NR2B在小鼠骨癌痛中的作用及机制研究课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,目前，全球癌症患者的数量呈, 骨,癌痛的具体机制,癌性疼痛成为影响癌症病人生活,质量的一个严重问题。,在癌痛中又以骨癌痛最为严重和最难以控制。,?,研究背景, 目前，全球癌症患者的数量呈 骨癌痛的具体机制,1,癌痛的特点,:,临床上，癌痛表现为进行性加重，常伴随有爆发痛；,癌痛与炎性痛和神经病理性痛存在着不同的外周和中枢机制,1,。,如癌痛：胶质细胞增生肥大；,GFAP,1 :,Honore P. Neuroscience, 2000, 98: 585598.,癌痛的特点: 临床上，癌痛表现为进行性加重，常伴随有爆发痛；,2,NMDA受体活化是反复伤害性刺激诱发中枢敏化,的基础，是持续性疼痛产生和维持的关键,2,。,大量研究证实：NMDA受体的亚基NR2B在炎性痛、,神经病理痛中参与了伤害性信息传递，在疼痛调,制及痛觉敏化,的形成和维持中发挥重要作用,3,。,疼痛研究进展,2 :,Petrenko. Anesth Analg. 2003, 97(4): 1108-1116.,3 :,Nagy GG. Eur J Neurosci, 2004, 20 (12): 3301 - 3312.,（一）, NMDA受体活化是反复伤害性刺激诱发中枢敏化疼痛研究进展,3,研究显示，,MAPK,信号通路在神经可塑性和炎症,反应的细胞信号转导过程中起重要作用,4,。,增生肥大的星形胶质细胞能释放大量胶质纤维酸,性蛋白（,GFAP,），骨癌痛的产生和维持与脊髓,星形胶质细胞结构和功能的变化密切相关,1,。,4 :,De Leo JA. Pain, 2006, 122 (122): 17221.,疼痛研究进展,（二）, 研究显示，MAPK信号通路在神经可塑性和炎症4 :,4,研究癌痛的确切机制，需要适当的动物模型，现有动物模型仍显不足。,小鼠骨癌痛模型的优势,肺癌是临床骨转移较多见的一种肿瘤，且小鼠在肿瘤,学及神经系统研究方面具有独特的优势。,小鼠作为实验模型，较经济适用,本实验参照,Schwei,等的方法，将,Lewis,肺癌细胞接种,于,C57BL/6,小鼠股骨骨髓腔，建立一个全新的骨癌痛,模型。,研究癌痛的确切机制，需要适当的动物模型，现有动物模型仍显不足,5,我们从如下四个方面加以研究：,1、建立一个小鼠骨癌痛新模型,2、,NR2B,在骨癌痛小鼠前扣带回和脊髓中的分,布与表达,3、,脊髓,NR2B,基因沉默对小鼠骨癌痛的影响,4、,MAPK,信号通路介导的,NR2B,在小鼠骨癌痛中,的作用机制,NR2B,是否也参与骨癌痛的发生机制呢？,我们从如下四个方面加以研究：NR2B是否也参与骨癌痛的发生机,6,实施方案：,检测癌痛小鼠脊髓和前扣带回,NR2B,的表达和分布，分析小鼠,NR2B,的表达和小鼠疼痛行为学关系。,应用,RNA,干扰技术，沉默骨癌痛小鼠,NR2B,基因；通过对比干扰组小鼠与癌痛组小鼠,NR2B,的表达以及两组小鼠疼痛行为学，从而阐明,NR2B,是否在癌痛的发生与维持中起重要作用。,实施方案：,7,对比骨癌痛小鼠,NR2B,基因沉默前后，,MAPK,信号通路及其介导的下游信号分子表达的相应改变；,研究,MAPK,信号通路中信号分子表达的相应改变与,GFAP,的关联性；,探索,MAPK,信号通路在小鼠骨癌痛中的可能作用机制。,NR2B,是怎样参与骨癌痛的发生机制呢？,对比骨癌痛小鼠NR2B基因沉默前后，MAPK 信号通路及其,8,选用清洁级雄性,C57BL/6,小鼠,模型组,一般情况观察,行为学测定,内容1技术路线,热灭活组,PBS,组,正常对照组,放射学检查,组织学检测,自发痛行为观察,机械性触诱发痛,选用清洁级雄性C57BL/6小鼠模型组一般情况观察行为学测定,9,选用清洁级雄性,C57BL/6,小鼠,癌痛组,一般情况观察,行为学测定,内容2技术路线,假手术组,正常对照组,实时定量,PCR,检测,NR2B,的表达,免疫组化检测,NR2B,的表达及分布,自发痛行为观察,机械性触诱发痛,Western Blot,检测,NR2B,的表达,选用清洁级雄性C57BL/6小鼠癌痛组一般情况观察行为学测定,10,选用清洁级雄性,C57BL/6,小鼠,癌痛组,一般情况观察,行为学测定,内容3技术路线,干扰组,干扰对照组,实时定量,PCR,检测,NR2B,的表达,自发痛行为观察,机械性触诱发痛,Western Blot,检测,NR2B,的表达,选用清洁级雄性C57BL/6小鼠癌痛组一般情况观察行为学测定,11,选用清洁级雄性,C57BL/6,小鼠,正常组,一般情况观察,行为学测定,内容4技术路线,干扰组,干扰对照组,实时定量PCR检测,NR2B,、,SP,、,c-fos,和,GFAP,基因,的表达,自发痛行为观察,机械性触诱发痛,Western Blot检测,NR2B,，,p-ERK,，,p-p38,和,GFAP,的表达,癌痛组,选用清洁级雄性C57BL/6小鼠正常组一般情况观察行为学测定,12,结 果,结 果,13,体重和一般状况,图,1,：观察期内各组小鼠体重的变化,体重和一般状况 图1：观察期内各组小,14,2.行为学测试,图,2,：自发痛行为观察 图,3,：机械性触诱发痛测定,2.行为学测试 图2：自发痛行为观察,15,3.,放射学检测,图,4,：模型组小鼠不同时间段术侧股骨,X,片结果,:,A,为肿瘤细胞接种前摄片；,B,为接种后第,7,天；,C,为接种后第,15,天；,D,为接种后第,23,天。,3. 放射学检测图4：模型组小鼠不同时间段术侧股骨X片结,16,组织学观察,骨髓腔内可见较多肿瘤细胞,骨髓腔内大量肿瘤细胞浸润且骨小梁破坏,肿瘤细胞侵犯周围肌肉,骨髓腔破坏，肿瘤细胞穿破骨组织,A:,接种第,7,天模型组小鼠股骨切片,B:,接种第,15,天模型组小鼠股骨切片,C,:,1,接种第,23,天模型组小鼠股骨切片,C2,:,接种第,23,天模型组小鼠股骨,周围肌肉组织病检结果,图,6,：模型组小鼠术侧股骨下段不同时间段的,HE,染色（,HE400,）,组织学观察 骨髓腔内可见较多肿瘤细胞骨髓腔内大量肿瘤细,17,行为学、放射学、组织学三方面证实：,C57BL/6,小鼠股骨骨髓腔接种,Lewis,肺癌细胞，能成功制备小鼠骨癌痛模型，且此模型稳定、重复性好，与人类骨癌痛高度相似。, 本研究我们首次选用来源广泛、致瘤作用强的,Lewis,肺癌细胞，接种于,C57BL/6,小鼠股骨骨髓,腔，建立了一个新的小鼠骨癌痛模型。,行为学、放射学、组织学三方面证实： 本研究我们首次选用来,18,5、实时荧光定量,PCR,检测前扣带回和脊髓,NR2B,的表达,前扣带回,NR2B,的表达,前脑扣带回,NR2BmRNA,相对表达量,5、实时荧光定量PCR检测前扣带回和脊髓NR2B的表达前扣带,19,脊髓,NR2B,的表达,图,5,：脊髓,NR2BmRNA,相对表达量,脊髓NR2B的表达图5：脊髓NR2BmRNA 相对表达量,20,第,14,天前扣带回,NR2B,的表达,A,癌痛组前扣带回,100,倍；,B,癌痛组前扣带回区域,200,倍,C,正常组前扣带回,100,倍；,D,正常组前扣带回区域,200,倍,E,假手术组前扣带回,100,倍；,F,假手术组前扣带回区域,200,倍,6、,免疫组化检测前扣带回和脊髓,NR2B,的表达,前脑扣带回,NR2B,的表达,第14天前扣带回NR2B的表达6、 免疫组化检测前扣带回和脊,21,L4-L6,脊髓,NR2B,的表达,L4-L6,脊髓,NR2B,的表达（,200,倍）,术后第,14,天，,L4-L6,脊髓,NR2B,的表达,术后第,18,天，,L4-L6,脊髓,NR2B,的表达,癌痛组,假手术组,正常组,癌痛组,假手术组,正常组,L4-L6脊髓NR2B的表达L4-L6脊髓NR2B的表达（,22,L4-L6,脊髓,NR2B,的分布,癌痛组 正常组 假手术组,L4-L6,脊髓,NR2B,的分布（接种后,14,天）,脊髓各层,NR2B,表达量在中央导水管、背角浅层、前角依次增多,L4-L6脊髓NR2B的分布 L4-L6脊髓,23,7、,Western Blot,检测,L4-6,段脊髓,NR2B,的表达,*,术后第,14,天各组小鼠脊髓,NR2B,术后第,18,天各组小鼠脊髓,NR2B,的表达，,A:,癌痛组,B:,假手术组,C:,正常组,的表达，,A:,癌痛组,B:,假手术组,C:,正常组,*,7、Western Blot检测L4-6段脊髓NR2B的表达,24,1,、癌痛组小鼠脊髓和前扣带回中,NR2B,表达均明显增加，脊髓各层表达量由大到小依次为前角、背角浅层、中央导水管周围；且癌痛组,NR2B,表达上调的同时，疼痛行为学也有相应的改变。初步表明脊髓和前扣带回中的,NR2B,表达增加与小鼠骨癌痛产生和维持存在一定相关性。,2,、同一癌痛模型中观察到,NR2B,在脊髓和前扣带回同时高表达，提示在癌痛的产生和维持中不仅激活了脊髓低位中枢，而且有脑部中枢的参与。,3,、本研究初次发现,NR2B,在脊髓前角细胞表达呈强阳性，为下一步研究提供了新的思路。,1、癌痛组小鼠脊髓和前扣带回中NR2B表达均明,25,图,3,：,癌痛组、干扰组和干扰对照组,小鼠脊髓,NR2BmRNA,的相对表达量,8、实时荧光定量,PCR,检测小鼠脊髓,L4-6,节段,NR2B,的表达,图3：癌痛组、干扰组和干扰对照组小鼠脊髓NR2BmRNA的相,26,9、,Western Blot,检测小鼠脊髓,L4-6,节段,NR2B,的表达,Western Blot,检测接种术后第,14,天,小鼠脊髓,L4-6,节段,NR2B,的表达,A:,干扰组；,B:,干扰对照组；,C:,癌痛组,NR2B,GAPDH,A B C,*,Western Blot,检测接种术后第,18,天,小鼠脊髓,L4-6,节段,NR2B,的表达,A:,干扰组；,B:,干扰对照组；,C:,癌痛组,NR2B,GAPDH,*,9、Western Blot检测小鼠脊髓L4-6节段NR2B,27,1、,PEI/NR2B-siRNA,复合物鞘内注射后能使骨癌痛小鼠脊髓中,NR2B,的表达下调；,2、骨癌痛小鼠脊髓中,NR2B,的表达下调与小鼠疼痛行为学减轻相一致，进一步证明,NR2B,在癌痛发生过程中起重要作用，可能是癌痛治疗的有效靶点。,1、 PEI/NR2B-siRNA复合物鞘内注射后能使骨癌痛,28,10、实时荧光定量PCR检测小鼠脊髓,NR2B,、,SP,、,c-fos,和,GFAP,基因,的表达,接种术后第,14,天，实时荧光定量,PCR,检测各组小鼠脊髓,NR2B,、,SP,、,GFAP,、,c-fos,的相对表达量,注：图示中,NR2B,组放大,100,倍，,c-fos,放大,10,倍,10、实时荧光定量PCR检测小鼠脊髓NR2B、SP、接种术后,29,11、实时荧光定量PCR检测小鼠脊髓,NR2B,、,SP,、,c-fos,和,GFAP,基因,的表达,接种术后第,18,天，实时荧光定量,PCR,检测各组小鼠脊髓,NR2B,、,SP,、,GFAP,、,c-fos,的相对表达量,注：图示中,NR2B,和,c-fos,组均放大,100,倍,11、实时荧光定量PCR检测小鼠脊髓NR2B、SP、接种术后,30,图5：,Western Blot,检测接种术后第,18,天,小鼠脊髓,NR2B,的表达,A: 正常组；B: 癌痛组；C: 干扰组；D: 干扰对照组,*,图6：Western Blot检测接种术后第14天,小鼠脊髓,p-ERK,的表达,A: 正常组；B: 癌痛组；C: 干扰组；D: 干扰对照组,3.1,接种术后第,14,天，检测,NR2B,和,p-ERK,蛋白表达,NR2B,GAPDH,p-ERK,GAPDH,*,12、,Western Blot,检测接种术后第,14,天,小鼠脊髓的,NR2B,，,p-ERK,，,p-p38,和,GFAP,蛋白表达,图5：Western Blot检测接种术,31,Western Blot,检测接种术后第,1,4,天,小鼠脊髓,p-p38,的表达,A: 正常组；B: 癌痛组；C: 干扰组；D: 干扰对照组,*,Western Blot检测接种术后第14天,小鼠脊髓,GFAP,的表达,A: 正常组；B: 癌痛组；C: 干扰组；D: 干扰对照组,*,13、接种术后第,14,天，检测,p-p38,和,GFAP,蛋白表达,GAPDH,GFAP,GAPDH,Western Blot检测接种术后第14天* W,32,Western Blot,检测接种术后第,18,天,小鼠脊髓,NR2B,的表达,A: 正常组；B: 癌痛组；C: 干扰组；D: 干扰对照组,Western Blot检测接种术后第18天,小鼠脊髓,p-ERK,的表达,A: 正常组；B: 癌痛组；C: 干扰组；D: 干扰对照组,接种术后第,18,天，检测,NR2B,和,p-ERK,蛋白表达,14、,Western Blot,检测接种术后第,1,8,天,小鼠脊髓的,NR2B,，,p-ERK,，,p-p38,和,GFAP,蛋白表达,NR2B,GAPDH,p-ERK,GAPDH,*,*,Western Blot检测接种术后第18天Western,33,Western Blot,检测接种术后第,1,8,天,小鼠脊髓,p-p38,的表达,A: 正常组；B: 癌痛组；C: 干扰组；D: 干扰对照组,Western Blot检测接种术后第18天,小鼠脊髓,GFAP,的表达,A: 正常组；B: 癌痛组；C: 干扰组；D: 干扰对照组,接种术后第,18,天，检测,p-p38,和,GFAP,蛋白表达,p-p38,GAPDH,GFAP,GAPDH,*,*,Western Blot检测接种术后第18天Western,34,1,）癌痛小鼠的,MAPK,通路中相应信号分子,p-ERK,、,p-p38,、,c-fos,表达明显上调；而,NR2B,的沉默可以下调,MAPK,通路中相应信号分子,p-ERK,、,p-p38,、,c-fos,表达；,2,）,GFAP,在,癌痛小鼠中高表达，同时,NR2B,的调控可以影响,GFAP,的,表达；,1）癌痛小鼠的MAPK通路中相应信号分子p-ERK、p-p3,35,解除,Mg2+,对,NMDA,受体离子通道的阻断作用,结合到突触后膜上配体门控离子型谷氨酸受体,AMPA,受体，,Na+,内流,NMDA,受体激活，,Ca2+,内流增加,激活,ERK,，,p38,c-fos,转录因子,激活,NR2B,表达,伤害性信号传入脊髓背角,，释放大量谷氨酸,SP,表达,神经元下游相关基因表达变化,神经胶质细胞,GFAP,表达,结合到胶质细胞上,AMPA,受体,激活,ERK,，,p38,直接导致胶质细胞内的,GFAP,大量表达,导致癌痛,我们推测癌痛产生的可能机制,因此，,解除Mg2+ 对NMDA受体离子通道的阻断作用结合到突触后膜,36,NR2B在小鼠骨癌痛中的作用及机制研究课件,37,结 论,1. C57BL/6,小鼠股骨骨髓腔接种,Lewis,肺癌细胞能成功制备小鼠骨癌痛新模型，此模型与人类骨癌痛具有相似性；,2. NR2B,在小鼠骨癌痛模型中呈高表达，且同一癌痛模型中观察到,NR2B,在,L4-L6,段脊髓和前扣带回同时高表达，提示在癌痛的产生和维持中不仅激活了脊髓低位中枢，而且有脑部中枢参与；,3.,本研究初次发现,NR2B,在癌痛模型的,L4-6,段脊髓前角细胞表达呈强阳性，为下一步研究提供了新的思路；,结 论1. C57BL/6小鼠股骨骨髓腔接种Lewis肺癌细,38,结 论,4. PEI/NR2B-siRNA,复合物能特异性的使骨癌痛小鼠脊髓,NR2B,的表达明显下调；其表达下调与小鼠疼痛行为学减轻相一致，进一步证明,NR2B,在骨癌痛发生过程中起重要作用；,5. MAPK,信号转导通路（,ERK,通路和,p38,通路）在骨癌痛小鼠模型中被激活；,NR2B,参与了,MAPK,信号通路介导的骨癌痛的中枢敏化；,6. NR2B,参与介导的骨癌痛可能与,GFAP,的过表达相关，其机制有待进一步研究。,结 论4. PEI/NR2B-siRNA复合物能特异性的使骨,39,