H2O2,1辣根过氧化物酶HRP,8,1辣根过氧化物酶HRP:,3344 49,1辣根过氧化物酶HRP:,9,2碱性磷酸酶ALP,显色:产物蓝色或红色,令以磷酸萘酚ASMX为底物,被ALP水解后生成萘酚,AS-MX,再与孵育液内的坚牢蓝B盐或坚牢红TR盐等,偶联生成不溶性染料(坚牢蓝或坚牢红)而成,令优点:细胞和组织内的内源性碱性磷酸酶很容易被,抑制和破坏,而不会产生内源性酶显色,从而提高,特异性。,令缺点:显色弥散,不如过氧化物酶系统的清晰和明,确,2碱性磷酸酶ALP,10,免疫酶组织化学技术课件,11,免疫酶组织化学技术课件,12,免疫酶组织化学技术课件,13,免疫酶组织化学技术课件,14,免疫酶组织化学技术课件,15,免疫酶组织化学技术课件,16,免疫酶组织化学技术课件,17,免疫酶组织化学技术课件,18,免疫酶组织化学技术课件,19,免疫酶组织化学技术课件,20,免疫酶组织化学技术课件,21,免疫酶组织化学技术课件,22,免疫酶组织化学技术课件,23,免疫酶组织化学技术课件,24,免疫酶组织化学技术课件,25,