定量检测课件

HBV DNA定量检测 HBVDNA定量检测HBVDNA定量检测1PCR基因的原理一、一、PCR技术的发展及原理技术的发展及原理n n1971年，年，Kleppe等人首次在文章中准确、等人首次在文章中准确、客观地阐述了客观地阐述了PCR方法。方法。n n1985年，美国年，美国PE-Cetus公司的公司的KaryMullis等人发明等人发明PCR技术。技术。HBVDNA定量检测PCR基因的原理一、PCR技术的发展及原理HBVDNA定2PCR原理FFPCR技术的本质是体外核酸扩增，加热使技术的本质是体外核酸扩增，加热使双链双链DNA解开螺旋，在退火温度条件下引解开螺旋，在退火温度条件下引物同模板物同模板DNA杂交，在杂交，在TaqDNA聚合酶，聚合酶，dNTPs，Mg2+和合适和合适pH缓冲液存在条件下缓冲液存在条件下延伸引物，重复延伸引物，重复“变性变性退火退火引物延伸引物延伸”过程至过程至25-40个循环，呈指数级扩大待测个循环，呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数。样本中的核酸拷贝数。HBVDNA定量检测PCR原理PCR技术的本质是体外核酸扩增，加热使双链DNA解3PCR的基本原理的基本原理 HBVDNA定量检测PCR的基本原理HBVDNA定量检测4PCR基因扩增仪的工作原理PCR基因扩增仪的工作原理基因扩增仪的工作原理PCR基因扩增仪工作关键是基因扩增仪工作关键是温度控制温度控制 HBVDNA定量检测PCR基因扩增仪的工作原理PCR基因扩增仪的工作原理HBVD5FF技术在技术在PCR反应体系中加入特异性的荧光反应体系中加入特异性的荧光染料或探针，荧光信号的变化真实地反映染料或探针，荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加，通过检测荧光信号，了体系中模板的增加，通过检测荧光信号，从而实时监测整个从而实时监测整个PCR反应过程，最后通反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。过标准曲线对未知模板进行定量分析。荧光实时定量PCR（real-time quantitative PCR,RQ-PCR）HBVDNA定量检测技术在PCR反应体系中加入特异性的荧光染料或探针，荧光信号的6n n荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCRPCRPCRPCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-fluorescence quantitative PCR,FQ-fluorescence quantitative PCR,FQ-fluorescence quantitative PCR,FQ-PCRPCRPCRPCR），又称实时），又称实时），又称实时），又称实时PCRPCRPCRPCR，是目前较精确的进行，是目前较精确的进行，是目前较精确的进行，是目前较精确的进行定量定量定量定量检测检测检测检测PCRPCRPCRPCR的方法的方法的方法的方法n nFQ-PCRFQ-PCRFQ-PCRFQ-PCR通过荧光信号对通过荧光信号对通过荧光信号对通过荧光信号对PCRPCRPCRPCR过程中产物量进行实时监过程中产物量进行实时监过程中产物量进行实时监过程中产物量进行实时监测，测，测，测，精确计算出精确计算出精确计算出精确计算出PCRPCRPCRPCR的初始模板量的初始模板量的初始模板量的初始模板量HBVDNA定量检测荧光定量PCR（fluorescencequantitat7n n荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCRPCR是融合了是融合了是融合了是融合了PCRPCR高灵敏性、高灵敏性、高灵敏性、高灵敏性、DNADNA杂交高特杂交高特杂交高特杂交高特异性异性异性异性和和和和光谱分析光谱分析光谱分析光谱分析的精确性，直接检测扩增过程中双链的精确性，直接检测扩增过程中双链的精确性，直接检测扩增过程中双链的精确性，直接检测扩增过程中双链DNADNA荧光信号的变化以获得定量的结果。荧光信号的变化以获得定量的结果。荧光信号的变化以获得定量的结果。荧光信号的变化以获得定量的结果。n n系统内装置有半导体系统内装置有半导体系统内装置有半导体系统内装置有半导体PCRPCR、卤钨灯光源激发荧光信号、卤钨灯光源激发荧光信号、卤钨灯光源激发荧光信号、卤钨灯光源激发荧光信号、光栅分光、超低温光电耦合器（光栅分光、超低温光电耦合器（光栅分光、超低温光电耦合器（光栅分光、超低温光电耦合器（CCDCCD）摄象机收集荧）摄象机收集荧）摄象机收集荧）摄象机收集荧光信号、计算机软件分析系统等。光信号、计算机软件分析系统等。光信号、计算机软件分析系统等。光信号、计算机软件分析系统等。HBVDNA定量检测荧光定量PCR是融合了PCR高灵敏性、DNA杂交高特异性和光8HBVDNA定量检测HBVDNA定量检测9HBVDNA定量检测HBVDNA定量检测10HBVDNA定量检测HBVDNA定量检测11n n荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCRPCRPCRPCR检测的是检测的是检测的是检测的是样本的样本的样本的样本的初始浓度初始浓度初始浓度初始浓度，而准，而准，而准，而准确测定初始浓度需要在确测定初始浓度需要在确测定初始浓度需要在确测定初始浓度需要在对数期对数期对数期对数期进行。进行。进行。进行。ThesoftwaredisplaysthefluorescenceThesoftwaredisplaysthefluorescencesignalsinreal-timeimmediatelyaftersignalsinreal-timeimmediatelyaftereachmeasurement.Signalsfromtheeachmeasurement.Signalsfromthesamplesareobtainedasthemachinesamplesareobtainedasthemachinepositionsthecapillariessequentiallyoverpositionsthecapillariessequentiallyovertheopticalunit.Duringthermalcycling,theopticalunit.Duringthermalcycling,fluorescencecanbemeasuredonceperfluorescencecanbemeasuredoncepercycleforeverycapillaryandthecycleforeverycapillaryandthefluorescencevaluesaredisplayedfluorescencevaluesaredisplayedimmediatelyonthescreenandupdatedimmediatelyonthescreenandupdatedaftereverycycle(Fig.3).Thegeneratedaftereverycycle(Fig.3).Thegenerateddataarestoredforfurtheranalysis.dataarestoredforfurtheranalysis.荧光定量荧光定量PCRPCR在每一次循环在每一次循环后对进行实时监控，因此后对进行实时监控，因此能最准确反映出对数期。能最准确反映出对数期。确定准确的初始浓度。确定准确的初始浓度。软件系统可以进行参软件系统可以进行参数设定、保存数据和数设定、保存数据和报告结果，并将结果报告结果，并将结果自动保存在计算机中。自动保存在计算机中。HBVDNA定量检测荧光定量PCR检测的是样本的初始浓度，而准确测定初始浓度需要12相同模板进行相同模板进行96次扩增的扩增曲线图。次扩增的扩增曲线图。HBVDNA定量检测相同模板进行96次扩增的扩增曲线图。HBVDNA定量检测13n n荧光定量技术要求在低浓度坏境。因为荧光检测定荧光定量技术要求在低浓度坏境。因为荧光检测定荧光定量技术要求在低浓度坏境。因为荧光检测定荧光定量技术要求在低浓度坏境。因为荧光检测定量原理是在忽略分子间相互作用的情况下建立的。如量原理是在忽略分子间相互作用的情况下建立的。如量原理是在忽略分子间相互作用的情况下建立的。如量原理是在忽略分子间相互作用的情况下建立的。如果分子浓度高了，影响作用很复杂，而果分子浓度高了，影响作用很复杂，而果分子浓度高了，影响作用很复杂，而果分子浓度高了，影响作用很复杂，而PCRPCRPCRPCR扩增产物是扩增产物是扩增产物是扩增产物是高浓度的，因此重复性变差也很容易理解。高浓度的，因此重复性变差也很容易理解。高浓度的，因此重复性变差也很容易理解。高浓度的，因此重复性变差也很容易理解。n n由于扩增末期，扩增效率可能因为大量的靶序列而由于扩增末期，扩增效率可能因为大量的靶序列而由于扩增末期，扩增效率可能因为大量的靶序列而由于扩增末期，扩增效率可能因为大量的靶序列而产生不可控的影响。产生不可控的影响。产生不可控的影响。产生不可控的影响。HBVDNA定量检测荧光定量技术要求在低浓度坏境。因为荧光检测定量原理是在忽略14CtCt值值，C C代代表表CycleCycle，t t代代表表thresholdthreshold，CtCt值值的的含含义义是是：每每个个反反应应管管内内的的荧荧光光信信号号到到达达设设定定的的域域值值时时所所经经历历的的循循环环数数。CtCt值值分分析析实实际际上上就就是是低低浓浓度度的的荧荧光光值值分分析析。由于是低浓度，影响因素小，所以具有良好的重现性。由于是低浓度，影响因素小，所以具有良好的重现性。研研究究表表明明，每每个个模模板板的的CtCt值值与与该该模模板板的的起起始始拷拷贝贝数数的对数存在线性关系，的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，起始拷贝数越多，CtCt值越小。值越小。HBVDNA定量检测Ct值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct15利利用用已已知知起起始始拷拷贝贝数数的的标标准准品品可可作作出出标标准准曲曲线线，其其中中横横坐坐标标代代表表起起始始拷拷贝贝数数的的对对数数，纵纵坐坐标标代代CtCt值值。因因此此，只只要要获获得得未未知知样样品品的的CtCt值值，即即可可从从标标准准曲曲线线上上计计算算出出该该样样品品的起始拷贝数。的起始拷贝数。HBVDNA定量检测利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始16荧光信号的检测方法：荧光信号的检测方法：荧光信号的检测方法：荧光信号的检测方法：1 1 1 1、DNADNADNADNA结合染料技术结合染料技术结合染料技术结合染料技术2 2 2 2、水解探针技术（、水解探针技术（、水解探针技术（、水解探针技术（TaqMan probeTaqMan probeTaqMan probeTaqMan probe）技术）技术）技术）技术3 3 3 3、杂交探针技术、杂交探针技术、杂交探针技术、杂交探针技术4 4 4 4、分子信标、分子信标、分子信标、分子信标HBVDNA定量检测荧光信号的检测方法：HBVDNA定量检测17ThebiggestdisadvantageofSYBRisthatitbindstoanydsDNA;thespecificproduct,non-specificproductsandprimerdimersaredetectedequallywell.TheLightCyclerInstrumentallowsmeltingcurveanalysisOncethemeltingpointoftheproducthasbeendeterminedtheLightCyclerInstrumentsflexibleprogrammingallowstheusertoacquirefluorescenceabovethemeltingtemperatureoftheprimerdimers,butbelowthemeltingtemperatureoftheproduct.缺点：存在非特异性产物，缺点：存在非特异性产物，可以与非特异性产物，甚至可以与非特异性产物，甚至引物二聚体结合发出荧光引物二聚体结合发出荧光。可以使用可以使用熔点曲线分析熔点曲线分析进进行鉴别，明显提高诊断的行鉴别，明显提高诊断的特异性。（特异性。（F1通道）通道）HBVDNA定量检测ThebiggestdisadvantageofSY182 2、TaqManTaqMan水解探针技术水解探针技术HBVDNA定量检测2、TaqMan水解探针技术HBVDNA定量检测19HBVDNA定量检测HBVDNA定量检测20HBVDNA定量检测HBVDNA定量检测21HBVDNA定量检测HBVDNA定量检测22杂交探针技术对杂交探针技术对PCR产物定量又称荧光共振能量转移，产物定量又称荧光共振能量转移，FRET需要一对引物和一对探针，探针需要一对引物和一对探针，探针A的的3端为荧光染料供体；探端为荧光染料供体；探针针B的的5端作为荧光染料受体。端作为荧光染料受体。2个探针首尾相连，仅差一个个探针首尾相连，仅差一个碱基。检测在退火时进行。碱基。检测在退火时进行。HBVDNA定量检测杂交探针技术对PCR产物定量又称荧光共振能量转移，FRETH23Advantages Advantages of of the the LightCycler LightCycler SystemSystemWatch Watch amplification amplification as as it it occurs:occurs:real-time,real-time,on-line on-line fluorescence fluorescence allows allows you you to to see see the the results results of of every every cycle cycle as as soon soon as as PCR PCR proceeds proceeds Save Save time:time:extremely extremely rapid rapid PCR,PCR,20 minutes for 30 cycles 20 minutes for 30 cycles Verify Verify amplicon amplicon specificity:specificity:melting melting curve curve analysis analysis provides provides differentiation differentiation between between amplification products amplification products Detect Detect mutations:mutations:changes changes in in the the melting melting curve curve analysis analysis can can be be used to identify mutations used to identify mutations Minimize Minimize contamination:contamination:amplification amplification and and detection detection are are performed in the same closed tube performed in the same closed tube 荧光定量荧光定量PCRPCR技术的优点技术的优点1 1）定量准确，实时监控）定量准确，实时监控2 2）敏感性和特异性高敏感性和特异性高3 3）简单快速，）简单快速，3030个循环个循环2020几分几分钟就能够完成。钟就能够完成。4 4）污染可能性小）污染可能性小5 5）不需要常规的产物后期复杂）不需要常规的产物后期复杂处理，直接观测结果处理，直接观测结果6 6）可以进行点突变分析，根据）可以进行点突变分析，根据熔点曲线的不同直接分析点突熔点曲线的不同直接分析点突变的情况。变的情况。HBVDNA定量检测AdvantagesoftheLightCycler24Figure 3.Mutation detection by melting curve analysis.Top panel:melting curves of amplified gene fragments from wild-type and mutant individuals.Bottom panel:negative first derivatives of the melting curves showing the unique melting peak of each genotype.The gene fragment amplified from the heterozygous individual exhibits a melting curve with both the wild-type and mutant peaks(red plot).HBVDNA定量检测Figure3.Mutationdetectionb25HBV的定量检测标本：病人血清标本：病人血清标本：病人血清标本：病人血清200200ll检测检测检测检测：HBVHBV病毒核酸病毒核酸病毒核酸病毒核酸载载载载量量量量检测样检测样检测样检测样本：阳性本：阳性本：阳性本：阳性对对对对照、阴性照、阴性照、阴性照、阴性对对对对照、空白照、空白照、空白照、空白对对对对照照照照标标标标准品、病人准品、病人准品、病人准品、病人HBVDNAHBVDNA检测检测检测检测步步步步骤骤骤骤：HBVDNAHBVDNA提取；提取；提取；提取；荧荧荧荧光定量光定量光定量光定量PCRPCR；结结结结果分析果分析果分析果分析定量定量定量定量PCRPCR方法：方法：方法：方法：TaqManTaqMan水解探水解探水解探水解探针针针针技技技技术术术术HBVDNA定量检测HBV的定量检测标本：病人血清200lHBVDNA定量检测26标准品扩增曲线标准品扩增曲线HBVDNA定量检测标准品扩增曲线HBVDNA定量检测27标准曲线标准曲线HBVDNA定量检测标准曲线HBVDNA定量检测28报告结果：报告结果：HBVDNA拷贝数拷贝数/ml，如如6.20106拷贝数拷贝数/ml或或6.20E+06参考范围：最小检测值，参考范围：最小检测值，5102拷贝数拷贝数/ml（5E+02）HBVDNA定量检测报告结果：HBVDNA拷贝数/ml，HBVDNA定量检测29