第四章紫外可见吸光光度法详解课件

第四章紫外第四章紫外-可见吸可见吸收光谱法收光谱法(Ultraviolet and Visible molecular absorption spectrometry,UV-Vis)4.1概述概述4.2基本原理基本原理 4.3紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计4.4分析条件的选择分析条件的选择4.5定性和定量分析方法定性和定量分析方法1.掌握分光光度法基本原理掌握分光光度法基本原理Lambert-Beer定律，能熟练运用定律，能熟练运用Lambert-Beer公式进行有公式进行有关计算。关计算。2.掌握吸光度、透光率、吸光系数、摩尔吸掌握吸光度、透光率、吸光系数、摩尔吸 光系数的概念。光系数的概念。3.熟悉标准曲线法及标准对照法。熟悉标准曲线法及标准对照法。4.了解物质对光的选择性吸收及吸收光谱。了解物质对光的选择性吸收及吸收光谱。5.了解分光光度计的基本构造；提高测量灵了解分光光度计的基本构造；提高测量灵敏度和准确度的方法。敏度和准确度的方法。本章教学要求本章教学要求 4.1紫外可见分光光度法概述紫外可见分光光度法概述4.1.1电磁辐射与电磁波谱电磁辐射与电磁波谱光子的能量与辐射频率成正比、与波长成反比：光子的能量与辐射频率成正比、与波长成反比：光是一种电磁辐射，它是以巨大速度通过空间传光是一种电磁辐射，它是以巨大速度通过空间传播的光量子流。辐射是量子化的，即不连续地、一份播的光量子流。辐射是量子化的，即不连续地、一份一份地发射或吸收，每一份称一个光子，具有波粒二一份地发射或吸收，每一份称一个光子，具有波粒二象性。象性。电磁辐射按波长顺序排列称为电磁辐射按波长顺序排列称为电磁波谱电磁波谱。4.1紫外可见分光光度法概述紫外可见分光光度法概述4.1紫外可见分光光度法概述紫外可见分光光度法概述4.1紫外可见分光光度法概述紫外可见分光光度法概述 光谱分析法光谱分析法是利用物质与辐射能作用时所吸收或发射辐射的特征和强度而建立是利用物质与辐射能作用时所吸收或发射辐射的特征和强度而建立起来的定性、定量及结构分析方法。起来的定性、定量及结构分析方法。4.1.2光谱分析法光谱分析法4.1紫外可见分光光度法概述紫外可见分光光度法概述4.2紫外紫外-可见吸收光谱法基本原理可见吸收光谱法基本原理4.2.1紫外紫外-可见吸收光谱的形成可见吸收光谱的形成4.2.1.1分子对电磁辐射的选择性吸收分子对电磁辐射的选择性吸收当辐射通过固体、液体或气体等透明介质分子时，物当辐射通过固体、液体或气体等透明介质分子时，物质的分子质的分子 选择性地吸收辐射，产生紫外选择性地吸收辐射，产生紫外-可见吸收光可见吸收光谱，属于分子吸收光谱。谱，属于分子吸收光谱。物质分子内部有三种运动：电子绕原子核的转动、物质分子内部有三种运动：电子绕原子核的转动、原子在其平衡位置的振动及分子作为整体绕重心的转原子在其平衡位置的振动及分子作为整体绕重心的转动，分别对应三种能级：动，分别对应三种能级：电子能级、振动能级、转动电子能级、振动能级、转动能级能级，这些能级都是量子化的，即不是连续的。，这些能级都是量子化的，即不是连续的。4.2紫外紫外-可见吸收光谱法基本原理可见吸收光谱法基本原理 分子吸收光能后，受激发态将能量较低的能级跃迁到能量较分子吸收光能后，受激发态将能量较低的能级跃迁到能量较高的能级。分子吸收能量具有量子化特征，即高的能级。分子吸收能量具有量子化特征，即 只能选择吸收等只能选择吸收等于两个能极差的能量：于两个能极差的能量：E=E1-E2=h（1）转动能能级间的能量差最小：的能量差最小：0.0050.050eV（对应波波长 25025 m），位于位于远红外区。外区。转动光光谱或或远红外光外光谱。（2）振）振动能能级的能量差的能量差约为：0.05eV（对应波波长 251.25 m），位于中位于中红外区，振外区，振动光光谱，由于振，由于振动能能级跃迁迁时伴伴随着随着转动能能级的的跃迁，迁，实际为振振动-转动光光谱，称，称为红外光外光谱。（3）电子能子能级的能量差的能量差较大大120eV（对应波波长 1.250.06 m）。位于紫外位于紫外-可可见光区，分子光区，分子发生生电子能子能级跃迁迁产生紫生紫外外-可可见光光谱或分子的或分子的电子光子光谱。包含。包含电子能子能级跃迁、振迁、振动能能级跃迁、迁、转动能能级跃迁，迁，为带状光状光谱。4.2紫外紫外-可见吸收光谱法基本原理可见吸收光谱法基本原理4.2.1.2 紫外紫外-可见吸收光谱及其特征可见吸收光谱及其特征测定某一溶液对紫外测定某一溶液对紫外-可见光区不同波长（可见光区不同波长（）单色光）单色光的吸光度（的吸光度（A），以波长为横坐标，吸光度为纵坐标），以波长为横坐标，吸光度为纵坐标绘制的图形称为绘制的图形称为紫外紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱，又称为，又称为分子吸收分子吸收光谱图，光谱图，简称为吸收光谱或吸收曲线。简称为吸收光谱或吸收曲线。A423211 max sh min (nm)吸收光谱示意图吸收光谱示意图1.吸收峰吸收峰 2.谷谷 3.肩峰肩峰 4.末端吸收末端吸收吸收曲线特征：吸收曲线特征：曲线上凸起的部分称为曲线上凸起的部分称为吸收峰吸收峰（absorption peak），其中最大吸），其中最大吸收峰所对应的波长称为收峰所对应的波长称为最大吸收波最大吸收波长（长（max），），凹陷部分称为凹陷部分称为谷谷，吸，吸收峰旁有时有一个小的曲折，称为收峰旁有时有一个小的曲折，称为肩峰肩峰；在短波长端有时呈现出强吸；在短波长端有时呈现出强吸收而不成峰形的部分，为收而不成峰形的部分，为末端吸收。末端吸收。4.2紫外紫外-可见吸收光谱法基本原理可见吸收光谱法基本原理4.2.2紫外紫外-可见吸收光谱与分子结构的关系可见吸收光谱与分子结构的关系4.2.2.1有机化合物的电子跃迁类型有机化合物的电子跃迁类型有机化合物的紫外有机化合物的紫外可可见吸收光吸收光谱，是其分子中外，是其分子中外层价价电子子跃迁的迁的结果（三种）：果（三种）：电子、子、电子、子、n电子子。分子分子轨道理道理论：一个成：一个成键轨道必定有一个相道必定有一个相应的反的反键轨道。通常外道。通常外层电子均子均处于分于分子子轨道的基道的基态，即成，即成键轨道道或非或非键轨道上。道上。当外当外层电子吸收紫外或可子吸收紫外或可见辐射后，就从基射后，就从基态向激向激发态(反反键轨道道)跃迁。主要有四种迁。主要有四种跃迁所需能量迁所需能量大小大小顺序序为：n n 4.2紫外紫外-可见吸收光谱法基本原理可见吸收光谱法基本原理（1）跃迁迁 所需能量最大，所吸收的所需能量最大，所吸收的辐射波射波长一般小于一般小于150nm，位于，位于远紫外区。紫外区。饱和和烷烃的分子吸收光的分子吸收光谱出出现在在远紫外区紫外区(吸收吸收波波长 200nm，只能被真空紫外分光光度只能被真空紫外分光光度计检测到到)。如甲。如甲烷的的max为125nm,乙乙烷max为135nm。含有非成含有非成键n电子的子的杂原子（如原子（如-OH、-NH2、-X等）的等）的饱和和烃类衍生物衍生物发生的生的跃迁。吸收波迁。吸收波长为150250nm，大部分在大部分在远紫外区，近紫外区仍不易紫外区，近紫外区仍不易观察到。如一察到。如一氯甲甲烷、甲醇、三甲基、甲醇、三甲基胺胺n*跃迁的迁的max分分别为173nm、183nm和和227nm。（2）n跃迁迁4.2紫外紫外-可见吸收光谱法基本原理可见吸收光谱法基本原理（3）跃迁迁 不饱和碳氢化合物分子不饱和碳氢化合物分子（C=C、C C）中含有中含有键电子，键电子，键电子易被激发，键电子易被激发，*跃迁所需跃迁所需的能量低，低于的能量低，低于*跃迁，随着，跃迁，随着，共轭程度的共轭程度的增大而减小，增大而减小，max长移，吸收程度增强。吸收峰一般长移，吸收程度增强。吸收峰一般处于近紫外光区，在处于近紫外光区，在200nm左右，其特征是摩尔吸光左右，其特征是摩尔吸光系数大，一般系数大，一般 max 104，为强吸收带。如乙烯（蒸气），为强吸收带。如乙烯（蒸气）的最大吸收波长的最大吸收波长 max为为162 nm。4.2紫外紫外-可见吸收光谱法基本原理可见吸收光谱法基本原理 含有含有杂原子不原子不饱和基和基团（-CH=O、-N=N-、-N=O、-CN、-NO2等）的有机化合物分子中，等）的有机化合物分子中，杂原子上未成原子上未成键的的n电子易被激子易被激发，跃迁到分子的迁到分子的*轨道上，道上，n*跃迁所迁所需的能量低于需的能量低于*跃迁所需的能量，吸收峰在近紫外区迁所需的能量，吸收峰在近紫外区和可和可见区（区（180nm700 nm）。例如，丙）。例如，丙酮的的*吸收吸收峰在峰在188nm，n*吸收峰在吸收峰在279nm。（4）n跃迁迁 这类跃迁迁发生在近紫外光区。它是生在近紫外光区。它是简单的生色的生色团如如羰基、硝基等中的孤基、硝基等中的孤对电子向反子向反键轨道道跃迁。其特点是迁。其特点是谱带强强度弱，摩度弱，摩尔尔吸光系数小，吸光系数小，max通常小于通常小于100，属于，属于禁阻禁阻跃迁。迁。4.2紫外紫外-可见吸收光谱法基本原理可见吸收光谱法基本原理4.2紫外紫外-可见吸收光谱法基本原理可见吸收光谱法基本原理常用光谱术语常用光谱术语一、生色团（一、生色团（Chromogenesis group）有机化合物分子中含有非键或有机化合物分子中含有非键或 键的电子体系，键的电子体系，能吸收外来辐射时并引起能吸收外来辐射时并引起n-*和和-*跃迁跃迁，可产，可产生此类跃迁或吸收的结构单元，称为生此类跃迁或吸收的结构单元，称为生色团生色团。是。是一些具有不饱和健和含有孤对电子的基团。一些具有不饱和健和含有孤对电子的基团。如如C=C、C C、CH=O、N=N、N=O、CN、NO2等等4.2紫外紫外-可见吸收光谱法基本原理可见吸收光谱法基本原理下面为某些常见生色团的吸收光谱。下面为某些常见生色团的吸收光谱。4.2紫外紫外-可见吸收光谱法基本原理可见吸收光谱法基本原理二、助色团二、助色团（Auxochromous group）|含有含有孤对电子孤对电子，可使生色团吸收峰向长波方向移动，可使生色团吸收峰向长波方向移动并提高吸收强度的一些官能团，称之为并提高吸收强度的一些官能团，称之为助色团助色团。|助色团助色团是指带有是指带有非键非键电子对的基团，如电子对的基团，如-OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等等，它们本身不能吸，它们本身不能吸收大于收大于200nm的光，但是当它们的光，但是当它们与生色团相连时，与生色团相连时，会使生色团的吸收峰向长波方向移动，并且增加其会使生色团的吸收峰向长波方向移动，并且增加其吸光度。吸光度。4.2紫外紫外-可见吸收光谱法基本原理可见吸收光谱法基本原理三、红移或蓝移（三、红移或蓝移（Redshift or blueshift）1、红移、红移:某些有机化合物经取代反应引入含有未共享电子对某些有机化合物经取代反应引入含有未共享电子对的基团的基团（-OH、-OR、-NH2、-SH、-Cl、-Br、-SR、-NR2）之后，吸收峰的波长将向长波方向移动，这种效应称为）之后，吸收峰的波长将向长波方向移动，这种效应称为红移红移效应效应。这种会使某化合物的最大吸收波长向长波方向移动的基这种会使某化合物的最大吸收波长向长波方向移动的基团称为团称为向红基团向红基团。在分子中引入的一些基团或受到其它外界因素影响，吸收峰在分子中引入的一些基团或受到其它外界因素影响，吸收峰向向长波方向（红移）或短波方向移动（蓝移）长波方向（红移）或短波方向移动（蓝移）的现象。的现象。2、蓝移、蓝移:在某些生色团如羰基的碳原子一端引入一些取代基在某些生色团如羰基的碳原子一端引入一些取代基之后，吸收峰的波长会向短波方向移动，这种效应称为之后，吸收峰的波长会向短波方向移动，这种效应称为蓝移蓝移（紫移）效应（紫移）效应。这些会使某化合物的最大吸收波长向短波方。这些会使某化合物的最大吸收波长向短波方向移动的基团（如向移动的基团（如-CH3、-CH2CH3、-OCOCH3）称为）称为向蓝向蓝（紫）基团（紫）基团。4.2紫外紫外-可见吸收光谱法基本原理可见吸收光谱法基本原理4.2.2.1无机化合物的电子跃迁类型无机化合物的电子跃迁类型 （1）电荷迁移荷迁移跃迁迁：金属配合物中金属配合物中电子从配位体子从配位体（电子子给予体）的予体）的轨道道跃迁到中心离子（迁到中心离子（电子接受体）子接受体）的的轨道上的道上的跃迁。迁。（2）配位场）配位场跃迁迁：在配体的配位在配体的配位场作用下，作用下，镧系系和和锕系元素能量相等的系元素能量相等的f轨道或道或过渡金属元素能量相等渡金属元素能量相等的的d轨道分裂成能量不等的道分裂成能量不等的f轨道或道或d轨道，在光能激道，在光能激发下，低能下，低能态f电子或子或d电子子跃迁到高能迁到高能态的的f轨道或者道或者d轨道上的道上的跃迁迁4.2紫外紫外-可见吸收光谱法基本原理可见吸收光谱法基本原理4.2.3.1 Lambert-Beer定律定律4.2.3 光的吸收定律光的吸收定律当一束强度为当一束强度为I0的单色光通过吸光物质的溶液时，设的单色光通过吸光物质的溶液时，设吸收光的强度为吸收光的强度为Ia,透过光的强度为透过光的强度为It，吸收池表面反，吸收池表面反射的强度为射的强度为Ir,参比溶液调零后，参比溶液调零后，Ir=0,透光强度透光强度It与入射光强度与入射光强度I0之比称为透光率（之比称为透光率（T）。）。4.2紫外紫外-可见吸收光谱法基本原理可见吸收光谱法基本原理描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度b的关系的关系描述物质对单色光吸收强弱与待测物浓度的关系描述物质对单色光吸收强弱与待测物浓度的关系 其公式的物理意义如下其公式的物理意义如下：当一束平行单色光垂直通当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时过某一均匀非散射的吸光物质时,其吸光度其吸光度A 与物质的与物质的浓度浓度c 及吸收层厚度及吸收层厚度d的乘积成正比的乘积成正比。4.2紫外紫外-可见吸收光谱法基本原理可见吸收光谱法基本原理讨论：讨论：（1）Lamber-Beer定律的适用条件：入射光为平行单定律的适用条件：入射光为平行单色光且垂直照射，均匀非散射性的稀溶液；色光且垂直照射，均匀非散射性的稀溶液；（2）该定律适用于均匀非散射固体、液体和气体样品；）该定律适用于均匀非散射固体、液体和气体样品；（3）在同一波长下，各组分吸光度具有加和性）在同一波长下，各组分吸光度具有加和性 A=A1+A2+An（4）辐射与物质之间的作用仅限于光吸收过程）辐射与物质之间的作用仅限于光吸收过程,无荧光无荧光和化学现象发生。和化学现象发生。（5）溶液的浓度单位不同时，比例常数）溶液的浓度单位不同时，比例常数K分别用分别用（摩（摩尔吸光系数）和尔吸光系数）和a吸光系数表示。吸光系数表示。4.2紫外紫外-可见吸收光谱法基本原理可见吸收光谱法基本原理摩尔吸光系数摩尔吸光系数：在一定：在一定下，下，c=1mol/L，b=1cm时的吸光度时的吸光度当溶液浓度当溶液浓度c以以mol/L、厚度、厚度b以以cm为单位时，为单位时，K用用 表示表示 吸收物质在一定波长和溶剂条件下的吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数特征常数；不随浓度不随浓度c c和光程长度和光程长度b b的改变而改变的改变而改变。在温度和波长等条件一定时，。在温度和波长等条件一定时，仅与吸收物质本身的性质有关；仅与吸收物质本身的性质有关；可作为可作为定性鉴定的参数定性鉴定的参数；同一吸收物质在不同波长下的同一吸收物质在不同波长下的值是不同的。在最大吸收波长值是不同的。在最大吸收波长maxmax处处的摩尔吸光系数，常以的摩尔吸光系数，常以max表示。表示。maxmax表明了该吸收物质最大限度的吸表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。吸光系数吸光系数a：在一定：在一定下，下，c=1g/L，b=1cm时的吸光度时的吸光度当溶液浓度当溶液浓度c以以g/L、厚度、厚度b以以cm为单位时，为单位时，K用用a表示表示4.2紫外紫外-可见吸收光谱法基本原理可见吸收光谱法基本原理例题：称取例题：称取1.0 mg维生素维生素B12（M=1355g/mol）纯）纯品，配成品，配成25.00 ml的水溶液，吸收池厚度为的水溶液，吸收池厚度为0.5 cm，在，在361 nm波长下，测得吸光度波长下，测得吸光度0.414，计，计算其摩尔吸光系数。算其摩尔吸光系数。4.2紫外紫外-可见吸收光谱法基本原理可见吸收光谱法基本原理l依据依据Beer定律，定律，A与与C关系应为经过原点的关系应为经过原点的直线直线l偏离偏离Beer定律的主要定律的主要因素表现为以下两个因素表现为以下两个方面方面（一）光学因素（一）光学因素（二）化学因素（二）化学因素 4.2.3.2偏离偏离Beer定律的因素定律的因素4.2紫外紫外-可见吸收光谱法基本原理可见吸收光谱法基本原理（1）光学因素）光学因素 非单色光的影响：非单色光的影响：Beer定律应用的重要前提定律应用的重要前提入射光为单色光入射光为单色光 l照射物质的光经单色器分光照射物质的光经单色器分光后并非真正单色光后并非真正单色光l其其波波长长宽宽度度由由入入射射狭狭缝缝的的宽宽度度和和棱棱镜镜或或光光栅栅的的分分辨辨率率决决定定l为为了了保保证证透透过过光光对对检检测测器器的的响响应应，必必须须保保证证一一定定的的狭狭缝缝宽度宽度l这这就就使使分分离离出出来来的的光光具具一一定定的谱带宽度的谱带宽度选择较纯单色光选择较纯单色光选选max作为测定波长作为测定波长4.2紫外紫外-可见吸收光谱法基本原理可见吸收光谱法基本原理杂散光的影响：杂散光的影响：杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远；杂散光来自仪器本身缺陷或内，与所选波长相距较远；杂散光来自仪器本身缺陷或光学元件污染造成；杂散光可使吸收光谱变形，吸光度光学元件污染造成；杂散光可使吸收光谱变形，吸光度变值。变值。4.2紫外紫外-可见吸收光谱法基本原理可见吸收光谱法基本原理 Lamber-Beer的假定：的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用所有的吸光质点之间不发生相互作用；假定只有在稀溶液假定只有在稀溶液(c10 2 mol/L 时，吸光质点间可能发生缔合等相时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。互作用，直接影响了对光的吸收。故：故：Lamber-Beer定律只适用于稀溶液定律只适用于稀溶液 （2）溶液的物理及化学因素的影响）溶液的物理及化学因素的影响 溶液中存在着离解、聚合、互溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平异构、配合物的形成等化学平衡衡时，使吸光，使吸光质点的点的浓度度发生生变化，影响吸光度。化，影响吸光度。例：例：铬酸酸盐或重或重铬酸酸盐溶液中存在下列平衡：溶液中存在下列平衡：Cr42-2H=Cr272-H2 溶液中溶液中Cr42-、Cr272-的的颜色不同，吸光性色不同，吸光性质也不相同。故：也不相同。故：此此时溶液溶液pH 对测定有重要影响。定有重要影响。4.2紫外紫外-可见吸收光谱法基本原理可见吸收光谱法基本原理4.3紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计紫外紫外-可见光度计仪器由可见光度计仪器由光源、单色器、光源、单色器、吸收池、检测器吸收池、检测器及及显示器显示器五部分组成。五部分组成。光光源源单单色色器器吸吸收收池池检检测测器器显显示示器器分光光度计结构方框示意图分光光度计结构方框示意图4.3紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计（1）氢灯和氘灯：）氢灯和氘灯：能发射能发射150nm400nm连续光谱连续光谱，使用范围使用范围200nm-360nm。氘灯发光强度比氢灯约大。氘灯发光强度比氢灯约大4-5倍。氢灯或氘灯的发射谱线谱线有几根原子谱线，倍。氢灯或氘灯的发射谱线谱线有几根原子谱线，可作为波长校准用。常用的有可作为波长校准用。常用的有486.13nm(F线线)和和666.28nm(C线线)4.3.1.1光源光源 对光源基本要求：足够光强、稳定、连续辐射且强对光源基本要求：足够光强、稳定、连续辐射且强度随波长变化小。度随波长变化小。4.3.1分光光度计的主要部件分光光度计的主要部件4.3紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计（2）钨及卤钨灯：）钨及卤钨灯：能发射能发射340nm2500 nm连续光谱连续光谱，适合波长适合波长350nm1000nm;钨灯发光强度与供电电钨灯发光强度与供电电压的压的34次方成正比，所以供电电压要温稳定；次方成正比，所以供电电压要温稳定；（3）激光光源）激光光源：近年也有用氩离子激光器或可调谐近年也有用氩离子激光器或可调谐染料激光器发射的激光作光源，这种激光光源单色染料激光器发射的激光作光源，这种激光光源单色性好，光强度大，稳定性好。性好，光强度大，稳定性好。4.3紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计4.3.1.2单色器单色器(Monochromator)单色器是能从光源辐射的复合光中分出单色光的光单色器是能从光源辐射的复合光中分出单色光的光学装置。学装置。其主要功能：产生光谱纯度高的波长且波长在紫外其主要功能：产生光谱纯度高的波长且波长在紫外可见区域内任意可调。可见区域内任意可调。v单色器入射狭缝、出射狭缝、准直镜、色散元件、单色器入射狭缝、出射狭缝、准直镜、色散元件、聚焦元件等组成。聚焦元件等组成。v 能起分光作用的色散元件主要是棱镜和光栅能起分光作用的色散元件主要是棱镜和光栅。4.3紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计（1）棱镜：）棱镜：棱镜的色散作用是根据棱镜材料对不同棱镜的色散作用是根据棱镜材料对不同波长的光有不同的折射率。棱镜的材料有光学玻璃和波长的光有不同的折射率。棱镜的材料有光学玻璃和石英二类。玻璃对可见光的色散比石英好，但不能透石英二类。玻璃对可见光的色散比石英好，但不能透过紫外光。石英材料对紫外光有很好的色散作用，但过紫外光。石英材料对紫外光有很好的色散作用，但在可见光区不如玻璃。棱镜的色散率随波长而变在可见光区不如玻璃。棱镜的色散率随波长而变（非非线性色散线性色散），），短波长区疏，长波长区密。短波长区疏，长波长区密。（2）光栅：）光栅：光栅光栅（在高度抛光的表面上每毫米刻有在高度抛光的表面上每毫米刻有600-1200条等宽、等间距的平行条痕条等宽、等间距的平行条痕）是通过衍射和是通过衍射和干涉作用，使不同波长的光有不同方向而起到色散作干涉作用，使不同波长的光有不同方向而起到色散作用的它具有波长范围宽，色散近似线性、谱线间距相用的它具有波长范围宽，色散近似线性、谱线间距相等、高分辨率等优点。等、高分辨率等优点。4.3紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计 为减小测量误差，（为减小测量误差，（1）吸收池的光学面必须完全垂）吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向。（直于光束方向。（2）盛放参比溶液和样品溶液的一组）盛放参比溶液和样品溶液的一组吸收池要挑选配对（透光率之差应小于吸收池要挑选配对（透光率之差应小于0.5%)。即有相即有相同的厚度和透光性能。另外盛放溶液的吸收池不能倒同的厚度和透光性能。另外盛放溶液的吸收池不能倒满，只能倒入其体积的五分之四。满，只能倒入其体积的五分之四。（3）吸收池（）吸收池（Cell，Container）：）：用于盛放空白溶液和样品溶液的器皿。用于盛放空白溶液和样品溶液的器皿。石英：石英：适于紫外区和可见光区适于紫外区和可见光区玻璃：玻璃：只适于可见光区只适于可见光区有些有些透明有机玻璃透明有机玻璃亦可用作吸收池。亦可用作吸收池。4.3紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计 光电管（真空光电二极管）：光电管（真空光电二极管）：在紫外在紫外-可见分光光度可见分光光度计上应用较为广泛。计上应用较为广泛。光电倍增管：光电倍增管：是检测微弱光最常用的光电元件，它的是检测微弱光最常用的光电元件，它的灵敏度比一般的光电管要高灵敏度比一般的光电管要高200倍，因此可使用较窄的倍，因此可使用较窄的单色器狭缝，从而对光谱的精细结构有较好的分辨能力。单色器狭缝，从而对光谱的精细结构有较好的分辨能力。（4）检测器）检测器 检测器的功能是检测信号、测量单色光透过溶液后光检测器的功能是检测信号、测量单色光透过溶液后光强度变化的一种装置。常用的检测器有强度变化的一种装置。常用的检测器有光电管和光电倍光电管和光电倍增管等。增管等。4.3紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计真空光电管真空光电管直流放大直流放大阴极阴极R-+光束光束e阳极丝（阳极丝（Ni）抽真空抽真空90V（直流电源）（直流电源）4.3紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计优点：优点：阻抗大，电流易放大；响应快；应用广。阻抗大，电流易放大；响应快；应用广。缺点：缺点：有微小暗电流（有微小暗电流（40K的放射线激发）。的放射线激发）。阴极表面可涂渍不同光敏物质：阴极表面可涂渍不同光敏物质：紫敏光电管，紫敏光电管，适合于适合于200nm-625nm波长的光波长的光(K/Cs阴极阴极)、红红敏光电管，敏光电管，适合于适合于625nm-1000nm波长的光波长的光(Ag/Cs2O，阴极，阴极)。4.3紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计光电倍增管光电倍增管R1RR2R3R4R5光光mA负电压负电压光光敏敏阴阴极极阳阳极极电子倍增极电子倍增极电子倍电子倍 增极增极优点：优点：高灵敏度；响应快；适于弱光测定，甚至对单高灵敏度；响应快；适于弱光测定，甚至对单一光子均可响应。一光子均可响应。缺点：缺点：热发射强，因此暗电流大。热发射强，因此暗电流大。4.3紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计（5）显示器（信号指示系统）显示器（信号指示系统）光电管输出的信号很弱，需经过放大才能以某种光电管输出的信号很弱，需经过放大才能以某种方式将测定结果显示出来。常用的显示方式有数字方式将测定结果显示出来。常用的显示方式有数字显示、荧光屏显示和曲线扫描显示及结果打印等。显示、荧光屏显示和曲线扫描显示及结果打印等。4.3紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计4.3.2分光光度计的类型分光光度计的类型一、单波长单光束分光光度计一、单波长单光束分光光度计 光源光源单色器单色器样品池样品池参比池参比池检测器检测器4.3紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计优点：优点：结构简单、价格低廉结构简单、价格低廉缺点：缺点：受光源、检测器的波动影响：不能自动记录受光源、检测器的波动影响：不能自动记录吸收光谱。吸收光谱。单色器单色器调制马达调制马达检测器检测器样品吸收池样品吸收池参比吸收池参比吸收池光源光源二、二、二、二、单波长双光束分光光度计单波长双光束分光光度计4.3紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计优点：点：能自能自动记录吸收光吸收光谱（自（自动扫描）；比切光器描）；比切光器的的频率慢的光源、率慢的光源、检测器的波器的波动不影响；是目前不影响；是目前用得最多的分光光度用得最多的分光光度计 经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，一束通过参比池，一束通过样品池。光度计能自动比一束通过参比池，一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。4.3紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计结论：光强度瞬间波动不影响吸光度值结论：光强度瞬间波动不影响吸光度值三、双波长分光光度计三、双波长分光光度计 通过切光器使两束不同波长的光交替通过吸收池，通过切光器使两束不同波长的光交替通过吸收池，测得吸光度差测得吸光度差 A。光源光源检测器检测器单色器单色器单色器单色器切光器切光器吸收池吸收池12124.3紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计 这这表表明明，试试样样溶溶液液浓浓度度与与两两个个波波长长处处的的吸吸光光度度之之差差成正比。成正比。AB1和和 AB2分分别别为为在在 1和和 2处处的的背背景景吸吸收收，当当 1和和 2 相近时，背景吸收近似相等。二式相减，得相近时，背景吸收近似相等。二式相减，得4.3紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计优点点:可以可以测定定较高高浓度的度的样品溶液；品溶液；可以扣除背景吸收（可以扣除背景吸收（样品池、品池、浑浊等）；等）；比切光器的比切光器的频率慢的光源、率慢的光源、检测器的波器的波动不不影响；影响；v当当待待测测组组分分在在紫紫外外可可见见光光区区无无吸吸收收时时，可可通通过过适适当当的的方方式式，将将其其转转化化为为能能吸吸收收可可见见光光的的物物质质，用用可可见分光光度法进行间接测定。见分光光度法进行间接测定。v能能与与无无色色物物质质反反应应生生成成有有色色物物质质的的试试剂剂称称为为显显色色剂剂，生成有色物质的反应称为生成有色物质的反应称为显色反应显色反应，如下所示：，如下所示：显色反应显色反应待测组分待测组分显色剂显色剂有色化合物有色化合物4.4 分析条件的选择分析条件的选择（一一）待待测测组组分分应应定定量量地地转转变变为为有有色色化化合合物物，二二者者有有确确定定的化学计量关系的化学计量关系（二二）有有色色化化合合物物的的组组成成恒恒定定、化化学学性性质质稳稳定定、摩摩尔尔吸吸光光系数较大系数较大max104；（三）有色化合物与显色剂之间的颜色要有明显的差别。（三）有色化合物与显色剂之间的颜色要有明显的差别。（四四）显显色色反反应应有有较较高高的的选选择择性性好好、干干扰扰少少或或者者干干扰扰易易消消除除4.4.1.1显色反应的要求：显色反应的要求：4.4 分析条件的选择分析条件的选择4.4.1显色反应条件的选择显色反应条件的选择4.4.1.2显色条件的选择显色条件的选择图图 吸光度与显色剂加入量的关系吸光度与显色剂加入量的关系（一）（一）显色色剂用量用量 显色色剂的用量的用量应适当适当过量量并且并且定量定量。显色色剂最佳用最佳用量一般通量一般通过实验确定。确定。绘制吸光度制吸光度显色色剂用量曲用量曲线（AV），在曲），在曲线的平直部分所的平直部分所对应的的显色色剂用用量量V（ml）范）范围内内选择一确定一确定浓度即可。度即可。4.4 分析条件的选择分析条件的选择（1）酸度对显色剂颜色的影响：）酸度对显色剂颜色的影响：显色剂本身具有酸碱指显色剂本身具有酸碱指示剂的性质，在不同的酸度下具有不同的颜色示剂的性质，在不同的酸度下具有不同的颜色。（2）酸度对显色反应的影响）酸度对显色反应的影响（有机显色剂本身多数是（有机显色剂本身多数是弱酸或弱碱，在水溶液离解）弱酸或弱碱，在水溶液离解）（二）溶液的酸度（二）溶液的酸度4.4 分析条件的选择分析条件的选择MRM+（3）对金属离子存在状态的影响：）对金属离子存在状态的影响：pH下下,许多高价金许多高价金属离子发生水解生成氢氧化物沉淀。如属离子发生水解生成氢氧化物沉淀。如Fe3+、Al3+、Bi3+）大多数显色反应都可在室温下进行，温度的变化对大多数显色反应都可在室温下进行，温度的变化对测定的结果影响不大。但有些显色反应速度慢，需加测定的结果影响不大。但有些显色反应速度慢，需加热才能迅速完成，而有些反应产物在加热条件下会发热才能迅速完成，而有些反应产物在加热条件下会发生分解。因此，对需加热完成的显色反应，应通过绘生分解。因此，对需加热完成的显色反应，应通过绘制制At（）曲线来选择适宜的显色反应温度。）曲线来选择适宜的显色反应温度。（三）显色温度的选择（三）显色温度的选择（四）（四）显色色时间的的选择 适宜适宜测定定时间的确定，是在加入的确定，是在加入显色色剂后，于不后，于不同同时间t测定吸光度定吸光度A，绘制制At（min）曲）曲线，曲，曲线的平直部分所的平直部分所对应的的t范范围就是适宜的就是适宜的测定定时间范范围，此此时测定溶液的吸光度有良好的重定溶液的吸光度有良好的重现性。性。4.4 分析条件的选择分析条件的选择(五五)共存离子的影响及消除共存离子的影响及消除 共存物质本身有颜色干扰测定；与显色剂发生反应共存物质本身有颜色干扰测定；与显色剂发生反应干扰测定；被测组分发生反应使被测组分浓度改变等。干扰测定；被测组分发生反应使被测组分浓度改变等。（1）加入掩蔽剂：）加入掩蔽剂：选择掩蔽剂的原则是：掩蔽剂不与选择掩蔽剂的原则是：掩蔽剂不与待测组分反应；掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应待测组分反应；掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分的测定。产物不干扰待测组分的测定。例：测定例：测定Ti4，可加入，可加入H3PO4掩蔽剂使掩蔽剂使Fe3+(黄色黄色)成为成为Fe(PO)23-(无色无色)，消除，消除Fe3+的干扰；的干扰；如果以上方法都不能消除干扰时，则需如果以上方法都不能消除干扰时，则需要进行分离。要进行分离。4.4 分析条件的选择分析条件的选择（2）加入氧化剂或还原剂改变其价态：）加入氧化剂或还原剂改变其价态：如用铬天菁如用铬天菁S光光度法测定度法测定Al3+时，加入抗坏血酸作掩蔽剂将时，加入抗坏血酸作掩蔽剂将Fe3+还原为还原为Fe2+，消除，消除Fe3+的干扰。的干扰。（3）选择适宜的显色条件：）选择适宜的显色条件：控制溶液的酸度，使干扰离控制溶液的酸度，使干扰离子不与显色剂反应而消除干扰。如子不与显色剂反应而消除干扰。如:用磺基水杨酸测定用磺基水杨酸测定Fe3+时，时，Cu2+与试剂生成黄色配合物干扰测定，控制与试剂生成黄色配合物干扰测定，控制pH 在在2.5左右。左右。（4）分离干扰离子：）分离干扰离子：采用沉淀、离子交换或溶剂萃取等采用沉淀、离子交换或溶剂萃取等分离干扰离子分离干扰离子4.4 分析条件的选择分析条件的选择4.4.2测量条件的选择测量条件的选择4.4.2.1测量波长的选择：测量波长的选择：通常，选通常，选max作为分析波长，作为分析波长，灵敏度高，而且在灵敏度高，而且在max附近吸光度随波长变化小，测定附近吸光度随波长变化小，测定误差也小。误差也小。当最大吸收波长处有干扰或最强吸收峰的峰形尖锐当最大吸收波长处有干扰或最强吸收峰的峰形尖锐时，为减少谱带宽度对测定的影响、消除干扰，常选时，为减少谱带宽度对测定的影响、消除干扰，常选用吸收峰稍低、峰形较平坦的次强峰或肩峰的波长进用吸收峰稍低、峰形较平坦的次强峰或肩峰的波长进行测定，以减小对比尔定律的偏离。根据行测定，以减小对比尔定律的偏离。根据“吸收大，吸收大，干扰小干扰小”的原则来选择分析波长。的原则来选择分析波长。4.4 分析条件的选择分析条件的选择4.4.2.2吸光度读数范围的选择吸光度读数范围的选择 仪仪器器的的透透光光率率测测量量误误差差（T）:来来源源于于仪仪器器的的噪噪声声，它它取取决决于于仪仪器器的的精精度度，不不同同精精度度的的分分光光光光度度计计有有不不同的同的T（1%0.01%）。）。分析结果的相对误差（分析结果的相对误差（C/C）由于透光率与样品由于透光率与样品浓度的非线性关系浓度的非线性关系lgT=abc（对数关系），因而在不（对数关系），因而在不同的透光率范围，这一恒定误差所引起的分析结果的同的透光率范围，这一恒定误差所引起的分析结果的相对误差相对误差（C/C）是不同的。由于光源不稳定性、是不同的。由于光源不稳定性、读数不准等带来的误差。当分析高浓度的样品时，误读数不准等带来的误差。当分析高浓度的样品时，误差更大。差更大。4.4 分析条件的选择分析条件的选择 分析结果相对误差与透光率测量误差可由朗伯分析结果相对误差与透光率测量误差可由朗伯比尔定律导出：比尔定律导出：对上式微分，得待测溶液分析结果的相对误差对上式微分，得待测溶液分析结果的相对误差（C/C）与透光率测量误差）与透光率测量误差T 的关系为：的关系为：4.4 分析条件的选择分析条件的选择 透光率透光率T的刻度是均匀的，的刻度是均匀的，T(绝对误差绝对误差)与与T本身大小本身大小无关，对于一台仪器，无关，对于一台仪器，T是常数，一般在是常数，一般在0.0020.01之间。之间。T确定时，确定时，C/C是是T的函数。的函数。4.4 分析条件的选择分析条件的选择v当透光率当透光率T在在65%20%（A=0.200.70）的的范围内，测定结果的相对范围内，测定结果的相对误差（误差（C/C）较小，）较小，v透光率透光率T为为36.8%（吸光吸光度度A为为0.434）时，测定结）时，测定结果的果的相对误差最小。相对误差最小。图图 测测定定结结果果相相对对误误差差与与透透光光率（吸光度）的关系率（吸光度）的关系4.4 分析条件的选择分析条件的选择4.4.2.3 参比溶液的选择参比溶液的选择 其作用是消除干扰其作用是消除干扰:不仅能抵消吸收池和溶剂对入射光不仅能抵消吸收池和溶剂对入射光的影响，还可以抵消溶液中其它共存组分（包括显色剂、的影响，还可以抵消溶液中其它共存组分（包括显色剂、基体成分、辅助试剂等）在测定波长处产生吸收所引起基体成分、辅助试剂等）在测定波长处产生吸收所引起的干扰。所以，分析中应视样品溶液的性质选择合适的的干扰。所以，分析中应视样品溶液的性质选择合适的参比溶液。参比溶液。测量样品溶液的吸光度之前，需用参比溶液测量样品溶液的吸光度之前，需用参比溶液（reference solution）或称）或称空白溶液空白溶液（blank solution）调节吸光度零点调节吸光度零点A0（T100），），4.4 分析条件的选择分析条件的选择(一一)溶溶剂剂参参比比:当当样样品品溶溶液液中中只只有有待待测测物物质质在在测测定定波波长长下下有有吸吸收收，其其它它共共存存物物质质均均无无吸吸收收时时，采采用用溶溶剂剂（通通常为蒸馏水）作为参比溶液。常为蒸馏水）作为参比溶液。（二二）试试剂剂参参比比:当当显显色色剂剂或或其其它它试试剂剂在在测测定定波波长长处处有有吸吸收收时时，采采用用试试剂剂作作参参比比（不不加加待待测测物物），相相当当于于标标准准曲曲线系列的零（线系列的零（0）管；许多显色反应需采用试剂参比。）管；许多显色反应需采用试剂参比。（三）试样参比（三）试样参比v如如试试样样基基体体在在测测定定波波长长处处有有吸吸收收，但但不不与与显显色色剂剂反反应应时，可以试样作参比时，可以试样作参比（不能加显色剂）（不能加显色剂）v如用硫氰酸盐为显色剂测钼时，取不加硫氰酸盐的样如用硫氰酸盐为显色剂测钼时，取不加硫氰酸盐的样品溶液作参比，可消除共存品溶液作参比，可消除共存Cr3+、Ni2+、Cu2+等有色离等有色离子的干扰。子的干扰。4.4 分析条件的选择分析条件的选择（四）平行操作参比（四）平行操作参比v用不含待测组分的样品，按照与样品测定相同的条用不含待测组分的样品，按照与样品测定相同的条件与样品平行操作，以此为参比溶液进行测定，称件与样品平行操作，以此为参比溶液进行测定，称为平行操作参比。为平行操作参比。v例如在临床检验中，正常人的血液、尿液等不含待例如在临床检验中，正常人的血液、尿液等不含待测组分的样品按相同的条件平行操作，所得的溶液测组分的样品按相同的条件平行操作，所得的溶液即是平行操作参比。即是平行操作参比。4.4 分析条件的选择分析条件的选择4.5 定性及定量分析定性及定量分析将待测试样和标准品用相同的溶剂配成浓度相近的将待测试样和标准品用相同的溶剂配成浓度相近的溶液，以相同的条件测定并绘制吸收光谱，然后比较两溶液，以相同的条件测定并绘制吸收光谱，然后比较两者的特征者的特征 如如吸收峰数目、最大吸收波长（吸收峰数目、最大吸收波长（max）、最）、最小吸收波长（小吸收波长（min）、肩峰（）、肩峰（sh）、末端吸收、吸收）、末端吸收、吸收峰的形状峰的形状 等。等。4.5.1定性分析定性分析 用紫外可见吸收光谱及特征参数进行定性鉴别时，用紫外可见吸收光谱及特征参数进行定性鉴别时，给出的仅是官能团的信息，有一定的局限性。当两种纯给出的仅是官能团的信息，有一定的局限性。当两种纯化合物的吸收光谱有明显差别时，可以肯定两者不是同化合物的吸收光谱有明显差别时，可以肯定两者不是同一化合物。一化合物。但当两种纯化合物的吸收光谱完全相同时，但当两种纯化合物的吸收光谱完全相同时，只能得出两化合物含有相同的官能团，有可能是同一物只能得出两化合物含有相同的官能团，有可能是同一物质，但不能以此确定是同一物质，必须结合其它的定性质，但不能以此确定是同一物质，必须结合其它的定性手段才能进一步确证。手段才能进一步确证。4.5.2定量分析定量分析4.5.2.1标准曲线法标准曲线法配制一系列（一般配制一系列（一般5个）不同浓度个）不同浓度的标准溶液，在待测物质的的标准溶液，在待测物质的 max下，下，选择合适的参比溶液，在相同条件选择合适的参比溶液，在相同条件下分别测定各标准溶液的吸光度。下分别测定各标准溶液的吸光度。以吸光度以吸光度A为纵坐标，浓度为横坐为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标，绘制Ac曲线曲线，即为标准曲线，即为标准曲线（standard curve），或称工作曲线），或称工作曲线（working cure）。或进行线性回）。或进行线性回归，求出回归方程，绘出回归直线归，求出回归方程，绘出回归直线以代替标准曲线。以代替标准曲线。AccxAx4.5 定性及定量分析定性及定量分析 标准溶液标准溶液（mg/25ml）0.0000.2000.4000.6000.8001.00 吸光度吸光度0.0000.2400.4910.7120.9501.156例题：槐米中芦丁的含量测定，配置每毫升含芦丁对照例题：槐米中芦丁的含量测定，配置每毫升含芦丁对照品品0.200mg的标准样品储备溶液。分别移取的标准样品储备溶液。分别移取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00ml与与25ml容量瓶中，按样品溶容量瓶中，按样品溶液显色的同样方法显色，稀释至刻度，测定各溶液的吸液显色的同样方法显色，稀释至刻度，测定各溶液的吸光度制作标准曲线。并称得光度制作标准曲线。并称得3.00mg样品，在相同条件下样品，在相同条件下测得吸光度为测得吸光度为0.845。求样品中芦丁的含量。求样品中芦丁的含量。4.5 定性及定量分析定性及定量分析解：根据线性回归求得有关参数如下解：根据线性回归求得有关参数如下：a=0.0105，b=1.162，r=0.9997；回归方程为：回归方程为：Y=0.0105+1.162C4.5 定性及定量分析定性及定量分析使用标准曲线回归时需注意：使用标准曲线回归时需注意：1、样品溶液与标准溶液的基体尽可能一致，保、样品溶液与标准溶液的基体尽可能一致，保证它们的可比性；证它们的可比性；2、标准曲线绘制时，至少要有五个点；、标准曲线绘制时，至少要有五个点；3、样品溶液与标准溶液必须在相同条件下（包、样品溶液与标准溶液必须在相同条件下（包括测定步骤、显色条件、仪器设备条件等）测括测定步骤、显色条件、仪器设备条件等）测定其吸光度；定其吸光度；4、标准曲线对仪器的要求不是很高；、标准曲线对仪器的要求不是很高；5、标准曲线法适合批量样品的分析。、标准曲线法适合批量样品的分析。4.5 定性及定量分析定性及定量分析 这种方法比较简便，适合个别样品的测定，但要求这种方法比较简便，适合个别样品的测定，但要求样品溶液与标准溶液的浓度相近，且在标准曲线的线样品溶液与标准溶液的浓度相近，且在标准曲线的线性范围之内，标准曲线经过原点，这样才可获得准确性范围之内，标准曲线经过原点，这样才可获得准确的测定结果。的测定结果。3.5.2.2直接比较法直接比较法 当标准曲线过原点时，可用直接比较法。在相同条当标准曲线过原点时，可用直接比较法。在相同条件下，制备标准溶液和样品溶液，分别测定两者的吸件下，制备标准溶液和样品溶液，分别测定两者的吸光度光度As和和Ax，A=Kc,按下式计算样品溶液中待测组分按下式计算样品溶液中待测组分的浓度的浓度cx。4.5 定性及定量分析定性及定量分析例题：某有色物质例题：某有色物质X，摩尔质量为，摩尔质量为150gmol-1，在，在=450nm处有一吸收峰，浓度为处有一吸收峰，浓度为3.03mg/L的溶液，在的溶液，在2.00cm比色皿中吸光度为比色皿中吸光度为0.842。当用。当用1.00cm比色皿，比色皿，吸光度为吸光度为0.768时，求该时，求该100mL溶液中溶液中X的质量为多少毫的质量为多少毫克？克？解：根据解：根据As=2KCS，AX=KCX4.5 定性及定量分析定性及定量分析4.5.2.3 双波长分光光度法双波长分光光度法图图a)：X,Y 组份最大吸收波长不重迭，相互不干扰，可以按两组份最大吸收波长不重迭，相互不干扰，可以按两个单一组份处理。个单一组份处理。图图b)和和c)：X,Y 相互干扰，此时可通过解联立方程组求得相互干扰，此时可通过解联立方程组求得X和和Y的浓度：的浓度：其中，其中，X,Y 组份在波长组份在波长 1 和和 2 处的摩尔吸光系数处的摩尔吸光系数 可由已知可由已知浓度的浓度的 X,Y 纯溶液测得。解方程组可求得纯溶液测得。解方程组可求得 cx 及及 cy。4.5 定性及定量分析定性及定量分析4.5 定性及定量分析定性及定量分析等吸收双波长测量法等吸收双波长测量法其方法是：先把一种组分的吸收设法消去，测定另一其方法是：先把一种组分的吸收设法消去，测定另一组分的浓度。组分的浓度。测定测定a组分时，选择组分时，选择a组分的最大吸收波长作测定波组分的最大吸收波长作测定波长长 2，由，由A的峰顶的峰顶 2向横坐标作垂线与向横坐标作垂线与b吸收曲线的一吸收曲线的一侧相交，从相交点作横坐标的平行线与侧相交，从相交点作横坐标的平行线与b吸收曲线的吸收曲线的另一侧相交，交点所对应的波长为参比波长另一侧相交，交点所对应的波长为参比波长 1。4.5 定性及定量分析定性及定量分析v测定波长测定波长 2v参比波长参比波长 1 选择两波长应符选择两波长应符合的条件合的条件：（1）干扰组分在）干扰组分在该两波长处的吸该两波长处的吸光度相同光度相同（2）被测组分在）被测组分在该两波长处的吸该两波长处的吸光度差（光度差（A）要足够大要足够大abab图图 等吸收双波长测定法示意图等吸收双波长测定法示意图（1）消去）消去a，测定，测定b （2）消去）消去b，测定，测定a21214.5 定性及定量分析定性及定量分析4.5 定性及定量分析定性及定量分析然后相减然后相减由于由于b组份在两波长组份在两波长处的吸光度相等，处的吸光度相等，v在在 2和和 1处分别测量吸光度处分别测量吸光度4.5 定性及定量分析定性及定量分析 以催化以催化显色反色反应为例例说明催化明催化动力学分光光度法的基力学分光光度法的基本原理。本原理。设一催化一催化显色反色反应为：aA+bBfF+gG若若选择F为指示物指示物质，根据，根据质量作用定律，速率方程量作用定律，速率方程为：3.5.2.4催化催化动力学分光光度法力学分光光度法 催化催化动力学分光光度法力学分光光度法（spectrophotometry by catalytic kinetics)是以催化反是以催化反应为基基础，通，通过测定催化体系中指示物定催化体系中指示物质（反（反应物或物或产物）物）的吸光度的吸光度A来确定待来确定待测组分（催化分（催化剂）的含量的方法。）的含量的方法。该法的灵敏度高、法的灵敏度高、检出限低，是出限低，是动力学分析方法中力学分析方法中应用用最广的一种。最广的一种。4.5 定性及定量分析定性及定量分析 控制控制实验条件，使条件，使CA、CB的量很大，其的量很大，其浓度的改度的改变可以忽略不可以忽略不计，即，即CA、CB常数，与常数，与k合并合并为k则为：产物的吸光度与物的吸光度与Ccat符合符合L