第六章生物催化剂的修饰与改造-课件

第六章 生物催化剂的修饰与改造1第六章 生物催化剂的修饰与改造1酶的结构和功能酶的结构和功能o酶蛋白的结构特征酶蛋白的结构特征o酶蛋白和其他蛋白质一样，由酶蛋白和其他蛋白质一样，由2020种基本氨基酸按一定的顺种基本氨基酸按一定的顺序排列，此即为酶蛋白的一级结构。序排列，此即为酶蛋白的一级结构。o具有一定结构的多肽链以一定规则的氢键形成具有一定结构的多肽链以一定规则的氢键形成-螺旋，螺旋，-折叠，折叠，-转角和自由盘绕等为二级结构。转角和自由盘绕等为二级结构。o这些二级结构单元进一步盘曲折叠，形成环状分子，即三这些二级结构单元进一步盘曲折叠，形成环状分子，即三级结构。级结构。o若酶蛋白具有四级结构，则必须具有两条或多条肽链。球若酶蛋白具有四级结构，则必须具有两条或多条肽链。球状分子表面以疏水作用力、范德华力、氢键等非共价键互状分子表面以疏水作用力、范德华力、氢键等非共价键互相连接起来，形成完整的酶分子。这些组成四级结构最小相连接起来，形成完整的酶分子。这些组成四级结构最小单位的肽键称为亚基。单位的肽键称为亚基。2酶的结构和功能酶蛋白的结构特征2全酶全酶辅酶或辅基辅酶或辅基酶蛋白酶蛋白必需残基必需残基活性部位活性部位结构残基（活性部位外的必需残基）结构残基（活性部位外的必需残基）非贡献残基非贡献残基接触残基接触残基辅助残基辅助残基催化基团催化基团底物结合基团底物结合基团o大多数酶是结合蛋白质。除了多肽链大多数酶是结合蛋白质。除了多肽链组分外，还含有非蛋白组分，他们通组分外，还含有非蛋白组分，他们通常是各种低分子的热稳定性物质或离常是各种低分子的热稳定性物质或离子（辅因子）。子（辅因子）。o酶蛋白酶蛋白+辅因子辅因子=全酶全酶3全酶辅酶或辅基酶蛋白必需残基活性部位结构残基（活性部位外的必酶蛋白分子水平的改造o基于序列的合理化设计（sequential rational design）,如化学修饰、定点突变（site-directed mutagenesis）o非合理设计（irrational design），利用基因的可操作性，模拟自然界的演化进程。如定向进化（directed evolution）杂合进化（hybrid evolution）4酶蛋白分子水平的改造基于序列的合理化设计（sequentia酶分子的研究：认识和改造酶分子的研究：认识和改造o认识酶，并利用各种生物化学、晶体学、光认识酶，并利用各种生物化学、晶体学、光谱学等方法对天然酶或突变体进行研究，获谱学等方法对天然酶或突变体进行研究，获得酶分子特征、空间结构、结构和功能之间得酶分子特征、空间结构、结构和功能之间的关系，以及氨基酸残基功能的信息。的关系，以及氨基酸残基功能的信息。o以此为根据，对酶分子进行改造以此为根据，对酶分子进行改造-合理设合理设计计o不需要准确的酶分子结构信息，而通过随即不需要准确的酶分子结构信息，而通过随即突变、基因重组、定向筛选等对酶进行改造突变、基因重组、定向筛选等对酶进行改造-非合理设计非合理设计5酶分子的研究：认识和改造认识酶，并利用各种生物化学、晶体学、生物催化剂的化学修饰生物催化剂的化学修饰o酶分子修饰：酶蛋白分子的结构发生改变酶分子修饰：酶蛋白分子的结构发生改变-改变酶的某些特性和功能。改变酶的某些特性和功能。o广义的说：蛋白质的修饰，通过化学基团的广义的说：蛋白质的修饰，通过化学基团的引入或除去引入或除去改变蛋白质的共价结构。改变蛋白质的共价结构。o酶分子的完整空间结构：赋予酶的生物催化酶分子的完整空间结构：赋予酶的生物催化功能和特性，另一方面，导致酶的稳定性差、功能和特性，另一方面，导致酶的稳定性差、活性不高。活性不高。6生物催化剂的化学修饰酶分子修饰：酶蛋白分子的结构发生改变-酶分子的修饰目的酶分子的修饰目的o人为的改变天然酶的某些性质：稳定性、创造天然人为的改变天然酶的某些性质：稳定性、创造天然酶所不具备的某些优良特性，扩大酶的应用范围。酶所不具备的某些优良特性，扩大酶的应用范围。o酶修饰后：酶修饰后：1 1）提高生物活性、）提高生物活性、2 2）增强在不良环境）增强在不良环境中的稳定性，中的稳定性，3 3）新的催化能力。）新的催化能力。o如：脂肪酶和蛋白酶被如：脂肪酶和蛋白酶被MPEGMPEG修饰后，可溶于有机溶修饰后，可溶于有机溶剂，催化酯合成、酯交换、肽合成。剂，催化酯合成、酯交换、肽合成。o如：如：a-a-胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰成亲水性更强胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰成亲水性更强的的-NHCH2COOH-NHCH2COOH后，抗不可逆热失活的稳定性在后，抗不可逆热失活的稳定性在60C60C可提高可提高10001000倍。倍。o如：对脂肪酶的如：对脂肪酶的CRLCRL的非特异性化学修饰，大幅度的非特异性化学修饰，大幅度提高立体选择性。提高立体选择性。7酶分子的修饰目的人为的改变天然酶的某些性质：稳定性、创造天然1 1、研究酶的空间结构、研究酶的空间结构2 2、确定氨基酸残基的功能、确定氨基酸残基的功能3 3、测定酶分子中某种氨基酸的数量、测定酶分子中某种氨基酸的数量 化学修饰在酶结构与功能研究中的应化学修饰在酶结构与功能研究中的应用除了以上三方面外，在测定酶的氨基酸用除了以上三方面外，在测定酶的氨基酸序列和研究变构酶时也能有不凡的表现。序列和研究变构酶时也能有不凡的表现。化学修饰在酶的结构和功能研究中的化学修饰在酶的结构和功能研究中的应用应用81、研究酶的空间结构化学修饰在酶的结构和功能研究中的应用8酶蛋白修饰的方法酶蛋白修饰的方法o物理修饰和化学修饰：物理修饰和化学修饰：o主链修饰主链修饰o侧链基团修饰侧链基团修饰o组成单位置换修饰组成单位置换修饰o金属离子置换修饰金属离子置换修饰o大分子结合修饰大分子结合修饰o亲和修饰亲和修饰9酶蛋白修饰的方法物理修饰和化学修饰：91010o生物大分子酶，组成单位主要是氨基酸和核苷酸。生物大分子酶，组成单位主要是氨基酸和核苷酸。AAAA通过肽键连接成肽链，在通过盘绕折叠形成完成通过肽键连接成肽链，在通过盘绕折叠形成完成的空间结构。蛋白类酶的主链的空间结构。蛋白类酶的主链-肽链，是酶分子结肽链，是酶分子结构的基础。主链一旦改变，酶的结构和特性将随之构的基础。主链一旦改变，酶的结构和特性将随之发生改变。发生改变。o主链的切断和连接主链的切断和连接-主链修饰：切断主链修饰：切断-酶原的活化，酶原的活化，连接连接-1-1个酶分子上具有两种或多种催化活性的多酶个酶分子上具有两种或多种催化活性的多酶融合体。融合体。o侧链的修饰：羧基的化学修饰、氨基、精氨酸胍基、侧链的修饰：羧基的化学修饰、氨基、精氨酸胍基、巯基、组氨酸咪唑基、色氨酸吲哚基、酪氨酸残基巯基、组氨酸咪唑基、色氨酸吲哚基、酪氨酸残基和脂肪羟基、甲硫氨酸甲硫基的化学修饰和脂肪羟基、甲硫氨酸甲硫基的化学修饰11生物大分子酶，组成单位主要是氨基酸和核苷酸。AA通过肽键连接酶蛋白的固定化方法修饰酶蛋白的固定化方法修饰o固定化可通过空间障碍、分配或扩散限制等效应影固定化可通过空间障碍、分配或扩散限制等效应影响酶的稳定性。响酶的稳定性。o空间障碍使得其他大分子难于与酶作用，载体上的空间障碍使得其他大分子难于与酶作用，载体上的酶能抵抗蛋白水解酶的降解，固定化后也能抑制某酶能抵抗蛋白水解酶的降解，固定化后也能抑制某些化学失活。些化学失活。o固定化后，微环境和游离酶有所改变，影响最始固定化后，微环境和游离酶有所改变，影响最始pHpH、底物专一性和动力学常数。如阳离子底物专一性和动力学常数。如阳离子resinresin载体，载体，最适最适pHpH升高；阴离子升高；阴离子resinresin载体的固定化，最适载体的固定化，最适pHpH偏低。偏低。o凝胶包埋：外部与内部传质都存在扩散效应，可以凝胶包埋：外部与内部传质都存在扩散效应，可以明显使酶更加稳定。如：明显使酶更加稳定。如：a-a-胰凝乳蛋白酶包埋在胰凝乳蛋白酶包埋在PAAPAA和和PAGEPAGE凝胶中，凝胶中，60C60C时，提高时，提高10001000倍。倍。12酶蛋白的固定化方法修饰固定化可通过空间障碍、分配或扩散限制等酶蛋白的反胶束修饰酶蛋白的反胶束修饰o提供包埋酶的口袋，使酶微胶囊化，保护酶，提供包埋酶的口袋，使酶微胶囊化，保护酶，使其在不利环境下有效发挥作用。使其在不利环境下有效发挥作用。o提高酶活，改变专一性。如：游离脂肪酶在提高酶活，改变专一性。如：游离脂肪酶在油脂甲醇解反应体系，反胶束体系，活力、油脂甲醇解反应体系，反胶束体系，活力、稳定性提高稳定性提高5 5倍。倍。13酶蛋白的反胶束修饰提供包埋酶的口袋，使酶微胶囊化，保护酶，使大分子修饰剂的化学修饰大分子修饰剂的化学修饰o非共价修饰非共价修饰o使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢氢键键固定在酶分子表面，也能通过固定在酶分子表面，也能通过氢键氢键有效地与外部水相连，有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。从而保护酶的活力。o一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。过调节酶的微环境来保护酶的活力。o另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。稳定性也就增加了。14大分子修饰剂的化学修饰非共价修饰14o用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过过共价键共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。o例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以，不仅可以降低降低或消除酶的抗原性或消除酶的抗原性，而且提高了，而且提高了抗蛋白酶的能力抗蛋白酶的能力，延长，延长了酶在体内的了酶在体内的半衰期半衰期从而提高了酶药效。从而提高了酶药效。o每分子核糖核酸酶与每分子核糖核酸酶与6.56.5分子的右旋糖酐结合，可以使分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的酶活力提高到原有酶活力的2.252.25倍；倍；o每分子胰凝乳蛋白酶与每分子胰凝乳蛋白酶与1111分子右旋糖酐结合，酶活力达分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的到原有酶活力的5.15.1倍倍 共价修饰共价修饰15用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接大分子修饰大分子修饰(共价共价)的过程的过程o修饰剂的选择修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（例如，聚乙二醇（PEGPEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（FicollFicoll）、）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。o修饰剂的活化修饰剂的活化：修饰剂含有的基团往往不能直接与酶分子的基：修饰剂含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，然团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。o修饰修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、以一定的比例混合，在一定的温度、pHpH值等条件下反应一段时值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。对酶分子进行修饰。o分离分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。16大分子修饰(共价)的过程修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修oPEGPEG、单甲氧基聚乙二醇（、单甲氧基聚乙二醇（MPEGMPEG）、聚乙烯吡咯烷酮）、聚乙烯吡咯烷酮（PVPPVP）、聚丙烯酸（）、聚丙烯酸（PAAPAA）、葡聚糖、）、葡聚糖、CDCD、羧甲基纤维、羧甲基纤维素等可溶性分子。素等可溶性分子。o分子量分子量500-20000500-20000的的PEGPEG类修饰剂应用最广，类修饰剂应用最广，PEGPEG分子末分子末端有端有 2 2个个-OH-OH，两亲分子，无毒，没有免疫原性。，两亲分子，无毒，没有免疫原性。o如：辣根过氧化物酶用如：辣根过氧化物酶用MPEGMPEG共价修饰后，极端共价修饰后，极端pHpH下抗变下抗变性能力提高，耐热性提高。性能力提高，耐热性提高。o如：如：MPEGMPEG修饰的过氧化氢酶在有机溶剂中，溶解性和酶修饰的过氧化氢酶在有机溶剂中，溶解性和酶活提高，耐热性提高，在三氯乙烷中酶活提高活提高，耐热性提高，在三氯乙烷中酶活提高200200倍，倍，水溶液中酶活力提高水溶液中酶活力提高15-2015-20倍。倍。o不足：不足：影响酶活性中心，必须事先了解酶活性部位的结影响酶活性中心，必须事先了解酶活性部位的结构、或采取措施保护酶活性部位。构、或采取措施保护酶活性部位。17PEG、单甲氧基聚乙二醇（MPEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP小分子修饰剂的化学修饰小分子修饰剂的化学修饰o小分子化合物对活性部位或活性部位之外的小分子化合物对活性部位或活性部位之外的侧链基侧链基团化学修饰团化学修饰。o包括：酶分子的表面化学修饰、内部修饰、非催化包括：酶分子的表面化学修饰、内部修饰、非催化活性基团修饰、催化活性基团的修饰、酶蛋白的主活性基团修饰、催化活性基团的修饰、酶蛋白的主链修饰、辅因子相关的修饰。链修饰、辅因子相关的修饰。o共价修饰蛋白质达到稳定化的原因：共价修饰蛋白质达到稳定化的原因：1)1)获得不同于获得不同于天然蛋白质构象的更稳定的构象；天然蛋白质构象的更稳定的构象；2 2）修饰）修饰“关键关键功能基团功能基团”而达到稳定化；而达到稳定化；3 3）引入了新功能基团）引入了新功能基团可以形成附加的氢键和盐健；可以形成附加的氢键和盐健；4 4）非极性试剂修饰）非极性试剂修饰加强蛋白质中的疏水相互作用；加强蛋白质中的疏水相互作用；5 5）蛋白质表面基）蛋白质表面基团的亲水化。团的亲水化。18小分子修饰剂的化学修饰小分子化合物对活性部位或活性部位之外的侧链基团修饰侧链基团修饰o酶蛋白的侧链基团是指组成蛋酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。白质的氨基酸残基上的功能团。主要包括主要包括氨基、羧基、巯基、氨基、羧基、巯基、氨基、羧基、巯基、氨基、羧基、巯基、胍基、酚基胍基、酚基胍基、酚基胍基、酚基等。等。o这些基团的修饰可以形成各种副键，对酶蛋白空间结构的形这些基团的修饰可以形成各种副键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。成和稳定有重要作用。o侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。酶的特性和功能。o经常被修饰的残基是：经常被修饰的残基是：n亲核的亲核的SerSer、CysCys、MetMet、ThrThr、LysLys、HisHisn亲电的亲电的TyrTyr、TrpTrp19侧链基团修饰酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功氨基修饰氨基修饰o修饰剂主要有：修饰剂主要有：o亚硝酸、亚硝酸、o2,4-2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯(DNFB)(DNFB)、o丹磺酰氯丹磺酰氯(DNS)(DNS)、o2,4,6-2,4,6-三硝基苯磺三硝基苯磺酸酸(TNBS)(TNBS)、o醋酸酐、醋酸酐、o琥珀酸酐、琥珀酸酐、o二硫化碳、二硫化碳、o乙亚胺甲酯、乙亚胺甲酯、oO O甲基异脲甲基异脲o顺丁烯二酸酐等。顺丁烯二酸酐等。1 1 乙酸酐，乙酸酐，2 TNBS,3 DNFB2 TNBS,3 DNFB，4 4 碘代乙酸，碘代乙酸，5 5 还原烷基化，还原烷基化，6 DNS6 DNS20氨基修饰修饰剂主要有：1 乙酸酐，2 TNBS,3 DN羧基修饰羧基修饰 o羧基修饰剂：羧基修饰剂：o碳二亚胺碳二亚胺o重氮基乙酸盐、重氮基乙酸盐、o乙醇盐酸试乙醇盐酸试剂、剂、o异恶唑盐。异恶唑盐。o羧基修饰剂与侧链的羧基进行酯化、酰基化等反应，使蛋羧基修饰剂与侧链的羧基进行酯化、酰基化等反应，使蛋白质的空间构象发生改变白质的空间构象发生改变o碳二亚胺是酶分子羧基修饰最普遍采用的修饰剂。用此修碳二亚胺是酶分子羧基修饰最普遍采用的修饰剂。用此修饰法可以定量测定酶分子中羧基的数目饰法可以定量测定酶分子中羧基的数目 1 1碳化二亚胺，碳化二亚胺，2 2硼氟化三甲锌盐，硼氟化三甲锌盐，3 3甲醇甲醇-HCl-HCl21羧基修饰 羧基修饰剂：羧基修饰剂与侧链的羧基进行酯化、酰基化巯基修饰o常用的巯基修饰剂：o酰化剂o烷基化剂、o马来酰亚胺、o二硫苏糖醇、o巯基乙醇、o硫代硫酸盐、o硼氢化钠。1 DTNB,2 4,4-二硫二吡啶二硫二吡啶(4-PDS),3 对氯汞苯甲酸对氯汞苯甲酸(PMB)22巯基修饰常用的巯基修饰剂：1 DTNB,2 4,4-二硫胍基修饰o采用二羰基化合物与胍基反应生成稳定的杂环，它们可以在中性或者弱碱性的条件下，与精氨酸残基上的胍基反应，生成稳定的杂环类化合物。o胍基修饰剂的二胍基修饰剂的二羰基化合物：羰基化合物：o丁二酮、丁二酮、o1,2-1,2-环己二酮、环己二酮、o丙二醛、丙二醛、o苯乙二醛等。苯乙二醛等。1 1丁二酮丁二酮/硼酸盐硼酸盐,2 1,2-,2 1,2-环己二酮环己二酮,3,3苯乙二醛苯乙二醛23胍基修饰采用二羰基化合物与胍基反应生成稳定的杂环，它们可以酚基修饰o蛋白质分子的酪氨酸残基上含有酚基。酚基的修饰包括酚羟基的修饰和苯环上的取代修饰。o碘化法、o硝化法、o琥珀酰化法o四硝基甲烷（TNM）可以高度专一地对酚羟基进行修饰。24酚基修饰蛋白质分子的酪氨酸残基上含有酚基。酚基的修饰包括咪唑基修饰o常用修饰剂有：o碘乙酸，o焦碳酸二乙酯等。o组氨酸残基发生改变1 1焦碳酸二乙酯，焦碳酸二乙酯，2 2碘代乙酸，碘代乙酸，3 3碘化反应碘化反应25咪唑基修饰常用修饰剂有：组氨酸残基发生改变1焦碳酸二乙酯，2吲哚基修饰o修饰剂修饰剂:oN-N-溴代琥珀溴代琥珀酰亚胺酰亚胺（NBSNBS）、）、o2-2-羟基羟基-5-5-硝硝基苄溴基苄溴（HNBBHNBB）o4-4-硝基苯硫硝基苯硫氯。氯。o色氨酸含有吲哚基26吲哚基修饰修饰剂:色氨酸含有吲哚基26分子内交联修饰o含有双功能基团的化合物（双功能试剂），如戊二醛、己含有双功能基团的化合物（双功能试剂），如戊二醛、己二胺、葡聚糖二乙醛等，可以在酶蛋白分子中相距较近的二胺、葡聚糖二乙醛等，可以在酶蛋白分子中相距较近的两个侧链基团之间形成共价交联，从而提高酶的稳定性两个侧链基团之间形成共价交联，从而提高酶的稳定性o根据其功能基团的特点分为：同型双功能基团化合物和异根据其功能基团的特点分为：同型双功能基团化合物和异型双功能基团化合物。型双功能基团化合物。o同型双功能基团化合物两端具有相同的功能基团，例如，同型双功能基团化合物两端具有相同的功能基团，例如，己二胺己二胺H2N-(CH2)6H2N-(CH2)6NH2NH2两端都含有氨基，可以与酶分两端都含有氨基，可以与酶分子中的羧基形成酰胺键子中的羧基形成酰胺键,；戊二醛；戊二醛OHC-(CH2)3-CHOOHC-(CH2)3-CHO的两的两端都含有醛基等，可与酶分子的氨基形成酰胺键或者与羟端都含有醛基等，可与酶分子的氨基形成酰胺键或者与羟基反应形成酯键。基反应形成酯键。o异型双功能基团化合物的两端所含的功能基团不相同，可异型双功能基团化合物的两端所含的功能基团不相同，可以与酶分子上不同的侧链基团反应。如，一端与酶分子的以与酶分子上不同的侧链基团反应。如，一端与酶分子的氨基作用，另一端与酶分子的巯基或羧基作用等。氨基作用，另一端与酶分子的巯基或羧基作用等。27分子内交联修饰含有双功能基团的化合物（双功能试剂），如戊二醛酶蛋白主链修饰酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰肽链有限水解修饰)o利用酶分子主链的切断和连接，在肽链的限定位点进行利用酶分子主链的切断和连接，在肽链的限定位点进行水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性和功能的方法，称为肽链有限水修饰。酶的特性和功能的方法，称为肽链有限水修饰。o有些生物体可以生物合成不显示酶催化活性的酶原有些生物体可以生物合成不显示酶催化活性的酶原,利利用具有高度专一性的蛋白酶对其进行肽链有限水解修饰用具有高度专一性的蛋白酶对其进行肽链有限水解修饰,显示出酶的催化活性或提高酶活力。显示出酶的催化活性或提高酶活力。28酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰)利用酶分子主链的切断和连接胃蛋白酶原的激活胃蛋白酶原的激活 29胃蛋白酶原的激活 29酶分子的物理修饰酶分子的物理修饰 o通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端条件下（高温、高压、高盐、极端pHpH值等）由于酶分子空值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。o特点：不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键特点：不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排，使酶分子的空间构象改变。化和重排，使酶分子的空间构象改变。o如：高压方法处理纤维素酶，最适温度降低，在如：高压方法处理纤维素酶，最适温度降低，在30-40C30-40C的的条件下，高压修饰的纤维素酶比天然酶活力提高条件下，高压修饰的纤维素酶比天然酶活力提高10%10%。o如：盐酸胍使胰蛋白酶的原有空间构象破环，通过透析除如：盐酸胍使胰蛋白酶的原有空间构象破环，通过透析除去变性剂后，在不同温度下，使酶重新构建新的空间构象：去变性剂后，在不同温度下，使酶重新构建新的空间构象：20C20C时重新构建的酶稳定性基本不变，在时重新构建的酶稳定性基本不变，在50C50C时构建的酶稳时构建的酶稳定性提高定性提高5 5倍。倍。30酶分子的物理修饰 通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别酶修饰后的性质变化酶修饰后的性质变化o热稳定性热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。：一般来说，热稳定性有较大的提高。o抗原性抗原性：比较公认的是：比较公认的是PEGPEG和人血清白蛋白在消除酶的和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。抗原性上效果比较明显。o各类失活因子的抵抗力各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。o半衰期半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。从而延长了在体内的半衰期。o最适最适pHpH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pHpH发生了变发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适最适pHpH更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。oKmKm的变化的变化：大多数酶经修饰后，：大多数酶经修饰后，VmVm没有明显变化，但有没有明显变化，但有些酶经修饰后，些酶经修饰后，KmKm值变大。值变大。31酶修饰后的性质变化热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。酶的金属离子置换修饰酶的金属离子置换修饰o把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。o若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。性可以恢复或者部分恢复。o若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。32酶的金属离子置换修饰把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，o-淀粉酶中的钙离子（淀粉酶中的钙离子（CaCa2+2+），谷氨酸脱氢酶中的锌），谷氨酸脱氢酶中的锌离子离子(Zn(Zn2+2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子，过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe(Fe2+2+)，酰基，酰基氨基酸酶分子中的锌离子（氨基酸酶分子中的锌离子（ZnZn2+2+）,超氧化物歧化酶分超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子子中的铜、锌离子(Cu(Cu2+2+,Zn,Zn2+2+)o酶活提高：酶活提高：-淀粉酶中的钙离子（淀粉酶中的钙离子（CaCa2+2+）：发酵生产、）：发酵生产、保存和应用中，添加一定量保存和应用中，添加一定量CaCa，有利提高和稳定其活力；，有利提高和稳定其活力；ZnZn型蛋白酶（型蛋白酶（ZnCaZnCa置换）置换）-Ca-Ca型蛋白酶，活力提高型蛋白酶，活力提高30%30%。o稳定的改变：稳定的改变：FeFe型型SODSOD置换成置换成Mn-SODMn-SOD，其对过氧化氢的，其对过氧化氢的稳定性显著提高，对叠氮钠（稳定性显著提高，对叠氮钠（NaN3NaN3）的敏感性显著降低。）的敏感性显著降低。o动力学特性改变：酰基化氨基酸水解酶活性中心的动力学特性改变：酰基化氨基酸水解酶活性中心的ZnZn被被CoCo置换后，置换后，N-N-氯氯-乙酰丙氨酸水解最适乙酰丙氨酸水解最适pH8.5pH8.5降到降到7 7，KmKm增大，增大，33-淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Z金属离子置换修饰的过程金属离子置换修饰的过程 p a.a.酶的分离纯化酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。去杂质，获得具有一定纯度的酶液。p b.b.除去原有的金属离子除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTAEDTA）等，使酶分子中的金属离）等，使酶分子中的金属离子与子与EDTAEDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将将EDTA-EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。p c.c.加入置换离子加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。就可以得到经过金属离子置换后的酶。金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。子的酶。用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。34金属离子置换修饰的过程 a.酶的分离纯化：首先将欲进行修酶分子修饰的基本要求和条件酶分子修饰的基本要求和条件 o对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。n（1 1）酶的稳定性酶的稳定性o热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pHpH、抑制剂等。、抑制剂等。n（2 2）酶活性中心的状况酶活性中心的状况 o活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等。亚基数等。35酶分子修饰的基本要求和条件 对酶分子进行修饰必须在修饰原理、酶分子修饰的条件酶分子修饰的条件o修饰反应尽可能在修饰反应尽可能在酶稳定条件酶稳定条件下进行，并尽量下进行，并尽量不破坏酶不破坏酶活性功能的必需基团活性功能的必需基团，使，使修饰率高修饰率高，同时酶的，同时酶的活力回收活力回收高高。n（1 1）pHpH与离子强度与离子强度 opHpH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。于它们的解离状态不同，反应性能也不同。n（2 2）修饰反应的温度与时间修饰反应的温度与时间 o严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。一性的修饰反应。n（3 3）反应体系中酶与修饰剂的比例反应体系中酶与修饰剂的比例 36酶分子修饰的条件修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破酶的组成单位置换修饰酶的组成单位置换修饰o酶分子的基本组成单位：氨基酸、核苷酸，酶分子的基本组成单位：氨基酸、核苷酸，他们是酶的化学结构和空间结构的基础，微他们是酶的化学结构和空间结构的基础，微小的改变引起酶的特性和功能。小的改变引起酶的特性和功能。o酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸基酸氨基酸置换修饰。氨基酸置换修饰。o酶酶RNARNA的基本组成核苷酸，核苷酸链上上某的基本组成核苷酸，核苷酸链上上某一个核苷酸换成另一个核苷酸一个核苷酸换成另一个核苷酸核苷酸置换核苷酸置换修饰。修饰。37酶的组成单位置换修饰酶分子的基本组成单位：氨基酸、核苷酸，他氨基酸或核苷酸的化学置换修饰氨基酸或核苷酸的化学置换修饰o例如，例如，BenderBender等成功地利用化学修饰法将枯草等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而是化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。工业化生产。38氨基酸或核苷酸的化学置换修饰例如，Bender等成功地利用化核苷酸核苷酸定位突变技术置换修饰定位突变技术置换修饰o例：例：L-19IVS L-19IVS 活性中心上碱基的改变引起其底物专一性活性中心上碱基的改变引起其底物专一性的变化的变化39核苷酸定位突变技术置换修饰例：L-19IVS 活性中心上碱基定位突变技术用于酶分子修饰的主要过程定位突变技术用于酶分子修饰的主要过程o定点突变（定点突变（site directed mutagenesissite directed mutagenesis）是）是2020世纪世纪8080年代发展起来的一种基因操作技术。是指在年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNADNA序列中序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程（操作技术。是蛋白质工程（Protein EngineeringProtein Engineering）和）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。o在在DNADNA水平改变已有蛋白质的编码序列的基本方法，水平改变已有蛋白质的编码序列的基本方法，在已知的在已知的DNADNA序列中取代、插入或删除特定的核苷酸，序列中取代、插入或删除特定的核苷酸，从而改变酶结构中的个别从而改变酶结构中的个别AAAA残基。残基。-理性分子设计理性分子设计o新的酶分子结构的设计新的酶分子结构的设计o突变基因碱基序列的确定突变基因碱基序列的确定o突变基因的获得突变基因的获得o新酶的获得新酶的获得40定位突变技术用于酶分子修饰的主要过程定点突变（site dio新的酶分子结构的设计新的酶分子结构的设计o根据已知酶根据已知酶RNARNA或酶蛋白的化学机构和空间结构或酶蛋白的化学机构和空间结构及特性，特别是根据酶在催化活性、稳定性、及特性，特别是根据酶在催化活性、稳定性、专一性等存在的问题，设计出想获得的新酶专一性等存在的问题，设计出想获得的新酶RNARNA的核苷酸排列次序或酶蛋白的氨基酸排列次序，的核苷酸排列次序或酶蛋白的氨基酸排列次序，确定想置换的核苷酸或氨基酸及其位置。确定想置换的核苷酸或氨基酸及其位置。41新的酶分子结构的设计41o突变基因碱基序列的确定突变基因碱基序列的确定o根据想获得酶蛋白的氨基酸排列次序，对照根据想获得酶蛋白的氨基酸排列次序，对照遗传密码，确定其对应的遗传密码，确定其对应的mRNAmRNA上的核苷酸序上的核苷酸序列，再依据碱基互补原则，确定此列，再依据碱基互补原则，确定此mRNAmRNA所对所对应的突变基因上的碱基序列，并确定需要置应的突变基因上的碱基序列，并确定需要置换的剪辑及其位置。换的剪辑及其位置。42突变基因碱基序列的确定42o突变基因的获得突变基因的获得o根据突变基因的剪辑序列及其需要置换的碱基位置，根据突变基因的剪辑序列及其需要置换的碱基位置，首先用首先用DNADNA合成仪合成有合成仪合成有1-21-2个碱基被置换了的寡核个碱基被置换了的寡核苷酸，再以此为引物通过苷酸，再以此为引物通过PCRPCR扩增获得大量的突变扩增获得大量的突变基因（寡核苷酸诱导的定位突变）基因（寡核苷酸诱导的定位突变）o新酶的获得新酶的获得o上述定点突变获得的突变基因体外重组，插入到适上述定点突变获得的突变基因体外重组，插入到适宜的基因载体中，然后进行转化、转导、介导、基宜的基因载体中，然后进行转化、转导、介导、基因枪、显微注射等技术，转入到适宜的宿主细胞，因枪、显微注射等技术，转入到适宜的宿主细胞，再在适宜的条件下进行表达，获得经过修饰的新酶。再在适宜的条件下进行表达，获得经过修饰的新酶。43突变基因的获得434444定点突变的局限o基于酶蛋白的空间结构o蛋白质结构与功能间关系的复杂性o蛋白质序列如何决定高级结构、高级结构如何影响酶特性，如：蛋白质序列如何影响蛋白质的异源表达、高级结构的催化活力如何受非天然环境的影响等。o成功率低45定点突变的局限基于酶蛋白的空间结构451 1 1 1、某些修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一、某些修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一、某些修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一、某些修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一性是相对的，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一性是相对的，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一性是相对的，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂；的化学修饰剂；的化学修饰剂；的化学修饰剂；2 2 2 2、化学修饰后的酶构象或多或少都有一些改变，、化学修饰后的酶构象或多或少都有一些改变，、化学修饰后的酶构象或多或少都有一些改变，、化学修饰后的酶构象或多或少都有一些改变，这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释；这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释；这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释；这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释；3 3 3 3、酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧、酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧、酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧、酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，目前还不能用化学修饰的方法研究其链上进行，目前还不能用化学修饰的方法研究其链上进行，目前还不能用化学修饰的方法研究其链上进行，目前还不能用化学修饰的方法研究其他氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用；他氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用；他氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用；他氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用；4 4 4 4、酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关、酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关、酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关、酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，但尚缺乏准确性和系统性。系能提供一些信息，但尚缺乏准确性和系统性。系能提供一些信息，但尚缺乏准确性和系统性。系能提供一些信息，但尚缺乏准确性和系统性。蛋白质化学修饰的局限性蛋白质化学修饰的局限性 461、某些修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的，很少生物催化剂的定向进化生物催化剂的定向进化dierected evolutiondierected evolutiono非理性设计非理性设计irrational design,irrational design,不需要事先了解酶不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的计划条的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的计划条件，模拟自然进化机制（随即突变、基因重组、自件，模拟自然进化机制（随即突变、基因重组、自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（筛选）然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（筛选）出所需要的性能优良的酶。出所需要的性能优良的酶。o酶分子定向进化是从一个或多个已经存在的亲本酶酶分子定向进化是从一个或多个已经存在的亲本酶出发，经过基因的突变和重组，构造一个人工突变出发，经过基因的突变和重组，构造一个人工突变酶库，通过筛选最终获得预先期望的具有某些特性酶库，通过筛选最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。的进化酶。47生物催化剂的定向进化dierected evolutiono定向进化原理：对单一酶分子基因进行定向进化为例，定向进化原理：对单一酶分子基因进行定向进化为例，在待进化酶基因的在待进化酶基因的PCRPCR扩增反应中，利用扩增反应中，利用Taq DNATaq DNA多聚多聚酶不具有酶不具有3-53-5校对功能，并控制突变库的大小使其校对功能，并控制突变库的大小使其与特定的筛选容量相适合。选择适当条件以较低的比与特定的筛选容量相适合。选择适当条件以较低的比率向目的基因中随机引入突变，进行正定向突变间的率向目的基因中随机引入突变，进行正定向突变间的随机组合以构建突变库，凭借定向的选择（或筛选）随机组合以构建突变库，凭借定向的选择（或筛选）方法，选出所需要性质的优化酶，从而排除其他突变方法，选出所需要性质的优化酶，从而排除其他突变体。体。48定向进化原理：对单一酶分子基因进行定向进化为例，在待进化酶基o定向进化的基本规则是定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体获取你所筛选的突变体”。o定向进化的目的：在短时间内，通过反复的突变定向进化的目的：在短时间内，通过反复的突变/复制复制/筛选筛选/选择过程，获取你想筛选的得以提高的选择过程，获取你想筛选的得以提高的突变酶，即定向进化突变酶，即定向进化=随机突变随机突变+选择。选择。o创始人：创始人：StemerStemer和和ArnoldArnold，认为定向进化：是物种，认为定向进化：是物种进行选择的一个高技术版本，是在分子水平上的繁进行选择的一个高技术版本，是在分子水平上的繁育，研究的对象不是整个有机体，而是特定的基因育，研究的对象不是整个有机体，而是特定的基因或蛋白质。或蛋白质。49定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。49定向进化的一般过程：定向进化的一般过程：o不仅能够改造单个蛋白质分子，而且可以改造整个生物合成不仅能够改造单个蛋白质分子，而且可以改造整个生物合成和生物降解途径。和生物降解途径。o（1 1）基因的选择：选择编码所需蛋白质的）基因的选择：选择编码所需蛋白质的DNADNA序列。序列。o（2 2）突变或重组：通过易错）突变或重组：通过易错PCRPCR引入随即突变或引入随即突变或DNA DNA ShufflingShuffling等方法增加基因序列的多样性。等方法增加基因序列的多样性。o（3 3）突变基因文库的构建：将获得的突变重组基因插入到）突变基因文库的构建：将获得的突变重组基因插入到表达载体中的构建突变库。表达载体中的构建突变库。o（4 4）突变体酶的表达：将载体转入受体细胞表达变异酶。）突变体酶的表达：将载体转入受体细胞表达变异酶。o（5 5）目的酶的鉴定：利用筛选和选择方法确定有益的特性）目的酶的鉴定：利用筛选和选择方法确定有益的特性克隆。克隆。o（6 6）分离改良基因并重复上述过程，直至获得所需性质的）分离改良基因并重复上述过程，直至获得所需性质的蛋白质。蛋白质。50定向进化的一般过程：不仅能够改造单个蛋白质分子，而且可以改造酶分子的体外定向进化原理酶分子的体外定向进化原理51酶分子的体外定向进化原理51定向进化策略oError prone PCR 易错PCRoDNA shuffling DNA改组oexon shuffling 外显子改组oHybrid enzyme 杂合酶oRandom-proming in vitro recombination PCR 体外随机引发重组oStagger extension process step 交错延伸oRandom-site-directed mutagenesis in vitro 随机定向突变52定向进化策略Error prone PCR 易错PCR52易错易错PCRPCR技术为代表的无性进化技术为代表的无性进化o无性突变是向单一酶分子基因内随机引入突变，制造突变无性突变是向单一酶分子基因内随机引入突变，制造突变酶库以便筛选。主要的手段包括易错酶库以便筛选。主要的手段包括易错PCRPCR，盒式诱变，随，盒式诱变，随机机/定位诱变等。定位诱变等。o易错易错PCRPCR是在采用是在采用TaqTaq酶进行酶进行PCRPCR扩增目的基因时，通过调扩增目的基因时，通过调整反应条件，例如：提高整反应条件，例如：提高MgMg2+2+离子浓度，加入离子浓度，加入MnMn2+2+离子，改离子，改变体系中四种变体系中四种dNTPdNTP的浓度等，然后选择或筛选需要的突变的浓度等，然后选择或筛选需要的突变体。其中关键之处在于突变率需要仔细调控。体。其中关键之处在于突变率需要仔细调控。53易错PCR技术为代表的无性进化无性突变是向单一酶分子基因内随o通常，经过一次突变的基因很难获得满意的结通常，经过一次突变的基因很难获得满意的结果，由此发展出连续易错果，由此发展出连续易错PCRPCR策略，即将一次策略，即将一次PCRPCR扩增得到的有用突变基因作为下一次扩增得到的有用突变基因作为下一次PCRPCR扩扩增的模板，连续反应的进行随机诱变，使每一增的模板，连续反应的进行随机诱变，使每一次获得的小突变基因作为下一次次获得的小突变基因作为下一次PCRPCR扩增的模板，扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每一次获得的小连续反复地进行随机诱变，使每一次获得的小突变累积而产生有益突变。突变累积而产生有益突变。54通常，经过一次突变的基因很难获得满意的结果，由此发展出连续易 DNA DNA改组技术为代表的有性进化改组技术为代表的有性进化oDNADNA改组又称有性改组又称有性PCRPCR，基本操作过程是从亚突变基因库，基本操作过程是从亚突变基因库中分离出来的中分离出来的DNADNA片断用脱氧核糖酶片断用脱氧核糖酶I I（DNase IDNase I）或超声）或超声波随机切割，得到的随机片断经过加引物的多次波随机切割，得到的随机片断经过加引物的多次PCRPCR循环，循环，在在PCRPCR循环过程中，随机片段之间互为模板和引物扩增，循环过程中，随机片段之间互为模板和引物扩增，直到获得全长的基因，这导致来自不同基因的片段之间直到获得全长的基因，这导致来自不同基因的片段之间的重组。的重组。o该策略将亲本基因群中的优势突变尽可能地组合在一起，该策略将亲本基因群中的优势突变尽可能地组合在一起，最终使酶分子某一特性进一步进化，或是两个或更多的最终使酶分子某一特性进一步进化，或是两个或更多的已优化的性质的结合。故优于连续易错已优化的性质的结合。故优于连续易错PCRPCR等无性进化策等无性进化策略。略。55 DNA改组技术为代表的有性进化DNA改组又称有性PCR，基DNADNA改组原理图改组原理图56DNA改组原理图56o体外随机重组法（体外随机重组法（random priming in random priming in vitro recombination RPR)-vitro recombination RPR)-有性进化有性进化oRPRRPR的基本原理是以单链的基本原理是以单链DNADNA为模板，配合一为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短同位点的短DNADNA片段，由于碱基的错配和错误片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短引发，这些短DNADNA片段中也会有少量的点突变。片段中也会有少量的点突变。在随后的在随后的PCRPCR反应中，它们互为引物进行合成，反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度。反复伴随组合，再组装成完整的基因长度。反复进行上述过程，直到获得满意的进化酶性质。进行上述过程，直到获得满意的进化酶性质。57体外随机重组法（random priming in vio交错延伸法（交错延伸法（staggered extension staggered extension pocess,StEP)pocess,StEP)o在在PCRPCR反应中，把常规的退火和延伸合并为一反应中，把常规的退火和延伸合并为一步，并大大缩短其反应时间，从而只能合成出步，并大大缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火，而继续延与体系内同时存在的不同模板退火，而继续延伸。此过程反复进行，直到产生完整长度的基伸。此过程反复进行，直到产生完整长度的基因片段，结果会产生间隔的含不同模板序列的因片段，结果会产生间隔的含不同模板序列的新生新生DNADNA分子。这样的新生分子。这样的新生DNADNA分子中，含有大分子中，含有大量的突变组合，将有利于新的酶性质的产生。量的突变组合，将有利于新的酶性质的产生。58交错延伸法（staggered extension poce5959基因家族之间的同源重组基因家族之间的同源重组o以单一的酶分子基因进行定向进化时，基因的多样性起以单一的酶分子基因进行定向进化时，基因的多样性起源于源于PCRPCR等反应中的随机突变，但由于突变大多是有害的等反应中的随机突变，但由于突变大多是有害的或者是中性的，采用这种过程集中有利突变的速度比较或者是中性的，采用这种过程集中有利突变的速度比较慢。慢。o如果如果从自然界中存在的基因家族出发，利用它们之间的从自然界中存在的基因家族出发，利用它们之间的同源顺序进行同源顺序进行DNADNA改组实现同源重组改组实现同源重组，由于每一个天然酶，由于每一个天然酶的基因都是经过千百万年的进化，且基因间存在较显