基因定位常用的方法课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1,第四节 基因定位常用的方法,Wilson,于,1911,年将红绿色盲基因首次定位于,X,染色体上,开创了人类基因定位的先河,.1968,年,Donahue,利用系谱分析的方法将,Duffy,血型基因定位于,1,号染色体上,是人类首次在常染色体上进行的基因定位,.20,世纪,70,年代后,体细胞杂交重组,DNA,、分子杂交和,PCR,等技术的出现和应用，基因定位的方法愈加先进，基因定位的速度、数量明显加快。人类基因组计划的实施和完成，更加促进了基因定位的进程。,基因定位对提高人类对疾病产生的病因学的认识有重要意义。,1第四节 基因定位常用的方法 Wilson于1911年,2,明确几个基本概念,基 因,：,DNA,的功能片段。,基因组,：有机体全部,DNA,序列（它包括基因,外的非基因,DNA,序列），它是基因和,非基因,DNA,序列的总和。,基因定位,：,是用一定的方法将基因确定到染,色体的实际位置。,2 明确几个基本概念基,3,遗传做图,：是以研究家族的减数分裂，以了解两个基因分离趋势为基础来绘制基因座位间的距离，它表明基因之间连锁关系和相对距离，并以重组率来计算和表示，以厘摩（,cM,）为单位。,染色体定位：,只把基因定位到某条染色体上。,细胞水平上的基因图又称,细胞遗传图,区域定位：,从细胞遗传学水平，用染色体显带等技术在光学显微镜下观察，将基因定位到染色体的具体区带。,3遗传做图：是以研究家族的减数分裂，以了解两个基因分离趋势为,4,一、基因定位的方法,1,、体细胞杂交法基因定位：,体细胞,：即生物体除生殖细胞外的任一细,胞。,1,）体细胞杂交,的概念：,也称细胞融合（,cell infusion,），是将来源不同的两种细胞融合成一个新细胞。新产生的细胞称杂种细胞（,hybrid cell,），含双亲不同的染色体。,4一、基因定位的方法1、体细胞杂交法基因定位：,5,2,）对象,：人的细胞,鼠类：大鼠、小鼠、仓鼠,3,）杂种细胞的特点：,在繁殖传代过程中，人的染色体优先丢失，以至最后只剩几条或一条人的染色体，而啮齿类的染色体被保留下来。,5 2）对象：人的细胞,6,4,）原理：,细胞进行融合时，培养液中只有部分细胞融合成杂种细胞，还有大量未融合的双亲细胞。这就需要选择分离纯化杂种细胞。为此要,创造一种只让杂种细胞生长繁殖而亲本细胞死亡的环境,。这就要利用杂种细胞和亲本细胞对生长条件的要求和代谢的差异来进行选择。其中,最常用的是,HAT,选择系统,。,64）原理：,7,HAT,选择系统：,人的突变细胞株,：缺乏,HGPRT,酶,小鼠细胞株,：缺乏,TK,酶,两者融合培养于,HAT,培养基中,HAT,培养基：,H,为次黄嘌呤，是,HGPRT,的底物，为,DNA,合成提供原料（核苷酸旁路合成原料）,A,可阻断正常的,DNA,合成（嘌呤及,TMP,合成受抑制）,T,在胸苷激酶（,TK,）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，为,DNA,合成提供原料,7HAT选择系统：人的突变细胞株：缺乏HG,8,因此在,HAT,培养基上,人细胞：,由于,A,的存在，正常的,DNA,合成通路受阻。,同时由于,HGPRT,的缺乏，无法利用次黄嘌呤通过旁路合成,DNA,（嘌呤合成障碍）,8因此在HAT培养基上 人细胞：,9,鼠细胞,：由于,A,的存在正常的,DNA,合成通道受阻，有,HGPRT,可以利用次黄嘌呤合成腺嘌呤，鸟嘌呤，但由于无,TK,，无法合成胸腺嘧啶。（嘧啶合成障碍）,杂种细胞,：有,HGPRT,旁路合成腺嘌呤,鸟嘌呤；并可以利用,TK,合成胸腺嘧啶（嘌呤和嘧啶都可以正常合成）,9鼠细胞：由于A的存在正常的DNA合成通道受阻，有HGPRT,10,将筛选出来的杂种细胞转移到正常培养基继续培养，,由于人和鼠都有各自不同的生化和免疫学特性,，,Miller,等运用体细胞杂交并结合杂种细胞的特征，证明杂种细胞的存活需要胸苷激酶（,TK,）。凡是含有人,17,号染色体的杂种细胞都因有,TK,活性而存活，反之则死亡，从而推断,TK,基因定位于,17,号染色体上，这是首例应用体细胞杂交法进行的基因定位。,10 将筛选出来的杂种细胞转移到正常培养基继续培,11,鼠,人,X,TK-,HPRT+,TK+,HPRT-,鼠,人,鼠,人,鼠,人,TK+,HPRT+,17 3,17,3,17 3,TK+,TK+,TK-,HAT,11鼠人XTK-TK+鼠人鼠人鼠人TK+17 317317,12,克隆嵌板法,(clone panel method),根据不同杂种细胞保留或丢失的人染色体有时是重叠的情况,设计的一种简便而实用的基因定位方法。,克隆嵌板,杂种克隆 保留的人染色体,1 2 3 4 5 6 7 8,A +-,B +-+-,C +-+-+-+-,12克隆嵌板法(clone panel method),13,2.,原位杂交和荧光原位杂交,1,）原位杂交（,in situ hybridization,）：是最直接的基因定位方法之一，是分子生物学技术在基因定位中的应用，胰岛素基因用此方法定位于,11p15,。,2,）原理：碱基的互补配对，同源的,DNA-DNA,双链或,DNA-RNA,双链在一定条件下能结合成双链。用放射性或非放射性物质标记的,DNA,、,RNA,或与,mRNA,互补的,cDNA,作探针，可检测细胞基因组中的同源部分。,132.原位杂交和荧光原位杂交,14,3,）原位杂交的特点：,杂交在载玻片上的中期染色体上进行，而不是在溶液和膜上进行。所谓原位是指在标本上,DNA,原位变性，再与放射性或非放射性物质（通常用,3H,）标记的已知核酸探针杂交，通过放射自显影来检测染色体上特异,DNA,或,RNA,顺序，用放射性颗粒在某条染色体的区带出现的最高频率或荧光的强度来确定探针的位置，从而准确地进行基因定位。,143）原位杂交的特点：,15,4,）原位杂交的步骤,制备中期染色体,DNA,原位变性,变性 放射性或非放射性标记探针,杂交（在载玻片上）,洗膜,放射性标记：放射自显影,检测 非放射性标记：荧光染料与抗体或蛋白结合,记录杂交信号 结合染色体形态进行基因定位,154）原位杂交的步骤 制备中期染色体,16,5,）荧光原位杂交,（,florescence in situ hybridization,，,FISH,）,用特殊荧光素（,dig,或,Biotin,）标记探针,DNA,（,Nick translation,标记法），变性成单链后与变性后的染色体或细胞核靶,DNA,杂交。在荧光显微镜下观察并记录结果。,FISH,优点：,可用来作基因或特定,DNA,片段的染色体区,域定位。,缺点：,必须在已知探针的情况下方可进行。,165）荧光原位杂交（florescence in sit,17,单色,FISH,17单色FISH,18,多色,FISH,18 多色FISH,19,3.,连锁分析（,Linkage analysis,）,1,）概念：,基因定位的连锁分析是根据基因在染色体上呈直线排列，不同基因相互连锁成连锁群的原理，即应用被定位的基因与同一染色体上另一基因或遗传标记相连锁的特点进行定位。,193.连锁分析（Linkage analysis）1）概念,20,2,）,重组值（,recombination fraction,）,是基因定位时两个基因间遗传图距的量度，即基因间的遗传距离。如果两个基因间有,1%,的重组值，其遗传图的距离为,1,厘摩。（,centimorgan,，,cM,）,3,）,遗传标记（,genetic marker,）,用连锁分析发法进行基因定位需要已知的记忆内作为遗传标记，这些标记按孟德尔方式遗传，标记位点应是多态的。,202）重组值（recombination fraction,21,21,22,致病基因和标记座的连锁,22致病基因和标记座的连锁,23,遗传多态性：,是指在一个遗传座位上具有一个以上的等位基因，且各个等位基因在群体中出现的频率皆高于,1%,。,常用的遗传标记：,ABO,血型,蛋白多态,血清蛋白泳动学改变,HLA,RFLP,小卫星,DNA,：,VNTR 6-12,个核苷酸,DNA,多态,VNTR,微卫星,DNA,：,STR2-6,个的,VNTR,SNPs,23遗传多态性：是指在一个遗传座位上具有一个以上的等位基因，,24,二、基因克隆,致病基因克隆有两种基本策略,功能克隆,定位克隆,1,、功能克隆,(functional cloning),是利用疾病已知的遗传损伤而引起的生化功能如蛋白质氨基酸缺陷的信息,进行基因定位,进而克隆该基因,.,24 二、基因克隆,25,2,、定位克隆,(positional cloning),是先进行基因定位作图,然后找到来自该定位区的基因并进行克隆,在此之后才能明确该基因的功能,.,功能克隆和定位克隆的比较,:,在传统的功能克隆中,基因功能的研究先于基因鉴定,.,在定位克隆中,基因定位在先,最后再鉴定基因,.,基因已鉴定后,可以进行基因功能的选择性研究,.,25 2、定位克隆(positional clonin,26,26,27,定位克隆鉴定的第一批基因利用了特定基因座的染色体畸变，,Duchenne,肌营养不良,(DMD),基因的克隆是一个重要的例子。,27,28,假肥大型肌营养不良症,(DMD/BMD),由于抗肌萎缩蛋白,(dystrophin),遗传性缺陷所致的进行性肌萎缩的致死性神经肌肉性遗传病,发病率为,1/3500,，,XR,遗传,。,主要症状,:,通常,3-5,岁发病,开始走路不稳,鸭型步态,上楼梯困难,Gower,征阳性,.,进行性肌萎缩伴有腓肠肌假性肥大,10,多岁下肢瘫,一般在,20,多岁之前死于心衰或呼吸衰竭,.,28假肥大型肌营养不良症(DMD/BMD)由于抗肌,29,DMD,基因克隆的方法,研究者们通过对几个女性患者的细胞遗传学研究发现每个病例受累的常染色体不同但在,X,染色体上的断裂点总是,p21,。,同时一个无任何遗传缺陷家族史的男孩被发现患有,DMD,等,4,种,X,连锁隐性遗传病，在这个独一无二个体的引发下，经过仔细的遗传学研究，最终发现了,Xp21.1,的微小缺失。,29DMD基因克隆的方法 研究者们通过对几个女性患者,30,DMD,女性患者的核型,30DMD女性患者的核型,31,X,染色体与常染色体易位时,X,染色体失活的结果,31X染色体与常染色体易位时X染色体失活的结果,32,两个研究小组分别采用两种不同的方法克隆了,DMD,基因：,一组是通过,X,常染色体易位，克隆了该基因的一部分。,另一研究组使用有,Xp21.1,微小缺失的男孩的,DNA,，利用消减技术，获得了在正常,X,染色体存在而在这个男孩,DNA,中缺乏的,DNA,克隆片段。,32两个研究小组分别采用两种不同的方法克隆了DMD基因：,33,一名患有,DMD,等,4,种,X,连锁隐性遗传病的男孩存在,Xp21.2,的微小臂内缺失,33一名患有DMD等4种X连锁隐性遗传病的男孩存在Xp21.,34,多重,PCR,筛查抗肌萎缩蛋白基因缺失,34多重PCR筛查抗肌萎缩蛋白基因缺失,