第十三次课单克隆抗体从诊断到治疗课件

第十三次课单克隆抗体从诊断到治疗第十三次课单克隆抗体从诊断到治疗第十三次第十三次课单课单克隆抗体从克隆抗体从诊诊断到治断到治疗疗1（优选）第十三次课单克隆抗（优选）第十三次课单克隆抗体从诊断到治疗体从诊断到治疗（优选优选）第十三次）第十三次课单课单克隆抗体从克隆抗体从诊诊断到治断到治疗疗“thespecificityindevelopmentandcontroloftheimmunesystem”andthethediscoveryof“theprincipleforproductionofmonoclonalantibodies”“thespecificityindevelopmen1.Natural-Selection Theory of antibody formation（抗体（抗体形成过程中的自然选择学说）形成过程中的自然选择学说）1955年年2.Somatic Generation of immune Recognition（免疫系统（免疫系统的自我建立学说）的自我建立学说）1971年年3.Network Theory（免疫系统的相对稳态学说）（免疫系统的相对稳态学说）1974年年Natural-SelectionTheoryofan免疫相关疾病和生物学过程免疫相关疾病和生物学过程1.自身免疫疾病：类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮自身免疫疾病：类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮2.器官移植：免疫排斥器官移植：免疫排斥3.过敏：有机体对某些药物或外界刺激的感受性不正过敏：有机体对某些药物或外界刺激的感受性不正常地增高的现象；过分敏感常地增高的现象；过分敏感4.疫苗：基因重组乙肝疫苗疫苗：基因重组乙肝疫苗免疫相关疾病和生物学免疫相关疾病和生物学过过程程Tcell在胸腺中经历阳性和阴性筛选过程在胸腺中经历阳性和阴性筛选过程Tcell在胸腺中在胸腺中经历经历阳性和阴性阳性和阴性筛选过筛选过程程第十三次第十三次课单课单克隆抗体从克隆抗体从诊诊断到治断到治疗课疗课件件1、多克隆抗体（、多克隆抗体（polyclonalantibody,pAb）：）：用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个机体多个B细胞细胞克隆克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物。2、单克隆抗体（、单克隆抗体（monoclonalantibodies,mAb）：）：由一个识别一种抗原表位的由一个识别一种抗原表位的B细胞细胞克隆克隆产生的同源抗产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。续地无限量供应。1、多克隆抗体（、多克隆抗体（polyclonalantibody,p每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度32孔，每孔量为0.包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和单抗纯度鉴定等。2、单克隆抗体（monoclonalantibodies,mAb）：HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤细胞系HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤细胞系前5天进行,预先腹腔注射pristane（降植烷）但无血清培养细胞的生产率低、细胞密度小，影响了单抗的产量；包括各类免疫血清学试验、生物学试验和免疫化学技术等b、1000r/min离心5-10分钟，将上清尽量吸净。前5天进行,预先腹腔注射pristane（降植烷）h、分装96孔细胞培养板，每孔0.经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。A、杂交瘤细胞的染色体分析（geneticengineeringantibody)对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客观指标之一，杂交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总和，正常小鼠脾细胞的染色体数目为40，小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为62-68，NS-1为54-56；h、分装96孔细胞培养板，每孔0.A（Aminopterin）：氨基喋呤；HGPRT酶与TK酶：McAbandPcAb每种每种杂杂交瘤交瘤细细胞分装胞分装96孔板一孔板一块块，每个稀，每个稀释释度度32孔，每孔量孔，每孔量为为0杂交瘤技交瘤技术的的诞生生1975年年8月月7日，日，Kohler和和Milstein在英国自然在英国自然杂志上志上发表了表了题为“分泌具有分泌具有预定特异性抗体的融定特异性抗体的融合合细胞的持胞的持续培养培养”（Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity）1984年度荣年度荣获诺贝尔尔生理学和医学生理学和医学奖杂杂交瘤技交瘤技术术的的诞诞生生一、一、杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合胞与小鼠骨髓瘤细胞融合 HATHAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤隆化增殖的杂交瘤细胞系细胞系 单克隆抗体生成：接种杂交瘤单克隆抗体生成：接种杂交瘤细胞于小鼠腹腔，腹细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体水中即可得到高效价的单克隆抗体一、一、杂杂交瘤技交瘤技术术的基本原理的基本原理聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）：）：细细胞融合胞融合剂剂抗体种类：抗体种类：第一代抗体第一代抗体 多克隆抗体多克隆抗体 （polyclonalantibody)第二代抗体第二代抗体单克隆抗体单克隆抗体（monoclonalantibody)第三代抗体第三代抗体基因工程抗体基因工程抗体（geneticengineeringantibody)抗体种抗体种类类：B B淋巴细胞淋巴细胞:寿命短寿命短,分泌特分泌特异系性抗体异系性抗体骨髓瘤细胞：寿命长骨髓瘤细胞：寿命长杂交瘤细胞：寿命长，单杂交瘤细胞：寿命长，单 隆抗体隆抗体B淋巴淋巴细细胞胞:寿命短寿命短,分泌特异系性抗体分泌特异系性抗体流流程程流流 不产生不产生IgIg的重链和轻链的重链和轻链HGPRT-（次黄嘌呤（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）转移酶）;TK-（胸腺嘧啶核苷激酶）（胸腺嘧啶核苷激酶）与提供淋巴细胞的动物品系相同与提供淋巴细胞的动物品系相同（一）小鼠骨髓瘤细胞（一）小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞系均来源于小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠，大鼠骨髓瘤细小鼠，大鼠骨髓瘤细胞都来源于胞都来源于LOU/c大鼠大鼠建立的骨髓瘤细胞系建立的骨髓瘤细胞系:SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653NSO/1不不产产生生Ig的重的重链链和和轻链轻链（一）小鼠骨髓瘤（一）小鼠骨髓瘤细细胞小鼠骨髓瘤胞小鼠骨髓瘤细细胞系胞系1108的淋巴细胞无菌手术HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤细胞系（3）单抗与相应抗原的反应性测定二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存20-37静置10分钟。McAbandPcAbNSO/1（二）单克隆抗体的纯化（1）单克隆性的确定小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠，大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠通常每只小鼠1108-2.FACS法（fluorescenceactivatedcellsorter）h、分装96孔细胞培养板，每孔0.叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径（D途径）细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法（用丙酮和甲醇按1:1比例固定细胞）防止非分泌细胞的过度生长ABC-ELISA试验亲合力通常以平均内在结合常数（K）表示。最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题（一）单克隆抗体的产生动动物：物：BALB/BALB/c c小鼠小鼠4 48 8周龄周龄20g20g25g25g体重体重（二）免疫脾细胞（二）免疫脾细胞1108的淋巴的淋巴细细胞胞无菌手无菌手术术（二）免疫脾（二）免疫脾细细胞胞细胞性抗原：细胞性抗原：（1 12 2）10107 7/只，不加佐剂，只，不加佐剂，2 23 3周重复一次周重复一次可溶性抗原：可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂首次，完全福氏佐剂+100+100微克抗原，微克抗原，3 36 6周周100100200200微克抗原，融合前微克抗原，融合前3 3天，加强免疫天，加强免疫体内免疫法体内免疫法-免疫原性强、来源充分的抗原，对于免疫原性强、来源充分的抗原，对于免疫原性很弱或对机体有害（如引起免疫抑制）的免疫原性很弱或对机体有害（如引起免疫抑制）的抗原就不适用了抗原就不适用了免疫小鼠免疫小鼠细细胞性抗原：免疫小鼠胞性抗原：免疫小鼠。淋巴细胞淋巴细胞。淋巴。淋巴细细胞胞。浆细胞浆细胞。浆细浆细胞胞。抗原接种抗原接种。抗原接种。抗原接种免疫原特性免疫原特性抗原量抗原量接种次数接种次数间隔时间隔时间间单抗的特性单抗的特性抗体滴度抗体滴度亲和性亲和性免疫原性强免疫原性强（如细胞、细（如细胞、细菌和病毒等）菌和病毒等）10106 6-10-107 7个细胞个细胞或或1-10ug1-10ug2-42-42-42-4周周高高中等至强中等至强免疫原性中等免疫原性中等10-100ug10-100ug2-42-42-42-4周周中等或高中等或高中等或强中等或强免疫原性弱免疫原性弱A.20-400ugA.20-400ug2-42-4随后随后2-32-3每月每月2-32-3月月中等中等强强B.10-50ugB.10-50ug其后其后200-400ug200-400ug2 2其后其后4 4每月每月每天每天中等中等中等中等C.10-100ugC.10-100ug2 2其后其后4 4其后其后“休息休息”最后加强最后加强每月每月1010天天1-21-2月月中等中等中等或强中等或强表表6-1不同免疫抗原的免疫程序不同免疫抗原的免疫程序（引自刘秀梵，（引自刘秀梵，1994）免疫原特性抗原量接种次数免疫原特性抗原量接种次数间间隔隔时间单时间单抗的特性抗体滴度抗的特性抗体滴度亲亲和性免疫和性免疫培养液：培养液：RPM1640培养液培养液DMEM培养液培养液（三）细胞融合（三）细胞融合培养液：（三）培养液：（三）细细胞融合胞融合细胞融合剂：细胞融合剂：PEG:分子量分子量4000的的PEG是最常用的细胞融合剂是最常用的细胞融合剂作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合膜易打开而有助于细胞融合作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEGPEG，其纯度与毒性有所不同，其纯度与毒性有所不同最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题好，且避免了病毒的污染问题细细胞融合胞融合剂剂：培养骨髓瘤细胞：培养骨髓瘤细胞：选择对数生长期的细胞进行传代培养选择对数生长期的细胞进行传代培养细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐避免细胞返祖：定期用避免细胞返祖：定期用8-AG8-AG（8 8氮鸟嘌呤）处理细氮鸟嘌呤）处理细胞，以维持胞，以维持HGPRT-HGPRT-的状态。的状态。注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于于-80-80或液氮及干冰中或液氮及干冰中培养骨髓瘤培养骨髓瘤细细胞：胞：取已经免疫的取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75%酒精中酒精中5分钟分钟通常每只小鼠通常每只小鼠1108-2.5108个脾细胞，每只大鼠脾脏个脾细胞，每只大鼠脾脏可得可得5108-10108脾细胞。脾细胞。免疫脾细胞的制备：免疫脾细胞的制备：1110108 8的的淋巴细胞淋巴细胞 无菌手术无菌手术取已取已经经免疫的免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为为抗抗常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞噬细胞其中巨噬细胞还有清除死亡细胞的作用其中巨噬细胞还有清除死亡细胞的作用饲养存活一般不超过饲养存活一般不超过2 2周，不影响杂交瘤细胞的纯化周，不影响杂交瘤细胞的纯化在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖，细胞多半不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞称为饲养细胞（这种被加入的活细胞称为饲养细胞（Feedercells）。）。饲养细胞：饲养细胞：常用的常用的饲饲养养细细胞有胸腺胞有胸腺细细胞、正常脾胞、正常脾细细胞和腹腔巨噬胞和腹腔巨噬细细胞胞。饲养细胞饲养细胞。饲饲养养细细胞胞融合方法融合方法a、将、将1108脾细胞与脾细胞与2107-5107骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14混合于一支混合于一支50ml融合管中，融合管中，补加不完全培养基至补加不完全培养基至30ml，充分混匀。，充分混匀。b、1000r/min离心离心5-10分钟，将上清尽量吸净。分钟，将上清尽量吸净。c、在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀、在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀;置置40水浴中预热。水浴中预热。d、用、用1ml吸管在吸管在1分钟左右（最佳时间为分钟左右（最佳时间为45秒）加预热至秒）加预热至40的的50%PEG（PH8.0）1ml，边加边轻轻搅拌。，边加边轻轻搅拌。e、用、用10ml吸管在吸管在90秒内加秒内加20-30ml预热至预热至37的不完全培养基；的不完全培养基；20-37静置静置10分分钟。钟。f、1000r/min5分钟；弃去上清。分钟；弃去上清。g、加入、加入5mlHAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含腹腔培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含腹腔巨噬细胞的巨噬细胞的HAT培养基至培养基至80-100ml。h、分装、分装96孔细胞培养板，每孔孔细胞培养板，每孔0.10-0.15ml；分装；分装24孔板，每孔孔板，每孔1.0-1.5ml；然后将；然后将培养板置培养板置37，5%CO2培养箱内培养。培养箱内培养。i、5天后用天后用HAT培养基换出培养基换出1/2培养基。培养基。j、7-10天后用天后用HT培养基换出培养基换出HAT培养基；（第培养基；（第14天后可用普通完全培养基）。天后可用普通完全培养基）。l、经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积、经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检以上时吸出上清供抗体检测。测。融合方法融合方法a、将、将1108脾脾细细胞与胞与2107-5107骨髓瘤骨髓瘤防止非分泌细胞的过度生长单克隆抗体生成：接种杂交瘤细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体包括各类免疫血清学试验、生物学试验和免疫化学技术等软琼脂平板法(softagarmethod)软琼脂平板法(softagarmethod)二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存ABC-ELISA试验单克隆抗体生成：接种杂交瘤细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，36周100200微克抗原，融合前3天，加强免疫最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.每次用BALB/c或F1代小鼠，（510）105/只,使用的动物当然首选BALB/c小鼠,将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。b、1000r/min离心5-10分钟，将上清尽量吸净。106-107个细胞或1-10ugDNA合成的主要途径被A阻断叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径（D途径）前5天进行,预先腹腔注射pristane（降植烷）DNA合成的主要途径被A阻断DNA合成的主要途径被A阻断10102020天出现克隆天出现克隆HATHAT筛选筛选杂交瘤细胞在融合后杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选，周左右即可筛选，即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来，通常也称为抗体检测。来，通常也称为抗体检测。融合细胞的早期培养融合细胞的早期培养防止非分泌防止非分泌细细胞的胞的过过度生度生长长1020天出天出现现克隆融合克隆融合细细胞的早期培胞的早期培常用的抗体检测方法：常用的抗体检测方法：（1）免疫）免疫酶酶技技术免疫免疫酶酶技技术是将抗原抗体反是将抗原抗体反应的特异性和的特异性和酶酶对底物底物显色反色反应的高效催的高效催化作用有机化作用有机结合而成的免疫学技合而成的免疫学技术。由于它特异性高，灵敏度高，。由于它特异性高，灵敏度高，现已已广泛用于广泛用于筛选和和鉴定定单抗。抗。用可溶性抗原的用可溶性抗原的酶酶联免疫吸附免疫吸附试验（ELISA）用全菌抗原的用全菌抗原的ELISA用全用全细胞抗原的胞抗原的ELISA抗体捕捉抗体捕捉ELISA试验ABC-ELISA试验Dot-ELISA试验免疫免疫组化染色法化染色法（2）免疫）免疫荧光技光技术间接免疫接免疫荧光法光法活活细胞的膜胞的膜荧光染色光染色（3）间接血凝接血凝试验（4）放射免疫）放射免疫测定定常用的抗体常用的抗体检测检测方法：（方法：（1）免疫）免疫酶酶技技术术HGPRTHGPRT酶与酶与TKTK酶酶：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶（四）杂交瘤细胞的选择性培养（四）杂交瘤细胞的选择性培养应用液：应用液：8-8-氮鸟嘌呤氮鸟嘌呤HGPRT酶酶与与TK酶酶：（四）：（四）杂杂交瘤交瘤细细胞的胞的选择选择性培养性培养应应用液：用液：HATHAT培养基：培养基：H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤次黄嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断断DNA合成主要途径（合成主要途径（D途径）途径）T（Thymidine）：胸）：胸腺嘧啶核苷酸；腺嘧啶核苷酸；“核苷酸前核苷酸前体体”，供细胞通过替代途径合成，供细胞通过替代途径合成DNADNA。H H和和T T联合阻联合阻断断DNADNA合成的替代途径。合成的替代途径。HAT培养基：培养基：第十三次第十三次课单课单克隆抗体从克隆抗体从诊诊断到治断到治疗课疗课件件HATHAT选择作用：选择作用：淋巴细胞：不能生长，淋巴细胞：不能生长，5 57 7天死亡。天死亡。DNADNA合成的合成的主要途径被主要途径被A A阻断阻断骨髓瘤细胞：不能生长，骨髓瘤细胞：不能生长，5 57 7天死亡。天死亡。HGPRTHGPRT缺缺乏，乏，DNADNA合成的替代途径被阻断合成的替代途径被阻断HAT选择选择作用：作用：SP2/O:HGPRT-，TK-;长长命命脾细胞脾细胞:HGPRT+，TK+;短命短命(7天天)杂交杂交瘤细胞瘤细胞:HGPRT+，TK+;长长命命骨髓瘤细胞、脾细胞与骨髓瘤细胞、脾细胞与杂交杂交瘤细胞瘤细胞SP2/O:HGPRT-，TK-;长长命骨髓瘤命骨髓瘤细细胞、脾胞、脾杂交瘤细胞特点：杂交瘤细胞特点：长期生长繁殖长期生长繁殖利用淋巴细胞的利用淋巴细胞的HGPRT，将，将H合成为嘌呤合成为嘌呤碱并最终与碱并最终与T一起合成一起合成DNA从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力杂杂交瘤交瘤细细胞特点：胞特点：有限稀释法有限稀释法(limitingdilution)FACS法法（fluorescenceactivatedcellsorter）软琼脂平板法软琼脂平板法(softagarmethod)二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存有限稀有限稀释释法法(limitingdilution)二、阳性二、阳性特点：特点：不需任何特殊设备不需任何特殊设备克隆出现效率高克隆出现效率高实验室常用方法实验室常用方法方法：方法：细胞悬液通过系列稀释细胞悬液通过系列稀释每个培养孔含每个培养孔含0.50.51 1个细胞个细胞有限稀释法有限稀释法每种每种杂交瘤交瘤细胞分装胞分装96孔板一孔板一块，每个稀，每个稀释度度32孔，每孔量孔，每孔量为0.2ml，每孔的，每孔的杂交瘤交瘤细胞数分胞数分别为0.5、3和和10。特点：有限稀特点：有限稀释释法每种法每种杂杂交瘤交瘤细细胞分装胞分装96孔板一孔板一块块，每个稀，每个稀释释度度3效率最高效率最高价格昂贵价格昂贵FACS（FluorescenceActivatingCellSorter）FACS（FluorescenceActivating106-107个细胞或1-10ug第二代抗体单克隆抗体其中巨噬细胞还有清除死亡细胞的作用可见该法操作简便、经济，不过，腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白（包括Ig）B淋巴细胞:寿命短,分泌特异系性抗体c、在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀;置40水浴中预热。软琼脂平板法(softagarmethod)PAGE、SDS-PAGE、IEF、WB防止细胞密度过高而死亡A、杂交瘤细胞的染色体分析亲合力通常以平均内在结合常数（K）表示。g、加入5mlHAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含腹腔巨噬细胞的HAT培养基至80-100ml。首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，36周100200微克抗原，融合前3天，加强免疫5108个脾细胞，每只大鼠脾脏可得5108-10108脾细胞。每次用BALB/c或F1代小鼠，（510）105/只,使用的动物当然首选BALB/c小鼠,将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。i、5天后用HAT培养基换出1/2培养基。DNA合成的主要途径被A阻断通常每只小鼠1108-2.软琼脂平板法软琼脂平板法(softagarmethod)按按1:1比例使比例使1.2%的的琼脂糖和脂糖和2DMEM培养基培养基(含有含有2抗生抗生素和素和20%的小牛血清的小牛血清)混合后，取混合后，取3mL混合液注入直径混合液注入直径6cm平皿中平皿中(10cm平皿加平皿加710mL)，冷却凝固，可作底，冷却凝固，可作底层琼脂脂置置CO2温箱中温箱中备用。用。按按1:1比例比例让0.7%的的琼脂糖和脂糖和2DMEM培养基在无菌培养基在无菌试管管中相混以后，再向管中加入中相混以后，再向管中加入0.2mL的的细胞胞悬液，充分混匀，液，充分混匀，注入注入铺有有1.2%琼脂糖底脂糖底层平皿中，逐形成双平皿中，逐形成双琼脂脂层。待上。待上层琼脂凝固后，置入脂凝固后，置入375%CO2温箱中培养温箱中培养1014天天克隆生克隆生长至至2mm时，用毛，用毛细吸管吸出克隆，直接吸管吸出克隆，直接转种于含种于含有有饲养养细胞的胞的24孔板，孔板，扩大培养。大培养。吸取上清，吸取上清，检测抗体，阳性孔可抗体，阳性孔可继续克隆化，或克隆化，或扩大培养、大培养、冻存。存。106-107个个细细胞或胞或1-10ug软琼软琼脂平板法脂平板法(softa配制方案：杂交瘤细胞（配制方案：杂交瘤细胞（1 15 5）x10 x106 6/ml)+/ml)+细胞冻存液细胞冻存液(30%(30%40%40%牛血清，牛血清，50%50%60%RPMI-164060%RPMI-1640培养液，培养液，10%DMSO)10%DMSO)“慢冻慢冻”：分步冷冻，：分步冷冻，30-7030-70液氮液氮保存数年至数十年保存数年至数十年“快融快融”：取出立即浸入：取出立即浸入37374040水浴中，使其迅速融化、水浴中，使其迅速融化、复苏复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多“阳性阳性”孔，孔，来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分细胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能发生的意外事故细胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能发生的意外事故配制方案：配制方案：杂杂交瘤交瘤细细胞（胞（15）x106/ml)+细细胞胞冻冻防止污染防止污染避免染色体丢失避免染色体丢失防止非分泌细胞的过度生长防止非分泌细胞的过度生长防止细胞密度过高而死亡防止细胞密度过高而死亡细胞冷冻的意义细胞冷冻的意义防止防止污污染染细细胞冷胞冷冻冻的意的意义义（1）单克隆性的确定）单克隆性的确定包括包括杂交瘤交瘤细胞的染色体分析、胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重抗免疫球蛋白重链和和轻链类型的型的鉴定和定和单抗抗纯度度鉴定等。定等。A A、杂交瘤交瘤细胞的染色体分析胞的染色体分析 对杂交瘤交瘤细胞胞进行染色体分析可行染色体分析可获得其是否是真正的得其是否是真正的杂交瘤交瘤细胞的客胞的客观指指标之一，之一，杂交瘤交瘤细胞的染色体数目胞的染色体数目应接近两种接近两种亲本本细胞染色体数目的胞染色体数目的总和，正常小鼠脾和，正常小鼠脾细胞的染色体数目胞的染色体数目为40，小鼠骨髓瘤，小鼠骨髓瘤细胞胞SP2/0为62-68，NS-1为54-56；B 、单抗免疫球蛋白的类别和亚类鉴定单抗免疫球蛋白的类别和亚类鉴定免疫扩散免疫扩散ELISAC、单抗纯度的鉴定、单抗纯度的鉴定聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、）、SDS-PAGE、等电点聚焦电泳、等电点聚焦电泳（IEF）及免疫）及免疫转印分析（转印分析（WB）等方法都可用于鉴定单抗的纯度。）等方法都可用于鉴定单抗的纯度。PAGE、SDS-PAGE、IEF、WB（三三）单克隆抗体的性质鉴定单克隆抗体的性质鉴定（1）单单克隆性的确定克隆性的确定（三）（三）单单克隆抗体的性克隆抗体的性质鉴质鉴定定（2）单抗理化特性的抗理化特性的鉴定定抗体抗体亲合力是指抗体与抗原或半抗原合力是指抗体与抗原或半抗原结合的程度，其高低主要是由合的程度，其高低主要是由抗体和抗原分子的大小、抗体分子抗体和抗原分子的大小、抗体分子结合簇（部）和抗原决定簇之合簇（部）和抗原决定簇之间的立体构型的合适程度决定的。的立体构型的合适程度决定的。亲合力通常以平均内在合力通常以平均内在结合常数合常数（K）表示。）表示。常用的方法有常用的方法有竞争争ELISA、非、非竞争性争性ELISA、间接接ELISA、间接法接法夹心心ELISA等等（3）单抗与相抗与相应抗原的反抗原的反应性性测定定包括各包括各类免疫血清学免疫血清学试验、生物学、生物学试验和免疫化学技和免疫化学技术等等（2）单单抗理化特性的抗理化特性的鉴鉴定定三、单克隆抗体的制备三、单克隆抗体的制备 经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。三、三、单单克隆抗体的制克隆抗体的制备备经过经过反复克隆化反复克隆化获获得的抗体得的抗体（一）单克隆抗体的产生（一）单克隆抗体的产生1 1 动物体内诱生方法：动物体内诱生方法：每次用每次用BALB/cBALB/c或或F1F1代小鼠，（代小鼠，（5 51010）10105 5/只只,使用的动物当然首选使用的动物当然首选BALB/c小鼠小鼠,将杂交瘤细胞将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。可见该法操作简便、经济，不过，腹浓度很高。可见该法操作简便、经济，不过，腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白（包括水中常混有小鼠的各种杂蛋白（包括Ig）（一）（一）单单克隆抗体的克隆抗体的产产生生1动动物体内物体内诱诱生方法：生方法：腹腔注射法腹腔注射法腹腔注射法腹腔注射法2 2 体外培养法：体外培养法：a、悬浮培养法：小规模悬浮培养多采用转瓶培养，通过搅拌、悬浮培养法：小规模悬浮培养多采用转瓶培养，通过搅拌使细胞呈悬浮状态；而大规模悬浮培养多采用发酵式的生物反使细胞呈悬浮状态；而大规模悬浮培养多采用发酵式的生物反应器应器b、微载体培养法、微载体培养法Microcarrier：主要以交联琼脂糖或葡聚糖、：主要以交联琼脂糖或葡聚糖、聚苯乙烯、玻璃等作为基质的产品聚苯乙烯、玻璃等作为基质的产品c、中空纤维细胞培养系统：由中空纤维生物反应器、培养基、中空纤维细胞培养系统：由中空纤维生物反应器、培养基容器、供氧器和蠕动泵等组成容器、供氧器和蠕动泵等组成d、微囊化细胞培养系统：先将杂交瘤细胞微囊化，然后将此、微囊化细胞培养系统：先将杂交瘤细胞微囊化，然后将此具有半透膜的微囊置于培养液中进行悬浮培养，一定时间后，具有半透膜的微囊置于培养液中进行悬浮培养，一定时间后，从培养液中分离出微囊，冲洗后打开囊膜，离心后即可获得高从培养液中分离出微囊，冲洗后打开囊膜，离心后即可获得高浓度的单抗。浓度的单抗。2体外培养法：体外培养法：3.3.杂交瘤细胞的无血清培养杂交瘤细胞的无血清培养已报道的各类无血清培养基有含有大豆类脂的、含有酪已报道的各类无血清培养基有含有大豆类脂的、含有酪蛋白的、化学限定性的、无蛋白的、含有血清低分子量蛋白的、化学限定性的、无蛋白的、含有血清低分子量成分的无血清培养基成分的无血清培养基利于单抗的纯化，有助于大规模生产，可减少细胞污染利于单抗的纯化，有助于大规模生产，可减少细胞污染的机会，且成本较低。的机会，且成本较低。但无血清培养细胞的生产率低、细胞密度小，影响了单但无血清培养细胞的生产率低、细胞密度小，影响了单抗的产量；抗的产量；3.杂杂交瘤交瘤细细胞的无血清培养胞的无血清培养可溶性抗原：可溶性抗原：ELISAELISA抗体捕获法抗体捕获法细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法（用丙酮和甲醇按（用丙酮和甲醇按1:11:1比例固定细胞）比例固定细胞）（二）单克隆抗体的纯化（二）单克隆抗体的纯化可溶性抗原：可溶性抗原：ELISA抗体捕抗体捕获获法（二）法（二）单单克隆抗体的克隆抗体的纯纯化化前前5 5天进行天进行,预先腹腔注射预先腹腔注射pristanepristane（降植烷）（1 15 5）10106 6细胞细胞1 13 3w w形成腹水形成腹水腹水型单抗的纯化腹水型单抗的纯化高滴度腹水高滴度腹水前前5天天进进行行,预预先腹腔注射先腹腔注射pristane（降植（降植烷烷）腹水型）腹水型单单抗抗盐析沉淀盐析沉淀亲和层析亲和层析离子交换层析离子交换层析 McAb McAb的纯化的纯化 盐盐析沉淀析沉淀McAb的的纯纯化化ELISAELISA多头加样枪多头加样枪ELISA多多头头加加样枪样枪