龋病病因及其免疫预防--课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,ppt课件,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,龋病病因及其免疫预防,1,ppt课件,龋病病因及其免疫预防1ppt课件,1,根据,WHO 2004,年报告龋病仍是人类最常见的疾病之一,2,ppt课件,根据WHO 2004年报告龋病仍是人类最常见,2,精品资料,精品资料,3,你怎么称呼老师？,如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？,你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？,教师的教鞭,“不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘 ”,“太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早”,龋病病因及其免疫预防-课件,4,龋病严重威胁人群的口腔健康,Age,Prevalence,DMFT,Treated rate,5,岁组乳牙,66.0%,3.5 dmft,3%,12,岁组恒牙,28.9%,0.5 DMFT,11%,35,44,岁,88.1%,4.5 DMFT,8.321.1%,65,74,岁,98.4%,14.7 DMFT,第三次全国口腔健康流行病学抽样调查结果,5,ppt课件,龋病严重威胁人群的口腔健康AgePrevalenceDMFT,5,龋病的病因学,四联因素理论,龋病预防,控制致龋微生物,增强宿主抵抗力,控制高糖饮食,6,ppt课件,龋病的病因学四联因素理论龋病预防控制致龋微生物增强宿主抵,6,龋病发病理论,非特异性菌斑学说,特异性菌斑学说,7,ppt课件,龋病发病理论非特异性菌斑学说7ppt课件,7,非特异性菌斑假说,广义龋病生态学假说,8,ppt课件,非特异性菌斑假说广义龋病生态学假说8ppt课件,8,龋病发生并非少数几种致龋菌作用的结果，菌斑生物膜的影响是一个动态过程，最终导致龋病发生。,9,ppt课件,龋病发生并非少数几种致龋菌作用的结果，菌斑生物膜的影响是一个,9,I,、动态稳定阶段,产酸,脱矿,再矿化、自稳机制平衡,该过程以非变异链球菌群和放线菌为主导,10,ppt课件,I、动态稳定阶段10ppt课件,10,II,、产酸阶段,糖类频繁摄入，唾液量，无法中和酸,菌斑,pH,下降并持续,非变异链球菌群的产酸菌和耐酸适应性增强,放线菌、血链、口腔链球菌、戈登链球菌、轻链等产酸性，自适应耐酸性,菌群产酸潜力改变龋病发生,11,ppt课件,II、产酸阶段11ppt课件,11,III,、耐酸阶段,变异链球菌、乳杆菌在极端酸性条件上更具竞争力,pH4.0,后，部分非变异链球菌和放线菌失去生存能力,代之以变链菌、乳杆菌、双岐杆菌,12,ppt课件,III、耐酸阶段12ppt课件,12,特异性菌斑学说,13,ppt课件,特异性菌斑学说13ppt课件,13,口腔中各菌种在不同部位的检出水平,14,ppt课件,口腔中各菌种在不同部位的检出水平14ppt课件,14,S. sanguis,和,Mutans. S,是在菌斑和龋病病损中最常检出的菌种，两者都能够产酸，但只有,Mutans. S,能够单独在无菌动物模型上产生龋齿。,乳杆菌,致龋始动作用不明显，促进,龋病,进展,放线菌,与根面龋发病有关,S. mutans,大鼠磨牙龋齿模型,15,ppt课件,S. sanguis和 Mutans. S是在菌斑和龋病病损,15,S. mutans,作为主要致龋菌的流行病学证据,S. mutans,几乎总是能从菌斑中被检出。,大多数龋损部位有,10,的,S. mutans,。,大多未感染,S. mutans,的区域无龋病发生。,纵向研究发现,S. mutans,促进龋病的进展。,有研究显示，如果儿童,3,岁前没有感染,S. mutans,，则趋向于保持未感染状态几年时间，直到第二牙列萌出时新的定植机会出现。,16,ppt课件,S. mutans作为主要致龋菌的流行病学证据S. muta,16,S.Sobrinus,另一重要致龋菌,随着检测手段的改进，,S.sobrinus,在菌斑和龋损部位的检出率明显提高；,与,S.mutans,相比 ，,S.sobrinus,的产酸性和耐酸性更强，,S.sobrinus,感染与高度龋活性的关系更为密切；,研究发现口腔中同时感染,S.mutans,和,S.sobrinus,的儿童，其龋活性显著高于单一菌种感染者。,17,ppt课件,S.Sobrinus 另一重要致龋菌随着检测手段的改进，,17,S.Sobrinus,的表面蛋白抗原,SpaA,和葡糖基转移酶,GTF,与,S.mutans,的,PAc,和,GTF,之间具有较高的同源性，两菌之间具有交叉反应性。,S.mutans,S.Sobrinus,免疫电镜显示，抗,S.Sobrinus,的多克隆抗体也可以和,S.mutans,反应,18,ppt课件,S.Sobrinus的表面蛋白抗原SpaA和葡糖基转移酶GT,18,细菌粘附和聚集,致龋过程的初始,致龋菌主要依靠蔗糖非依赖性和蔗糖依赖性机制粘附聚集在牙面，代谢糖类产生乳酸，造成牙齿脱矿，龋病开始。,细菌的粘附聚集机制包括：,蔗糖非依赖性粘附,表面蛋白抗原（,PAc,）,蔗糖依赖性粘附,葡糖基转移酶（,GTF,）,葡聚糖结合蛋白（,GBP,）,19,ppt课件,细菌粘附和聚集致龋过程的初始致龋菌主要依靠蔗糖非依赖性和,19,Tooth,Pellicle,S. mutans,S. mutans,S. mutans,S. mutans,S. mutans,= GBP,= Glucan,= GTF,=PAc,致龋菌粘附和聚集模式图,20,ppt课件,ToothPellicleS. mutansS. mutan,20,致龋菌的重要毒力因子,信号肽,富含丙氨酸,富含脯氨酸,锚 基,唾液结合区段，粘附功能区（,A,区，,SBR,）,免疫活性区（,P,区）,0 500aa 1000aa 1500aa,PAc,S. mutans,: PAc, Ag I/II or P1；,S.sobrinus,: SpaA or PAg,两者之间存在明显的序列同源性(66%),PAc,结构特点：,位于氨基端1/3富含丙氨酸的重复序列唾液结合区,位于中部富含脯氨酸的重复序列,免疫活性区,21,ppt课件,致龋菌的重要毒力因子信号肽富含丙氨酸富含脯氨酸锚 基唾液结合,21,针对完整的,PAc,蛋白或其唾液结合区的抗体能够阻断,S.mutans,的粘附,对大鼠免疫,S.sobrinus,的,Spa,A,蛋白能够保护大鼠抵抗,S.sobrinus,感染,(Redman,et al,., 1995),22,ppt课件,针对完整的PAc 蛋白或其唾液结合区的抗体能够阻断S.mut,22,0 500aa 1000aa 1500aa,催化区段（,CAT,区）,葡聚糖结合区段（,GLU,区）,信号肽,GTF,S.mutans,和,S. sobrinus,都能合成几种,GTFs，,其中,GTF-I,在两种细菌之间具有,56.7%,的序列同源性,GTF,的结构特点：,位于氨基端1/3催化活性区：催化蔗糖水解为葡萄糖和果糖,靠近羧基端的重复序列葡聚糖结合区,23,ppt课件,0,23,S.mutans,至少分泌三种具有葡聚糖结合活性的蛋白:,GbpA, GbpB, GbpC,GpbB,已经被证明能够在实验性龋齿动物上诱导保护性的免疫反应,(Smith and Taubman, 1996, 1997),通过唾液腺区皮下注射,GpbB,(,Smith and Taubman, 1996),或者通过鼻腔粘膜免疫,(Smith et al., 1997),都可以达到保护效果,相对于,PAc,和,GTFs，,研究较少,GBP,24,ppt课件,S.mutans 至少分泌三种具有葡聚糖结合活性的蛋白:,24,机体粘膜免疫,共同粘膜免疫系统（,CMIS,）,抗原通过接触肠、鼻腔、支气管或泌尿生殖道等部位的粘膜相关淋巴组织，不仅可以在诱导部位产生免疫反应，而且能够在远离诱导部位的局部粘膜产生免疫反应。机体不同部位的粘膜构成一个相互联系的免疫网络，称为共同粘膜免疫系统。,25,ppt课件,机体粘膜免疫共同粘膜免疫系统（CMIS）抗原通过接触肠、鼻腔,25,Dome,P,e,y,e,r,s,P,a,t,c,h,(,G,A,L,T,),A,n,t,i,g,e,n,s,MLN,TD,Blood,Mucosal,Homing,Gastrointestinal tract,Upper respiratory tract ?,Genitourinary tract ?,Lamina Propria,Mammary,Salivary,Lachrymal,Sweat ?,Glands,sIgA,+,B cells,CD4,+,T cells,MALT,T,o,n,s,i,l,s,/,A,d,e,n,o,i,d,s,(,N,A,L,T,),T Cell Zone (35 - 40 %),B Cell Zone (45 - 50 %),CD4,+,T Cells - naive,CD4,+,T Cells - activated,CD4,+,T Cells - memory,CD8,+,CTLs,gd,T Cells,Surface IgA,+,Activated,Resting,5 - 8 %, 40 %, 60 %,M,H,C,C,l,a,s,s,I,I,+,A,P,C,s,D,e,n,d,r,i,t,i,c,a,n,d,B,C,e,l,l,s,M,Blood,Mucosal Effector Sites,Mucosal Inductive Sites Are MALT,M Cell,Lymphoepithelium,Epithelial Cells,Plasma Cell,J chain,mIgA,dIgA,S-IgA,SC,pIgA Transport,Ag Uptake,26,ppt课件,DomePeyers Patch (GALT)Antige,26,唾液分泌性,IgA (sIgA),是唾液中的主要免疫球蛋白，其功能包括：,抑制微生物在粘膜上皮和牙齿表面的黏附,中和毒素和酶类（如,GTF,）,中和病毒,抗原捕获和抗原清除,与非特异性防御机制相互作用（如黏液素、乳铁蛋白、溶菌酶等）,27,ppt课件,唾液分泌性IgA (sIgA)是唾液中的主要免疫球蛋白，其功,27,免疫防龋的理论基础,致龋菌明确：,S.mutans,和,S.sobrinus,被认为是主要致龋菌,抗原清楚：,表面蛋白抗原,PAc,、,SpaA,葡糖基转移酶,（,GTFs,）,葡聚糖结合蛋白（,Gbp,）,免疫系统的作用成分已知：,唾液中的,sIgA,抗体对防龋起主要作用,28,ppt课件,免疫防龋的理论基础致龋菌明确：抗原清楚：免疫系统的作用成分已,28,S.mutans,和,S.sobrinus,在幼儿,18-24,个月的时候开始稳定定植于口腔，这段时间称为“感染窗口”。致龋菌一旦稳定定植，则很难再彻底清除。,因此最佳的免疫时段应该在致龋菌稳定定植前，大约幼儿,1,岁左右。,免疫时机,29,ppt课件,S.mutans和S.sobrinus在幼儿18-24个月的,29,尽管刚出生的婴儿唾液中不含分泌性,IgA,，婴儿,1,个月时成熟的,IgA,已经是唾液中主要的免疫球蛋白了,;,69,个月时，大多数婴儿已具有了类似成人的,IgA1,和,IgA2,亚型分布（,Smith and Taubman, 1993,）,;,提示婴儿接近,1,岁的时候，粘膜免疫反应开始出 现明显的成熟,.,？粘膜免疫系统是否足够成熟,30,ppt课件,尽管刚出生的婴儿唾液中不含分泌性IgA，婴儿1个月时成熟的I,30,免疫途径,口腔免疫,通过诱导肠相关淋巴组织产生粘膜,IgA,反应，可采用口服、灌胃等方法,;,缺点是胃酸和各种酶会对抗原产生破坏作用，并且诱导位点（肠）和效应位点（口腔）距离远,;,通过口腔免疫可以改变变形链球菌的感染和龋病发生进程,;,动物模型（,Smith,et al,., 1979) ;,人体实验（,Smith and Taubman, 1987).,31,ppt课件,免疫途径口腔免疫通过诱导肠相关淋巴组织产生粘膜IgA反应，可,31,鼻腔免疫,较新使用的免疫途径，通过诱导鼻相关淋巴组织产生粘膜,IgA,反应,优点是鼻腔环境对抗原的降解作用小，因此需要的抗原剂量小；易于操作；诱导位点（鼻腔）和效应位点（口腔）距离近；同时诱导粘膜和系统免疫,通过鼻腔免疫可以获得明显的防龋保护效果,（Kats,et al,., 1993,；,Fan,et al,., 2002）,32,ppt课件,鼻腔免疫较新使用的免疫途径，通过诱导鼻相关淋巴组织产生粘膜I,32,扁桃体免疫,通过刺激腭扁桃体诱导免疫反应,兔扁桃体局部给予福尔马林灭活的,S.sobrinus,细胞能够诱导唾液免疫反应，明显降低,S.sobrinus,的感染,（Fukuizumi,et al,.,1999）,重复扁桃体免疫能够诱导兔大小唾液腺中产生,IgA,抗体分泌细胞（,Inoue,et al,., 1999）,33,ppt课件,扁桃体免疫通过刺激腭扁桃体诱导免疫反应33ppt课件,33,小唾液腺免疫,唇、颊、软腭小唾液腺，它们具有与淋巴组织紧密相连的分泌导管,S.sobrinus,GTF,局部用于年轻成人的下唇粘膜表面，与安慰剂组相比，免疫组在随后,6,周的时间里全唾液中的总链球菌比例明显降低（,Smith and Taubman,1990）,34,ppt课件,小唾液腺免疫唇、颊、软腭小唾液腺，它们具有与淋巴组织紧密相连,34,直肠免疫,一个远端的粘膜免疫诱导位点，分布着高密度的淋巴滤泡,初步研究表明这一途径也能诱导针对,GTF,的唾液,IgA,反应,.,（,Lam,et al,., 2001,）,使用肛栓可作为幼儿使用鼻腔免疫的替代,35,ppt课件,直肠免疫一个远端的粘膜免疫诱导位点，分布着高密度的淋巴滤泡,35,皮下和其它系统免疫,最初使用,S.mutans,全细胞作为免疫原,;,为了避免产生心脏交叉反应性抗体，亚单位疫苗和多肽疫苗被用于系统免疫以控制龋齿,;,大鼠唾液腺周围皮下注射,GTF,或合成肽诱导了高水平的血清和唾液,IgA,反应，抑制了致龋菌口腔定植和龋病发生,（Taubman,et al,.）,。,36,ppt课件,皮下和其它系统免疫最初使用 S.mutans 全细胞作为免疫,36,免疫效果评价,体内研究：,唾液中特异性的,sIgA,抗体水平（,ELISA,）,是否干扰致龋菌在牙面的定植（细菌培养计数）,龋齿动物模型的患龋水平（,Keyes,记分）,体外研究：,免疫血清,/,唾液引起致龋菌的凝集,抑制致龋菌在羟磷灰石表面的黏附,影响生物膜的形成和结构,37,ppt课件,免疫效果评价体内研究：体外研究：37ppt课件,37,免疫防龋研究方向,主动免疫防龋（防龋疫苗）,亚单位疫苗,合成肽疫苗,细菌活载体疫苗,DNA,疫苗,被动免疫防龋,在牛奶或鸡蛋黄中产生针对变形链球菌的抗体,鼠单克隆抗体,38,ppt课件,免疫防龋研究方向主动免疫防龋（防龋疫苗）亚单位疫苗被动免疫防,38,牛奶多克隆抗体,鸡蛋黄,IgY,抗体,被 动 免 疫,39,ppt课件,牛奶多克隆抗体 被 动 免 疫39ppt课件,39,construction of GTase-I,overexpressing,strain B29-33,intramuscular immunization,specific cow milk antibodies,mouth rinsing,colonization level of,S.mutan,on teeth surface,Effect of specific bovine milk antibodies,against dental caries,40,ppt课件,Effect of specific bovine mil,40,41,ppt课件,41ppt课件,41,killed,S.mutans, S.sobrinus,whole cells,egg yolk IgY,effect of specific IgY on caries,prevention in animal models,intramuscular,immunization,Effect of specific IgY on prevention,of dental caries,42,ppt课件,killed S.mutans, S.sobrinus wh,42,（江千舟，樊明文等，,2001,）,43,ppt课件,（江千舟，樊明文等，2001）43ppt课件,43,主 动 免 疫,44,ppt课件,主 动 免 疫44ppt课件,44,亚单位疫苗,以生物化学和物理方法提取纯化,PAc,、,GTFs,等特异性抗原，或利用基因重组技术将,PAc,、,GTFs,等抗原的基因片段克隆到原核高效表达载体中，使之大量表达，再将其提取纯化制成的疫苗。,代表性研究,Childers,等提取了,GTF,蛋白用于临床研究,（,2002, 2003, 2006,）,Michalek,等制备了融合,PAc SBR,区和,GTF GLU,区的重组蛋白,（,2002,）,45,ppt课件,亚单位疫苗以生物化学和物理方法提取纯化PAc、GTFs等特异,45,合成肽疫苗,合成肽疫苗是根据致龋菌毒力因子的重要免疫原性和功能区的氨基酸序列，人工合成的十到数十个氨基酸残基的短肽疫苗。,Taubman,，,Smith,等合成了对应,GTF,的,CAT,区和,GLU,区的多肽,（,2005,，,2007,）,代表性研究,46,ppt课件,合成肽疫苗合成肽疫苗是根据致龋菌毒力因子的重要免疫原性和功能,46,将,PAc,和,GTFs,等抗原的基因克隆到原核表达质粒中，然后将质粒克隆到载体菌中，由载体菌在体内携带和表达。常用的载体菌有减毒沙门氏菌和乳链球菌。,细菌活载体疫苗,代表性研究,Redman,等构建了表达,S.sobrinus,表面蛋白,SpaA,的重组沙门氏菌,（,1994,）,凌均棨等研究了基因重组乳链球菌防龋疫苗,（,1999,）,47,ppt课件,将PAc和GTFs等抗原的基因克隆到原核表达质粒中，然后将质,47,DNA,疫苗,将携带抗原基因的真核表达载体直接导入宿主细胞内，诱导宿主免疫系统对抗原基因所表达的蛋白发生免疫反应。,代表性研究,樊明文等分别以,pCI,和,pVAX1,为载体研制了针对,PAc,和,GTF,的防龋,DNA,疫苗,（,口腔医学纵横, 2000,；,J Dent Res, 2002,；,Vaccine, 2006,）,刘天佳等以,pcDNA3.1,为载体，研制了分别针对,PAc,和,GTF,的防龋,DNA,疫苗,（,华西口腔医学杂志, 2001,）,Han,等构建了编码变链菌壁相关蛋白,WapA,的,DNA,疫苗,（,DNA Cell Biol, 2005,）,48,ppt课件,DNA疫苗将携带抗原基因的真核表达载体直接导入宿主细胞内，诱,48,防 龋,DNA,疫 苗,49,ppt课件,防 龋 DNA 疫 苗49ppt课件,49,防龋,DNA,疫苗,pCIA-P,融合防龋,DNA,疫苗,pGLUA-P,50,ppt课件,防龋DNA疫苗pCIA-P融合防龋DNA疫苗pGLUA-P5,50,靶向融合防龋,DNA,疫苗,pGJA-P,人用靶向融合防龋,DNA,疫苗,pGJA-P/VAX,51,ppt课件,靶向融合防龋DNA疫苗pGJA-P人用靶向融合防龋DNA疫苗,51,复合防龋,DNA,疫苗,pGJGAC/VAX,52,ppt课件,复合防龋DNA疫苗pGJGAC/VAX52ppt课件,52,cy3-SABC,法，抗,PAc,抗体,cy3-SABC,法，抗,GTF,抗体,阴性对照,防龋质粒,DNA,在体外真核细胞中表达抗原蛋白,53,ppt课件,cy3-SABC法，抗PAc 抗体cy3-SABC法，抗GT,53,在大鼠股四头肌中的表达,阴性对照,防龋质粒,DNA,在肌肉组织中表达抗原蛋白,54,ppt课件,在大鼠股四头肌中的表达阴性对照防龋质粒DNA在肌肉组织中表达,54,在大鼠颌下腺导管中的表达,阴性对照,防龋质粒,DNA,在颌下腺组织中表达抗原蛋白,55,ppt课件,在大鼠颌下腺导管中的表达阴性对照防龋质粒DNA在颌下腺组织中,55,动物实验研究,BALB/c,小鼠,疫苗防龋保护实验（大鼠龋病模型）,日本大耳白兔,金黄毛地鼠,56,ppt课件,动物实验研究,56,通过粘膜途径免疫，靶向防龋,DNA,疫苗能够在小鼠、大鼠、金黄毛地鼠、兔等多种动物体内诱导特异性的唾液,IgA,和血清,IgG,抗体,龋齿模型研究显示靶向防龋,DNA,疫苗能够显著降低实验动物的龋齿水平,肌肉注射免疫 鼻腔粘膜免疫,E D,S,D,M,E D,S,D,M,49% 43% 52% 57% 63% 70%,靶向防龋,DNA,疫苗免疫金黄毛地鼠后的龋齿降低率,57,ppt课件,通过粘膜途径免疫，靶向防龋DNA疫苗能够在小鼠、大鼠、金黄毛,57,正常大鼠磨牙纵切面,龋坏,防龋质粒,DNA,免疫定菌鼠磨牙纵切面患龋情况,58,ppt课件,正常大鼠磨牙纵切面龋坏防龋质粒DNA免疫定菌鼠磨牙纵切面患龋,58,未免疫大鼠磨牙纵切面患龋情况,59,ppt课件,未免疫大鼠磨牙纵切面患龋情况59ppt课件,59,靶向疫苗,pGJA-P/VAX,免疫猕猴实验研究,采集鼻腔分泌物样本,采集唾液样本,采集血液样本,60,ppt课件,靶向疫苗pGJA-P/VAX免疫猕猴实验研究 采集鼻腔分泌物,60,A,组（,2,只，,1,和,2,）经三角肌注射,pGJA-P/VAX,B,组（,2,只，,3,和,4,）经鼻滴注,pGJA-P/VAX/bupivacaine,复合物,C,组（,1,只，,5,）经三角肌注射,pVAX1,D,组（,1,只，,6,）经鼻滴注,pVAX1/bupivacaine,复合物,唾液抗,PAc,特异性,SIgA,抗体中，,2,、,3,和,4,号猴免疫后,2,月和,3,月时较免疫前显著升高，并以,2,、,4,号猴水平最高。,1,号和对照猴（,5,和,6,号）没有显著变化。,唾液抗,GTF,特异性,SIgA,抗体中，,2,、,3,和,4,号猴免疫后,2,月和,3,月时较免疫前显著升高，并以,2,、,4,号猴水平最高。,1,号和对照猴（,5,和,6,号）没有显著变化,61,ppt课件,A组（2只，1和2）经三角肌注射pGJA-P/VAX唾液,61,鼻腔分泌物抗,PAc,特异性,SIgA,抗体中，,2,、,3,和,4,号猴免疫后,2,月和,3,月时较免疫前显著升高，并以,2,、,4,号猴水平最高；,1,号和对照猴（,5,和,6,号）没有显著变化。,鼻腔分泌物抗,GTF,特异性,SIgA,抗体中，,2,、,3,和,4,号猴免疫后,2,月和,3,月时较免疫前显著升高，并以,2,、,4,号猴水平最高；,1,号和对照猴（,5,和,6,号）没有显著变化。,62,ppt课件,鼻腔分泌物抗PAc特异性SIgA抗体中，2、3和4号猴免疫后,62,1,号猴，,2,号猴，,3,号猴，,4,号猴，,5,号猴，,6,号猴,1,号和,2,号猴免疫后一个月时血清抗,PAc IgG,抗体水平就比免疫前高,16,倍；,3,号猴免疫后,3,个月时血清抗,PAc IgG,抗体水平也达到比免疫前高,16,倍；,4,号猴免疫后,3,个月时血清抗,PAc IgG,抗体水平达到比免疫前高,8,倍；,5,号和,6,号免疫前后血清抗,PAc IgG,抗体水平无显著变化。,1,号和,2,号猴免疫后一个月时血清抗,GTF IgG,抗体水平就比免疫前高,16,倍，,2,个月时达,32,倍；,3,号猴免疫后,2,个月时血清抗,PAc IgG,抗体水平也达到比免疫前高,8,倍；,4,号猴免疫后,1,个月时血清抗,PAc IgG,抗体水平达到比免疫前高,16,倍，,3,个月时达,32,倍；,5,号和,6,号免疫前后血清抗,PAc IgG,抗体水平无显著变化。,63,ppt课件, 1号猴， 2号猴，3号猴， 4号猴， 5号猴，,63,防龋,DNA,疫苗现状,研制融合疫苗,从实验室研究到中试生产,DNA,疫苗的免疫机制,64,ppt课件,防龋DNA疫苗现状64ppt课件,64,65,ppt课件,65ppt课件,65,与武汉生物制品研究所合作正在进行防龋,DNA,疫苗的中试研究，小规模中试产品质量已达到,预防用,DNA,疫苗临床前研究技术指导原则,的要求。,1.,发酵工艺,用,14升,罐发酵，获得湿菌,67克,用,50升,发酵罐发酵，获得湿菌,450克,2.,质粒纯化工艺研究,（1）质粒的粗提,:,碱裂解法,防龋,DNA,疫苗的中试生产,66,ppt课件,与武汉生物制品研究所合作正在进行防龋DNA疫,66,（,2,）号柱层析：去除RNA、细菌蛋白、宿主菌基因组DNA,（,3,）号柱层析：捕获超螺旋质粒,0D260/OD280大于1.75,细菌残余蛋白含量小于0.001ug/ug质粒,琼脂糖电泳后RNA肉眼不可见,超螺旋质粒含量,80%,67,ppt课件,（2）号柱层析：去除RNA、细菌蛋白、宿主菌基因组DNA,67,（,4,）号柱层析：,去除内毒素,内毒素降至,0.01,EU/,ug,3.,建立了产品质量控制标准：,细菌蛋白定量检测方法,RNA,残留检测方法,细菌残余DNA检测方法,内毒素检测方法,68,ppt课件,（4）号柱层析：去除内毒素,68,小规模中试产品,69,ppt课件,小规模中试产品69ppt课件,69,树突状细胞在靶向防龋,DNA,疫苗免疫中的作用机制研究,靶向防龋,DNA,疫苗编码的蛋白能否与树突状细胞特异结合？,靶向疫苗对树突状细胞的免疫相关基因表达产生的影响。,粘膜免疫诱导部位和系统免疫部位的树突状细胞基因表达谱的差异。,70,ppt课件,树突状细胞在靶向防龋DNA疫苗免疫中的作用机制研究靶向防龋D,70,靶向防龋,DNA,疫苗编码的蛋白能否与树突状细胞（,DC,）特异结合？,问题,1,71,ppt课件,靶向防龋DNA疫苗编码的蛋白能否与树突状细胞（DC）特异结合,71,靶向融合蛋白与,DC,的靶向结合能力研究,1.,人外周血来源的,DC,的培养和鉴定,淋巴细胞分离液,离心,400g 30min,外周血单个核细胞,单核细胞,磁珠分选,树突状细胞,体外培养,Morphology,Surface marker,Function,稀释外周血,72,ppt课件,靶向融合蛋白与DC的靶向结合能力研究 1. 人外周血来源的D,72,典型的树突状细胞形态,（,40,）,73,ppt课件,典型的树突状细胞形态（40）73ppt课件,73,典型的表面分子标志,低表达,CD14,、,CD83,，高表达,CD1a,、,CD80,、,CD86,、,CD40,74,ppt课件,典型的表面分子标志低表达 CD14、CD83，高表达CD1a,74,明显的刺激,T,细胞增殖功能,75,ppt课件,明显的刺激T细胞增殖功能75ppt课件,75,2.,靶向融合蛋白与,DC,的靶向结合作用研究,1,）靶向质粒转染,COS-7,细胞，收集培养上清，制备靶向融合蛋白,2,）分组：,A:,单纯,DC,B: DC,与靶向融合蛋白共孵育,C:,封闭,B7,分子的,DC,与靶向融合蛋白共孵育,3,）流式细胞术比较三组,DC,结合靶向融合蛋白的量,76,ppt课件,2. 靶向融合蛋白与DC的靶向结合作用研究1）靶向质粒转染C,76,77,ppt课件,77ppt课件,77,三组之间平均荧光强度比较,分组,平均荧光强度单位,*,p0.05,，单因素方差分析和,LSD,检验,A,3.79,7.81,4.49,B*,7.34,10.86,8.95,C,4.93,6.68,7.77,78,ppt课件,三组之间平均荧光强度比较分组 平均荧光强度单位* p0.0,78,问题,2,靶向防龋,DNA,疫苗与树突状细胞相互作用后，树突状细胞有哪些特异的基因表达变化？,79,ppt课件,问题2 靶向防龋DNA疫苗与树突状细胞相互作用后，树突,79,靶向防龋,DNA,疫苗和非靶向防龋,DNA,疫苗分别转染树突状细胞,3,天后收集树突状细胞,分离,RNA,合成探针,与树突状细胞,/,抗原提呈细胞芯片杂交,芯片扫描及数据分析,80,ppt课件,靶向防龋DNA疫苗和非靶向防龋DNA疫苗分别转染树突状细胞8,80,Targeted group,non-targeted group,81,ppt课件,Targeted groupnon-targeted gro,81,与非靶向组相比，靶向,DNA,疫苗转染的树突状细胞有,27,个免疫相关基因上调，,7,个免疫相关基因下调。,差异表达基因按功能分为,5,类：,1,）细胞因子、趋化因子及其受体,2,）抗原摄取,3,）抗原提呈,4,）细胞表面受体,5,）信号转导,82,ppt课件,与非靶向组相比，靶向DNA疫苗转染的树突状细胞有27个免疫相,82,荧光定量,PCR,验证芯片结果,gene name,primers,annealing Temperature(,),Pouduct length (bp),GAPDH,F: 5AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC 3,R : 5TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3,57,203,Ccl17,F: 5TGCTGCCTGGATTACTTCAA 3,R: 5CCCTGGACAGTCAGAAACAC 3,58,110,Ccl19,F: 5AGCCTTCCGCTACCTTCTTA 3,R: 5GCTGTTGCCTTTGTTCTTGG 3,58,160,CD207,F: 5CTACAAGGCAGCAGATGGAA 3,R: 5GACACCCTGATATTGGCACA 3,58,177,cd209a,F: 5GAGATGACGGCTGGAATGAC 3,R: 5GAGATGGTGGAGGGAGTTGG 3,58,109,Cst7,F: 5CTTGCCCTCTGCTGCCTAA 3,R: 5GCACTCCTGGGTTATTGGTC 3,59,127,IFN,F: 5AGCAACAACATAAGCGTCAT 3,R: 5CCTCAAACTTGGCAATACTC 3,58,100,IL-4,F: 5CATCCTGCTCTTCTTTCTCG 3,R: 5CCTTCTCCTGTGACCTCGTT 3,58,105,83,ppt课件,荧光定量PCR验证芯片结果gene nameprimersa,83,Gene names,Targeted group,Non-targeted group,Ratio,CCL17,2.14E-02,2.27E-03,9.43,CCL19,1.56E-01,1.24E-02,12.58,CD207,3.71E-02,1.13E-02,3.28,CD209a,1.43E-01,2.63E-02,5.44,CST7,2.37E-02,1.11E-02,2.14,IFN r,2.33E-02,1.16E-02,2.00,IL-4,3.04E-02,1.07E-02,2.84,84,ppt课件,Gene namesTargeted groupNon-ta,84,结论：,一组免疫相关基因在靶向,DNA,疫苗增强免疫反应的过程中发挥作用，其中,CCL17,和,CCL19,可能更为关键。,85,ppt课件,结论： 一组免疫相关基因在靶向DNA疫苗增强免疫反应,85,问题,3,DNA,疫苗通过粘膜途径和系统途径免疫后诱导的抗体反应具有明显的差异。,是否粘膜免疫诱导部位的树突状细胞和系统免疫部位不同？,86,ppt课件,问题3 DNA疫苗通过粘膜途径和系统途径免疫后诱导的抗,86,免疫磁珠法从小鼠派伊尔结分离粘膜树突状细胞,单细胞悬液与抗小鼠,CD11c,抗体包被的磁珠共孵育,过分离柱,洗脱阳性细胞,87,ppt课件,免疫磁珠法从小鼠派伊尔结分离粘膜树突状细胞 单细胞悬液与抗小,87,免疫磁珠法从小鼠皮肤分离系统树突状细胞,单细胞悬液与抗小鼠,MHC,抗体包被的磁珠共孵育,过分离柱,洗脱阳性细胞,88,ppt课件,免疫磁珠法从小鼠皮肤分离系统树突状细胞 单细胞悬液与抗小鼠M,88,RNA,分离,逆转录合成,cDNA,芯片杂交（,Affymetrix Mouse 430 2.0,）,芯片数据分析,基因芯片分析,89,ppt课件,RNA 分离 基因芯片分析89ppt课件,89,比较粘膜树突状细胞和系统树突状细胞的基因表达差异,3548,个基因存在表达差异,与系统树突状细胞相比，粘膜树突状细胞有,2066,个基因 表达上调，,1482,个基因表达下调,90,ppt课件,比较粘膜树突状细胞和系统树突状细胞的基因表达差异90,90,categories,up-regulated down-regulated,Cytokines,Chemokines,and their receptor 33 38,Antigen Uptake 3 2,Antigen Presentation 7 0,Cell Surface Receptor 10 3,Signal Transduction 9 9,Immune-related genes,（,114,）,91,ppt课件,categories,91,树突状细胞的功能差异可能是引起粘膜免疫反应和系统免疫反应不同特性的重要原因之一。,结论：,92,ppt课件,树突状细胞的功能差异可能是引起粘膜免疫反应和,92,2011,诺贝尔医学奖,Bruce A. Beutler1957 USALa Jolla, USA,Jules A. Hoffmann1941 LuxembourgStrasbourg, France,Ralph M. Steinman 1943 CanadaNew York, USA,免疫学的重要问题，细菌病毒感染人体，第一时间识别,前二人：先天免疫激活方面的发现,后一人：发现树突状细胞及其在获得性免疫中的作用,93,ppt课件,2011诺贝尔医学奖Bruce A. Beutler195,93,彻底革新对人体防线、免疫系统的认识,先天性免疫和获得性免疫的激活和调控机制一直扑朔迷离,他们发现了激活的关键原理，发现了免疫应答的“守门人”,形成免疫治疗的基础，为癌症治疗的发展奠定了基础,94,ppt课件,彻底革新对人体防线、免疫系统的认识94ppt课件,94,Beutler,和,Hoffmann,各自发现人体免疫系统中存在一种受体蛋白（,Lps,受体或,toll,样受体）,可识别微生物并激活先天免疫，此为第一道防线，,有,13,个成员；第二道防线：树突状细胞,Steinmann,发现树突状细胞教授白细胞识别、记忆并攻击入侵细胞，这些细胞能激活,T,细胞,95,ppt课件,Beutler和Hoffmann各自发现人体免疫系统中存在一,95,用途：治疗性疫苗,小分子靶向抗癌新药，刺激增强抗癌免疫系统,攻击肿瘤的基础,Steinmann,自己设计治疗胰腺癌方案，并采用新抗癌药,前列腺癌疫苗（,provenge,）,96,ppt课件,用途：治疗性疫苗96ppt课件,96,谢谢！,97,ppt课件,谢谢！97ppt课件,97,