生物大分子的提取与沉淀分离技术课件

,单击此处编辑母版标题样式,2017-11-23,#,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,生物大分子的提取与沉淀分离技术,生物大分子的提取与沉淀分离技术,1,第一节,细胞破碎,细胞破碎的原因：,破碎的主要方法：机械法、物理法、化学法、酶法,第一节 细胞破碎细胞破碎的原因：,2,1,机械破碎方法,1.,1,高速组织捣碎机,原理,操作：装料，低速高速,效果：作用强烈，活性物质易受破坏,1.,2,匀浆器,原理：,效果：破碎程度较捣碎机高，破坏较少,1.,3,研磨器,1 机械破碎方法1.1高速组织捣碎机,3,2,物理破碎,2.1,温度差破碎法,2.2,压力差破碎法,2.3,超声波破碎法,影响因素：样品浓度、超声波频率、功率、破碎时间,操作：冰浴、间歇进行,适用于悬浮细胞破碎,2 物理破碎2.1温度差破碎法,4,3,化学破碎法,原理：化学试剂改变或破坏细胞膜结构,常用试剂：有机溶剂、表面活性剂,4,酶学破碎法,外加酶制剂或自溶法,3化学破碎法,5,第二节 提取,1,提取的基本概念与影响因素,提取（抽提或萃取）：,主要影响因素：,a,欲提取的物质在所用的溶剂中的溶解度；,b,该物质向溶剂扩散的难易,溶解度大小：,a,溶剂：相似相溶；,b,温度,c,等电点,2,蛋白质和酶的提取,提取方法：水溶液提取、有机溶剂提取、混合提取,选择方法依据：存在部位、分子结构和溶解性质,第二节 提取1 提取的基本概念与影响因素,6,2.1,水溶液提取,水、稀盐、稀酸、稀碱溶液,常用稀盐溶液和缓冲液，应注意控制盐浓度、温度、,pH,2.1.1,盐浓度的选择,一般用等渗盐溶液。但根据溶解度，有些蛋白质要用较高浓度盐溶液提取，而有些则用纯水提取。,2.1水溶液提取水、稀盐、稀酸、稀碱溶液,7,2.1.2 pH,的选择,不在等电点附近，但不宜太高或太低。,pH34,有利于离子键分离,2.1.3,温度的选择,一般,010,（常用,4,），对于耐高温的蛋白质和酶，可适当提高温度，可使杂蛋白变性分离，有利于提取和进一步纯化。,2.1.4,添加底物或辅酶有利于酶的提取,2.1.2 pH的选择,8,2.2,有机溶剂提取,常用有机溶剂：乙醇、丙酮、丁醇等,注意：蛋白质提取应根据不同蛋白质的不同性质选用不同的提取条件,2.2有机溶剂提取,9,3,核酸的提取,类化合物都溶于水而不溶于有机溶液，一般用,水溶液提取,。提取的一般都是,核蛋白,。,DNA-Pro.,与,RNA-Pro.,在不同浓度电解质溶液中溶解度有明显差别：,0.14mol/L NaCl:RNA-Pro.,溶解度相当大，,DNA-Pro.,溶解度仅为水中,1,。,1 mol/L NaCl:RNA-Pro.,溶解度小，,DNA-Pro.,溶解度比水中大,2,倍。,DNA-Pro.,与,RNA-Pro.,在不同,pH,下溶解度不同,RNA-Pro.PH2.0-2.5 S,最小,DNA-Pro.PH4.2 S,最小,应选择不同的条件提取分离,DNA-Pro.,与,RNA-Pro.,3 核酸的提取类化合物都溶于水而不溶于有机溶液，一般用水溶液,10,3.1 RNA,提取,细胞破碎 水溶 过滤去渣 调,pH5 tRNA,mRNA,，,rRNA:,3.1.1,稀盐溶液提取,细胞破碎 匀浆,0.14 mol/L NaCl,RNA-Pro,提取液分离,DNA-Pro,、,Pro,、多糖,RNA,：,tRNA15%,，,mRNA5%,，,rRNA80%,3.1 RNA提取细胞破碎 水溶 过滤去渣 调pH5,11,3.1.2,苯酚水溶液提取,细胞破碎 匀浆,等体积,90,苯酚水溶液振荡,RNA,、,Pro,分开,RNA,、多糖（水层）；,DNA,、,Pro,（苯酚层）,冷酚法、热酚法，注意苯酚除杂,3.2 DNA,提取,浓盐法：,1mol/L,氯化钠溶液提取，含少量辛醇或戊醇的氯仿一起振荡除去蛋白质,或：先用稀盐除去,RNA,Pro,，再用浓盐提取,也可用苯酚法，苯酚层得到,DNA,、,Pro,3.1.2 苯酚水溶液提取,12,第三节 沉淀分离,分离纯化：除去各种杂质，获得较高纯度物质的过程,蛋白质和酶分离提纯方法：沉淀分离、层析分离、电泳分离、超离心分离等。,沉淀分离,：通过改变某些条件或加入某种物质，使溶液中某种溶质的溶解度降低，从而从溶液中沉淀析出的技术。包括盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、复合沉淀法、金属盐沉淀法、选择性变性沉淀等。,第三节 沉淀分离 分离纯化：除去各种杂质，获得较高纯度物质的,13,3.1,盐析沉淀法,蛋白质在水溶液中的溶解度受盐浓度影响,盐溶：,盐析：,盐浓度改变蛋白质溶解度：改变蛋白质分子表面电荷，同时改变溶液中水的活度，改变水膜,3.1 盐析沉淀法蛋白质在水溶液中的溶解度受盐浓度影响,14,蛋白质溶解度与溶液中离子强度关系：,lg(S/S,0,)=-k,s,I,lgS=lgS,0,-k,s,I=-k,s,I,为常数，取决于蛋白性质、,T,、,pH,k,s,为盐析常数，与盐性质（离子价数、离子半径等）、蛋白结构有关,k,s,越大，盐析效果越好,I=(1/2)m,i,z,i,2,一定条件下，,S,取决于,I,分段盐析：,k,s,分段盐析（,一定，,pH,、,T,一定）；,分段盐析（,k,s,、,I,一定，改变,pH,、,T,）,蛋白质溶解度与溶液中离子强度关系：,15,3.1.2,盐的选择,通常采用中性盐，最常用（,NH,4,）,2,SO,4,，原因：,水中,S,大，温度对,S,影响小，廉价易得，不易引起蛋白质变性，分段效果好。,3.1.2盐的选择,16,3.1.3,盐析注意事项,（,1,）盐纯度高，沉淀完全后再分离；,（,2,）分段盐析分离几种蛋白质，与等电点沉淀配合；,（,3,）室温或低温进行；,（,4,）选择合适浓度的样品；,（,5,）脱盐（透析、电渗析、凝胶层析、超滤）,3.1.3盐析注意事项（1）盐纯度高，沉淀完全后,17,3.2,等电点沉淀法,3.3,有机溶剂沉淀法,常用丙酮、异丙酮、乙醇、甲醇等,适用范围：,缺点：易变性,操作：低温，沉淀分离后快稀释，添加少量无机盐，,pH,接近,pI,，用量试验确定，可先浓缩。,3.4,选择性变性沉淀,杂蛋白变性沉淀，不影响所需蛋白,3.2 等电点沉淀法,18,三 核酸的沉淀分离,温度：,0,4,，防止变性和降解,加入核酸酶抑制剂防止核酸酶引起的水解,1,有机溶液沉淀法,乙醇,2,等电点沉淀法,3,钙盐沉淀法（氯化钙乙醇）,4,选择性溶剂沉淀法,三 核酸的沉淀分离温度：04，防止变性和降解,19,