第五章目的基因的获取课件

第五章目的基因的第五章目的基因的获取取目的基因：目的基因：准准备要分离、改造、要分离、改造、扩增或表达的基因。增或表达的基因。第一第一第一第一节节 基因基因基因基因组组DNADNA片断化片断化片断化片断化一、限制性内切一、限制性内切酶法法用限制性内切用限制性内切酶把基因把基因组DNA切成不同大小的片断。切成不同大小的片断。酶切切由于由于带有粘性末端，有粘性末端，产物可以直接与物可以直接与载体体连接。接。1.1.优优点点点点2.缺点缺点目的基因内部也可能有目的基因内部也可能有该内切内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！的切点。目的基因也被切成碎片！BamH IBamH IBamH Igene二、随机片断化二、随机片断化二、随机片断化二、随机片断化1.限制性内切限制性内切酶局部消化法局部消化法控制内切控制内切酶的用量和消化的用量和消化时间，使基因，使基因组中的中的酶切位点只有一部分被随机切开。切位点只有一部分被随机切开。内切内切酶识别位点的碱基数位点的碱基数影响所切出的影响所切出的产物的物的长度和随机程度。度和随机程度。（1 1）限制性内切）限制性内切）限制性内切）限制性内切酶酶的的的的选选用原用原用原用原则则1）4bp的内切的内切酶平均每平均每46（4096）bp一个切点。一个切点。2）6bp的内切的内切酶平均每平均每44（256）bp一个切点。一个切点。随机程度高。如随机程度高。如Hae、AluI、Sau3A。内切内切酶粘性末端粘性末端能与常用克隆位点相能与常用克隆位点相连。（Sau3ABamH I）2.2.机械切割法机械切割法机械切割法机械切割法（1）超声波）超声波超声波超声波强烈作用于烈作用于DNA，可使其断裂成，可使其断裂成约300bp的随机片断。的随机片断。（2）高速）高速搅拌拌1500转/分下分下搅拌拌30min，可，可产生生约8kb的随机片断。的随机片断。1976年年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的提出了用化学方法合成基因的设想，并于想，并于1979年在年在science上上发表表了率先成功地合成大了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸杆菌酪氨酸tRNA基因的基因的论文。文。第二第二第二第二节节 化学合成目的基因化学合成目的基因化学合成目的基因化学合成目的基因一、目前常用的方法一、目前常用的方法磷酸二磷酸二酯法、法、磷酸三磷酸三酯法、法、亚磷酸三磷酸三酯法、法、固相合成法固相合成法自自动化合成法。化合成法。保保护dNTP的的5端端P 或或3端端-OH 用酸或碱的脱保用酸或碱的脱保护（1）原理）原理1.1.磷酸二磷酸二磷酸二磷酸二酯酯法法法法 带保保护的的单核苷酸核苷酸连接接保保证合成反合成反应的定向的定向进行。行。带5保保护的的单核苷酸与核苷酸与带3保保护的另一个的另一个单核苷酸以磷酸二核苷酸以磷酸二酯键连接起来。接起来。（2 2）合成）合成）合成）合成过过程程程程下一个下一个5端保端保护的的单核苷酸又可以同核苷酸又可以同3端保端保护的二核苷酸聚合。的二核苷酸聚合。原理与磷酸二原理与磷酸二酯法一法一样。只是参加反。只是参加反应的的单核苷酸都是在核苷酸都是在3端磷酸和端磷酸和5-OH上都先上都先连接了接了一个保一个保护基基团。2.2.磷酸三磷酸三磷酸三磷酸三酯酯法法法法 将第一个核苷酸的将第一个核苷酸的3-OH端固定在固相支持物上。端固定在固相支持物上。固相磷酸三固相磷酸三酯合成法合成法是目前通用的合成方法。是目前通用的合成方法。15合成的二核苷酸合成的二核苷酸连接接处有三个有三个酯键！固相磷酸三固相磷酸三固相磷酸三固相磷酸三酯酯合成合成合成合成过过程程程程固相支持物固相支持物结果是全保果是全保护的的DNA：5 DMT,3固相支持物固相支持物,核苷酸之核苷酸之间对氯苯。最后脱保苯。最后脱保护固相固相支持物支持物固相固相支持物支持物C化学合成的化学合成的DNA片断一般在片断一般在200bp以内。以内。二、二、二、二、化学合成化学合成化学合成化学合成DNADNA片断的片断的片断的片断的组组装装装装用用T4多核苷酸激多核苷酸激酶使各个片段的使各个片段的5端端带上磷酸。上磷酸。1.互互补连接法接法预先先设计合成的片断之合成的片断之间都有互都有互补区域，不同片断之区域，不同片断之间的互的互补区域能形成有区域能形成有断点的完整双断点的完整双链。（2 2）5端磷酸化端磷酸化（1 1）互）互补配配对（合成的（合成的DNADNA单链的的55端是端是-OH-OH）T4 DNA连接接酶T4多核苷酸激多核苷酸激酶使使5-OH磷酸化磷酸化完整的完整的DNA双双链（3 3 3 3）连连接接接接酶连酶连成完整双成完整双成完整双成完整双链链2.2.互互互互补补延伸延伸延伸延伸连连接法接法接法接法预先先设计的片断之的片断之间有局部互有局部互补区，可以相互作区，可以相互作为另一个片断延另一个片断延长的引物，用的引物，用DNA聚合聚合酶延伸成完整的双延伸成完整的双链。355353T4DNA连接接酶Klenow片段片段引物引物1.直接合成基因直接合成基因三、三、三、三、寡聚核苷酸化学合成的寡聚核苷酸化学合成的寡聚核苷酸化学合成的寡聚核苷酸化学合成的优优点点点点2.合成引物（合成引物（20mer左右）左右）（1 1）mRNA的含量很低，很的含量很低，很难作作cDNA3.合成探合成探针序列序列4.定点突定点突变合成合成合成合成带有定点突有定点突变的基因片断。的基因片断。（2）有些基因比）有些基因比较短，化学合成短，化学合成费用用较低低DNADNA合成合成合成合成仪仪5.合成人工接合成人工接头或或衔接物接物含有各种含有各种酶切位点人工接切位点人工接头（Adaptor）或）或衔接物（接物（Linker）序列。）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptor 将某种生物将某种生物细胞的整个基因胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当些片断都与适当的的载体体连接，引入相接，引入相应的宿主的宿主细胞中保存和胞中保存和扩增。增。理理论上上讲，这些重些重组载体上体上带有了有了该生物体的全部基因，称生物体的全部基因，称为基因文基因文库。一、基因文一、基因文库的构建的构建1.基因文基因文库（gene library）第三第三第三第三节节 目的基因的保存和目的基因的保存和目的基因的保存和目的基因的保存和扩扩增增增增（2 2）目前常用的目前常用的载体体 2.2.构建基因文构建基因文构建基因文构建基因文库库的的的的载载体体体体选选用用用用载体能体能够容容载的的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重所需要的重组子的数目。子的数目。载体容量越大，所要求的体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重片断数目越少，所需的重组子越少。子越少。（1 1）对载体的要求体的要求 载体系列：体系列：容量容量为 24 kpcosmid载体：体：容量容量为 50 kb YAC：容量容量为 1 MbBAC:容量容量为 300 kb断点完全随机，片断断点完全随机，片断长度合适于度合适于载体体连接。不能用一般的限制性内切接。不能用一般的限制性内切酶消化法。消化法。（1）染色体）染色体DNA大片段的制大片段的制备3.3.基因文基因文基因文基因文库库构建的一般步构建的一般步构建的一般步构建的一般步骤骤超声波（超声波（300bp）或机械）或机械搅拌（拌（8kb）。）。物理切割法：物理切割法：内切内切酶Sau3A进行局部消化。可得到行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。的随机片断。酶切法：切法：（2 2）载载体与基因体与基因体与基因体与基因组组DNADNA大片段的大片段的大片段的大片段的连连接接接接 粘性末端直接粘性末端直接连接接载体与外源体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。大片段的两个末端都有相同的粘性末端。如：如：Sau3A与与BamHI的的酶切末端。切末端。直接直接连接、人工接接、人工接头或同聚物加尾。或同聚物加尾。人工接人工接人工接人工接头头法（法（法（法（adapteradapter）人工合成的限制性内切人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。粘性末端片断。各种各种酶的接的接头可以向公司定做或可以向公司定做或购买。接上人工接接上人工接头粘性末端粘性末端CCCCCC末端末端转移移酶粘性末端粘性末端 同聚物加尾同聚物加尾4.4.基因基因基因基因组组文文文文库库的大小的大小的大小的大小一个文一个文库要包含要包含99%的基因的基因组DNA时所需要的克隆数目。所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文文库包含了整个基因包含了整个基因组DNA的概率（的概率（99%）f:插入插入载体的体的DNA片断的平均片断的平均长度占整个基因度占整个基因 组DNA的百分数的百分数N：所需的重：所需的重组载体数（克隆数）体数（克隆数）例如：人的基因例如：人的基因组是是 3109 bp，插入，插入DNA片断的平均片断的平均长度如果是度如果是1.7104 bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61GfN=4.61GfG：Genome大小；大小；f：fragment大小大小N=4.61Gf=4.6131091.7104=8.11051.cDNA以以mRNA为模板逆模板逆转录出的出的DNA称称cDNA。2.cDNA library二、二、二、二、cDNAcDNA文文文文库库的构建的构建的构建的构建mRNAcDNA3355反反转录酶引物引物利用某种生物的利用某种生物的总mRNA合成合成cDNA，再将，再将这些些cDNA与与载体体连接，接，转入入细菌菌细胞中胞中进行保存行保存和和扩增，称增，称cDNA文文库。（1 1）不含内含子序列。）不含内含子序列。）不含内含子序列。）不含内含子序列。（2 2）可以在）可以在）可以在）可以在细细菌中直接表达。菌中直接表达。菌中直接表达。菌中直接表达。（3 3）包含了所有）包含了所有）包含了所有）包含了所有编码编码蛋白蛋白蛋白蛋白质质的基因。的基因。的基因。的基因。（4 4）比）比）比）比DNADNA文文文文库库小的多，容易构建。小的多，容易构建。小的多，容易构建。小的多，容易构建。4.4.构建构建构建构建cDNAcDNA文文文文库库的一般步的一般步的一般步的一般步骤骤（1）总RNA（total RNA）提取）提取3.cDNA文文库的特点的特点提取提取总RNA有商有商业化的化的试剂盒（盒（kit）。）。分离分离mRNA用商用商业化的化的Oligo dT纤维柱。柱。利用利用mRNA都含有一段都含有一段polyA尾巴，将尾巴，将mRNA从从总RNA（rRNA、tRNA等）等）中分离中分离纯化。化。mRNA只占只占总RNA的的1%-2%。（2 2）mRNAmRNA的分离的分离的分离的分离纯纯化化化化 原理原理 mRNA的分离的分离纯化化Column（柱）（柱）反反转录酶（3 3）cDNAcDNA的合成的合成的合成的合成 cDNA第一第一链合成合成逆逆转录酶能以能以RNA为模板合成模板合成DNA。用用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一的第一链。mRNAcDNA355AAAAAAATTTTTTTOligo dT引物引物用碱用碱处理理或用或用RNaseH降解降解mRNA-DNA杂交分子中的交分子中的mRNA。mRNAcDNA3355反反转录酶引物引物mRNAcDNA第一第一链3355引物引物cDNA第一第一链35引物引物 降解降解降解降解mRNAmRNA模板模板模板模板或或RNaseH碱碱剩下的剩下的cDNA单链的的3末端一般形成一个弯回来的双末端一般形成一个弯回来的双链发卡卡结构（机理不明），可成构（机理不明），可成为合成合成第二条第二条cDNA链的引物。用的引物。用DNA聚合聚合酶合成第二合成第二链DNA.。cDNA第一第一链5cDNA第二第二链合成合成DNA聚合聚合酶cDNA第一第一链cDNA第二第二链53 cDNAcDNA第二第二第二第二链链合成合成合成合成去掉去掉去掉去掉发发卡卡卡卡结结构构构构核酸核酸酶S1用核酸用核酸酶S1可以切掉可以切掉发卡卡结构（但构（但这会会导致致cDNA中有用的序列被切掉！）。中有用的序列被切掉！）。cDNA第一第一链cDNA第二第二链53cDNA第一第一链cDNA第二第二链5353这种种酶能能识别mRNA-cDNA杂交分子中的交分子中的mRNA，并将其降解成，并将其降解成许多小片断。多小片断。妙用妙用妙用妙用RNaseHRNaseH小片断正好成小片断正好成为DNA聚合聚合酶的引物，用来合成的引物，用来合成冈崎片断。崎片断。DNA Pol I除去引物并修除去引物并修补后再使用后再使用DNA连接接酶连成一整条成一整条DNA链。mRNAcDNA35反反转录酶引物引物mRNAcDNA第一第一链35引物引物mRNAcDNA第一第一链35mRNAmRNADNA聚合聚合酶DNA聚合聚合酶cDNA第二第二链cDNA第一第一链35RNaseHDNA ligase去引物去引物在双在双链cDNA末端接上人工接末端接上人工接头，即可与，即可与载体体连接，接，转入受体菌。入受体菌。或借助末端或借助末端转移移酶给载体和双体和双链cDNA的的3端分端分别加上几个加上几个C或或G，成，成为粘性末端。粘性末端。5.5.5.5.cDNAcDNA与与与与载载体体体体连连接：接：接：接：接上人工接接上人工接头粘性末端粘性末端CCCCCC末端末端转移移酶6.cDNA6.cDNA文文文文库库的大小的大小的大小的大小一个一个cDNA文文库要包含要包含99%的的mRNA时所需要的克隆数目。所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文文库包含了完整包含了完整mRNA的概率（的概率（99%）:某一种低丰度（不足某一种低丰度（不足14份拷份拷贝）mRNA占占细胞整个胞整个mRNA的比例的比例N：所需的重：所需的重组载体数（克隆数）体数（克隆数）1n1n三、文三、文三、文三、文库库的的的的查询查询（screeningscreening）用目的基因探用目的基因探针与文与文库中的重中的重组载体体进行行Southern blot杂交。交。文文库载体体探探针电泳后泳后杂交放射自交放射自显影影测序分析序分析第四第四第四第四节节 目的基因的分离和目的基因的分离和目的基因的分离和目的基因的分离和扩扩增增增增一、目的基因的分离一、目的基因的分离1.1.探探探探针针柱分离特异柱分离特异柱分离特异柱分离特异mRNAmRNA根据已知的基因序列合成探根据已知的基因序列合成探针，结合到合到纤维素柱上，用来分离素柱上，用来分离纯化化该基因的基因的mRNA。富集特定基因的富集特定基因的mRNA或或cDNA模板。模板。纤维柱柱探探针DNA探探针DNA探探针DNA探探针DNATotal mRNA纤维柱柱探探针DNA探探针DNA探探针DNA探探针DNA过柱柱与探与探针碱基互碱基互补的的mRNA结合到柱上，其它合到柱上，其它mRNA流走。流走。特异特异mRNA洗脱洗脱RT-PCR2.mRNA2.mRNA消解消解消解消解杂杂交交交交原理：原理：羟基磷灰石柱基磷灰石柱结合合单链DNA-RNA或或DNA-DNA双双链，不，不结合合单链DNA。（Hydroxylapatite column）从表达从表达A蛋白和不表达蛋白和不表达A蛋白的蛋白的组织细胞中分胞中分别提取和分离提取和分离总mRNA。将表达将表达A蛋白的蛋白的mRNA合成合成cDNA第一第一链。再同不表达。再同不表达A蛋白的蛋白的总mRNA杂交成交成cDNA-mRNA双双链。不能不能杂交的交的cDNA就包括特异表达的就包括特异表达的A基因的基因的cDNA单链。用用羟磷灰石柱收集磷灰石柱收集单链cDNA，合成，合成为双双链DNA进行行扩增、克隆、增、克隆、测序。序。AAA组织B组织总mRNA（A）总mRNA（B）含蛋白含蛋白A的的mRNA不含蛋白不含蛋白A的的mRNA总cDNA第一第一链A杂交交内含蛋白内含蛋白A 的的cDNA羟磷灰石柱磷灰石柱过柱柱吸收吸收RNA-DNA单链滤过羟磷灰石柱磷灰石柱BAPCR16cDNA文文库3.mRNA3.mRNA差异差异差异差异显显示示示示PCRPCR（DD RT-PCRDD RT-PCR）mRNA differential display RT-PCR（1）3端的端的锚定引物定引物Oligo(dT)引物的引物的3端加两个核苷酸（倒数第二个不再是端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T）。）。AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA35NMTTTTTTTTM：A、G or CN:A、G、T or C53（2 2）1212种种种种锚锚定引物定引物定引物定引物AGTTTTTTTT53CGTTTTTTTT53GGTTTTTTTT53TGTTTTTTTT53AATTTTTTTT53CATTTTTTTT53GATTTTTTTT53TATTTTTTTT53ACTTTTTTTT53CCTTTTTTTT53GCTTTTTTTT53TCTTTTTTTT53（3 3）55端的随即引物端的随即引物端的随即引物端的随即引物10 mer AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA35NMTTTTTTTT53扩增增cDNA第一第一链。RTNMTTTTTTTT5cDNA3NNNNNNNNNN53NNNNNNNNNN53cDNA第二第二链，并，并PCR（4 4）随机引物与）随机引物与）随机引物与）随机引物与锚锚定引物成定引物成定引物成定引物成对扩对扩增增增增12种种锚定引物，若与定引物，若与20种随机引物，可种随机引物，可组成成240组引物。引物。引物引物组合：合：240组在能分出在能分出20000多条多条带！实验结果：果：如果每条如果每条带相当于一种相当于一种mRNA，20000 mRNA基本上反映了一种特定基本上反映了一种特定细胞中全部的胞中全部的mRNA。在在测序胶上，每序胶上，每组扩出出50-100条条长度度为100-500bp的的带。（5 5）随机）随机）随机）随机-锚锚定引物定引物定引物定引物PCRPCR的的的的产产物物物物电电泳比泳比泳比泳比较较不同不同组织的的240组引物引物组合合PCR产物在物在测序胶中序胶中电泳。泳。选择有差异的有差异的带，进一步一步PCR作探作探针。筛选文文库，找到差，找到差别基因的全基因的全长序列。序列。二、二、二、二、PCRPCR扩扩增增增增获获得目的基因得目的基因得目的基因得目的基因1.直接从基因直接从基因组中中扩增增（1）提取基因）提取基因组DNA作模板作模板（2）根据目的基因序列）根据目的基因序列设计引物引物（3）PCR扩增增真核生物基因真核生物基因组含有内含子！含有内含子！适合适合扩增原核生物基因。增原核生物基因。原核基因原核基因组部分部分原核原核细胞胞提取基因提取基因组DNAPCR扩增增（1）提取基因）提取基因组 total RNA（2）反）反转录合成合成总cDNA作模板作模板（4）PCR扩增增（3）根据目的基因序列）根据目的基因序列设计引物引物2.2.从从从从mRNAmRNA中中中中扩扩增增增增:RT-PCR:RT-PCR原核生物不易得到原核生物不易得到mRNA，也不含有，也不含有polyA尾。尾。适合适合扩增真核生物基因。增真核生物基因。目的基因目的基因的引物的引物1反反转录成目的基因成目的基因cDNA第一第一链目的基因目的基因的引物的引物2目的目的 基因基因cDNA第二第二链PCRmRNA克隆克隆克隆克隆外源外源外源外源基因基因基因基因谢谢大家！