cDNA文库与EST序列分析ppt

CollegeofLifeScienceandBiotechnology组员任务分配组员任务分配陈陈威：统筹安排、资料收集威：统筹安排、资料收集丁立建：丁立建：cDNA文库应用、资料收集文库应用、资料收集黄显军：背景简介黄显军：背景简介刘振英：刘振英：cDNA文库构建原理、资料收集文库构建原理、资料收集毛海花、上官巧灵、朱竹君：毛海花、上官巧灵、朱竹君：EST序列分析序列分析第1页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology目录目录一、背景简介一、背景简介二、二、cDNA文库构建原理文库构建原理三、三、cDNA文库的应用文库的应用四、四、EST序列分析序列分析五、参考文献五、参考文献第2页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnologycDNA文库构建及文库构建及EST序列分析序列分析背景简介背景简介黄显军黄显军第3页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnologycDNA基因文库：基因文库：某生物某一发育时期所转录的某生物某一发育时期所转录的mRNA经反转录经反转录形成的形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。的集合。第4页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology1.cDNA文库背景简介文库背景简介1.1cDNA文库产生前的技术概况文库产生前的技术概况随着生物及信息技术的迅速发展，寻找新基因、克隆新基因、进随着生物及信息技术的迅速发展，寻找新基因、克隆新基因、进而研究基因的功能已成为功能基因组研究中的一项重要工作。而研究基因的功能已成为功能基因组研究中的一项重要工作。在过去寻找新基因的方法有：在过去寻找新基因的方法有：a）消减杂交）消减杂交b）mRNA差异显示差异显示c）cDNA的代表性差异显示分析法的代表性差异显示分析法d）差异消减展示等方法）差异消减展示等方法这些方法在新基因的发现方面都各有其独特的优势，可寻找出一这些方法在新基因的发现方面都各有其独特的优势，可寻找出一些差异表达序列，但这些差异表达序列大部分情况都是不完整的基因。些差异表达序列，但这些差异表达序列大部分情况都是不完整的基因。第5页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology1.2cDNA文库的产生文库的产生由于以前技术的缺点，目前，比较可行而且应用较多由于以前技术的缺点，目前，比较可行而且应用较多的方法主要是的方法主要是cDNA文库的筛选。文库的筛选。一方面一方面cDNA文库只代表一定时期一定条件下正在文库只代表一定时期一定条件下正在表达的基因，是整个真核基因组中的少部分序列，因此表达的基因，是整个真核基因组中的少部分序列，因此cDNA克隆的复杂程度比直接从基因组克隆的要小得多。克隆的复杂程度比直接从基因组克隆的要小得多。另一方面由于每个另一方面由于每个cDNA克隆只代表一种克隆只代表一种mRNA序列，因此在基因克隆过程中出现假阳性的概率比较低。序列，因此在基因克隆过程中出现假阳性的概率比较低。所以所以cDNA文库的构建已成为当前分子生物学研究文库的构建已成为当前分子生物学研究和基因工程操作的基础。和基因工程操作的基础。第6页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology1.3.为什么要构建为什么要构建cDNA文库？文库？cDNA便于克隆和大量表达，它不像基因组便于克隆和大量表达，它不像基因组含有内含子而难于表达，因此可以从含有内含子而难于表达，因此可以从cDNA文库文库中筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基中筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。因的表达。第7页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology1.4.怎么构建怎么构建cDNA文库？文库？第8页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology1.5.cDNA文库构建后能干什么？文库构建后能干什么？1)可保护濒危珍惜生物资源可保护濒危珍惜生物资源2)可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针3)可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究第9页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology1.6.cDNA文库的优势及价值文库的优势及价值1）优势：）优势：cDNA在研究具体某类特定细胞中基因在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方面具有特组的表达状态及表达基因的功能鉴定方面具有特殊的优势。殊的优势。2）价值：在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、）价值：在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。基因文库。第10页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology2.EST序列分析背景简介序列分析背景简介克隆全长克隆全长cDNA序列的传统途径：序列的传统途径：a)噬斑原位杂交的方法噬斑原位杂交的方法b)采用采用PCR的方法的方法缺点：工作量大、耗时、耗材缺点：工作量大、耗时、耗材这些传统方法已满足不了人类基因组时代迅这些传统方法已满足不了人类基因组时代迅猛发展的要求。猛发展的要求。第11页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology2.1.EST序列分析的产生序列分析的产生随着人类基因组计划的开展，在基因结构、定位、表随着人类基因组计划的开展，在基因结构、定位、表达和功能研究等方面都积累了大量的数据，如何充分利用达和功能研究等方面都积累了大量的数据，如何充分利用这些已有的数据资源，加速人类基因克隆研究，同时避免这些已有的数据资源，加速人类基因克隆研究，同时避免重复工作，节省开支，已成为一个急迫而富有挑战性的课重复工作，节省开支，已成为一个急迫而富有挑战性的课题摆在我们面前。题摆在我们面前。采用生物信息学方法延伸表达序列标签（采用生物信息学方法延伸表达序列标签（ESTs）序）序列，获得基因部分乃至全长列，获得基因部分乃至全长cDNAycg，将为基因克隆和，将为基因克隆和表达分析提供空前的动力，并为生物信息学功能的充分发表达分析提供空前的动力，并为生物信息学功能的充分发挥提供广阔的空间。挥提供广阔的空间。第12页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology2.2.EST技术的作用价值技术的作用价值EST技术最常见的用途是基因识别，传统的全基因组技术最常见的用途是基因识别，传统的全基因组测序并不是发现基因最有效率的方法，这一方法显得即昂测序并不是发现基因最有效率的方法，这一方法显得即昂贵又费时。因为基因组中只有贵又费时。因为基因组中只有2%的序列编码蛋白质，因的序列编码蛋白质，因此一部分科学家支持首先对基因的转录产物进行大规模测此一部分科学家支持首先对基因的转录产物进行大规模测序，即从真正编码蛋白质的序，即从真正编码蛋白质的mRNA出发，构建各种出发，构建各种cDNA文库，并对库中的克隆进行大规模测序。文库，并对库中的克隆进行大规模测序。Adams等提出的表达序列标签的概念标志着大规模等提出的表达序列标签的概念标志着大规模cDNA测序时代的到来。虽然测序时代的到来。虽然ESTs序列数据对不精确，精序列数据对不精确，精确度最高为确度最高为97%，但实践证明，但实践证明EST技术可大大加速新基因技术可大大加速新基因的发现与研究。的发现与研究。第13页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology目录目录一、背景简介一、背景简介二、二、cDNA文库构建原理文库构建原理三、三、cDNA文库的应用文库的应用四、四、EST序列分析序列分析五、参考文献五、参考文献第14页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnologycDNA文库的构建文库的构建刘振英刘振英第15页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology为什么构建cDNA文库第16页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology真核生物基因结构原核生物有很大差异。真核生物基因结构原核生物有很大差异。真核生物的基因不能直接在原核生物中表达真核生物的基因不能直接在原核生物中表达 ,只有将加工成只有将加工成熟的熟的mRNAmRNA经逆转录合成互补的经逆转录合成互补的DNADNA（cDNAcDNA），），并并连接相应的原核连接相应的原核细胞表达控制元件，才能在原核生物中表达。细胞表达控制元件，才能在原核生物中表达。mRNAmRNA的不稳定性的不稳定性 真核细胞的基因通常只有一小部分进行表达，由于真核细胞的基因通常只有一小部分进行表达，由于mRNAmRNA的不的不稳定性，因而对真核基因的表达和相关的稳定性，因而对真核基因的表达和相关的mRNAmRNA研究，一般都是通研究，一般都是通过对过对cDNAcDNA的研究来进行。的研究来进行。第17页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnologyBut如何构建cDNA文库第18页/共73页CollegeofLifeScienceandBLOGO第19页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnologymRNA的分离制备的分离制备寡聚胸苷酸寡聚胸苷酸oligo(dT)纤维素或琼脂糖亲和层纤维素或琼脂糖亲和层析法析法，在高盐缓冲溶液中在高盐缓冲溶液中poly(A)RNA与与oligo(dT)结合，低盐缓冲溶液使它们解离。结合，低盐缓冲溶液使它们解离。LOGO第20页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnologycDNA cDNA 第一链的合成第一链的合成Oligo（dT）引导的）引导的cDNA合成合成高浓度高浓度的的Oligo（dT）引物与）引物与mRNA的的3末端的末端的poly（A）配对。）配对。优点：逆转录反应基本被限定在以优点：逆转录反应基本被限定在以mRNA为模板，为模板，故即使样品中混有少量的故即使样品中混有少量的rRNA时不会影响时不会影响cDNA文库构文库构建的质量。建的质量。缺点：只能从缺点：只能从mRNA3末端其起始引发末端其起始引发cDNA的合成，的合成，由于逆转录酶的能力有限，平均合成出的由于逆转录酶的能力有限，平均合成出的cDNA长度在长度在1kb以下，因此合成以下，因此合成cDNA通常会缺少通常会缺少mRNA5端的重端的重要信息。要信息。LOGO第21页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology第22页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology随机引物引导的随机引物引导的cDNA合成合成采用采用610个随机碱基的寡核苷酸短片段来锚定个随机碱基的寡核苷酸短片段来锚定mRNA并作为反转录的起点。由于随机引物可能在一并作为反转录的起点。由于随机引物可能在一条条mRNA链上有多个结合位点而从多个位点同时发生链上有多个结合位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特长的反转录，比较容易合成特长的mRNA分子的分子的5端序列端序列。优点：克服了优点：克服了oligo(dT)合成合成cDNA时缺少时缺少5端序端序列列的缺点，的缺点，能更有效的反映出表达能更有效的反映出表达mRNA全长的序列全长的序列信息。信息。缺点：对缺点：对mRNA样品的纯度要求苛刻。样品的纯度要求苛刻。第23页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnologycDNA cDNA 第第二二链的合成链的合成自身引导法自身引导法置换合成法置换合成法PCR法法第24页/共73页CollegeofLifeScienceandBLOGO方法一：自身引导法方法一：自身引导法第25页/共73页CollegeofLifeScienceandBLOGO方法二：置换合成法方法二：置换合成法第26页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology方法三：方法三：PCR法法第27页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnologycDNA的的克隆克隆（1 1）修饰）修饰cDNAcDNA两端两端（2 2）cDNAcDNA与载体相连与载体相连（3 3）导入宿主细胞）导入宿主细胞:重组体在一定条件下导入宿主细胞培养或保存宿主细重组体在一定条件下导入宿主细胞培养或保存宿主细胞必须是来自一个细胞的克隆体，以保证它们的遗传性状胞必须是来自一个细胞的克隆体，以保证它们的遗传性状相同相同。LOGO第28页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnologyhttp:/ 第40页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnologycDNA文库插入片段长度的文库插入片段长度的PCR分析分析第41页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology三疣梭子蟹是我国沿海重要养殖品种之一三疣梭子蟹是我国沿海重要养殖品种之一,近近年来养殖病害呈逐年上升趋势年来养殖病害呈逐年上升趋势,制约了三疣梭制约了三疣梭子蟹养殖产业的健康可持续发展。为大规模子蟹养殖产业的健康可持续发展。为大规模克隆三疣梭子蟹免疫相关基因克隆三疣梭子蟹免疫相关基因,研究其免疫基研究其免疫基因的功能和免疫机制因的功能和免疫机制,构建了三疣梭子蟹血细构建了三疣梭子蟹血细胞全长胞全长cDNA文库可以提供三疣梭子蟹病害文库可以提供三疣梭子蟹病害防治理论基础防治理论基础。为深入研究免疫相关基因的。为深入研究免疫相关基因的功能和免疫机制奠定基础。功能和免疫机制奠定基础。研究背景：研究背景：第42页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology1、三疣梭子蟹采自浙江海域;2、总RNA提取Trizol试剂盒(TrizolPlusRNAPurificationKit)与mRNA分离试剂盒(FastTrack2.0Kit)购自Invitrogen公司;3.、SMARTTMcDNALibraryConstructionKit与Advantage2PCRKit购自Clontech公司;pGEM2TeasyT载体购自Promega公司。其余试剂均为进口或国产分析纯试剂。材料：材料：第43页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnologyFastTrack2.0Kit试剂盒，通过试剂盒，通过poly(T)纤维素柱进行亲和纤维素柱进行亲和层析层析,从三疣梭子蟹血细胞总从三疣梭子蟹血细胞总RNA中得中得polyA+mRNA。成年雄性三疣梭子蟹采集后饲养于恒温水族箱成年雄性三疣梭子蟹采集后饲养于恒温水族箱(25)取取1只蟹收集血细胞只蟹收集血细胞采用采用Trizol试剂盒提取三疣梭子蟹血细胞总试剂盒提取三疣梭子蟹血细胞总RNA.1.2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,同时测定同时测定OD260和和OD280值值,分析所提取分析所提取RNA的浓度和纯度。的浓度和纯度。方法：方法：第44页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology转化至高效感受态细胞转化至高效感受态细胞DH10B,在在37、200r/min培养培养1h,加入加入5mL预冷预冷LB培养基培养基(含含25%甘油甘油),即即为全长为全长cDNA原始文库原始文库。polyA+mRNA在反转录酶作用下转录合成在反转录酶作用下转录合成cDNA第第1链链Advantage2PCRKit(Clontech)试剂盒作用下合成试剂盒作用下合成cDNA第第2链链,并取并取5L凝胶电泳检测凝胶电泳检测通过ChromaSPIN2400分级分离,除去小于500bp的片段处理后的处理后的dscDNA与载体与载体pGEM2TEASY在在16过夜连接过夜连接第45页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnologycDNA文库的质量鉴定与随机测序文库的质量鉴定与随机测序文库滴度的鉴定文库滴度的鉴定文库重组率及平均插入片段的鉴定文库重组率及平均插入片段的鉴定部分序列测定及分析部分序列测定及分析第46页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology总总RNA电泳分析电泳分析方法：方法：第47页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology克隆插入片段的克隆插入片段的PCR检测检测第48页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology丁立建第49页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnologyEST序列分析序列分析原理原理方法方法应用应用毛海花、上官巧灵、朱竹君毛海花、上官巧灵、朱竹君第50页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnologyESTs（ExpressedSequencetags）是从已建好的）是从已建好的cDNA库中随库中随机取出一个克隆，从机取出一个克隆，从5末端或末端或3末端对插入的末端对插入的cDNA片段进行一轮单向片段进行一轮单向自动测序，所获得的约自动测序，所获得的约60500bp的一段的一段cDNA序列。序列。原理原理第51页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology分析分析EST序列的目的序列的目的获得获得EST序列的方法序列的方法分析分析EST序列的方法序列的方法如何提交如何提交EST序列序列方法方法第52页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology分析分析EST序列的目的序列的目的基因识别基因识别获得全长获得全长cDNA研究基因可变剪接类型研究基因可变剪接类型SNP的发现的发现表达量比较表达量比较第53页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology获得获得EST序列的方法序列的方法从数据库下载从数据库下载dbESTwww.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/CGAPhttp:/cgap.nci.nih.gov/UniGenewww.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/TigrGeneIndexwww.tigr.org/tdb/tgi/cDNA文库测序文库测序第54页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology分析分析EST序列的方法序列的方法RawESTPre-processingclusteringAssemblyAnnotationEST分析流程分析流程第55页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology1.RawEST从从cDNA文库随机挑取单一克隆进行文库随机挑取单一克隆进行5或或3端测序；端测序；测序方向的选择，根据不同的实验目的选择不同的测序方向：测序方向的选择，根据不同的实验目的选择不同的测序方向：5端端5上游非翻译区校短且含有较多的调控信息。一般在寻找新基因或研上游非翻译区校短且含有较多的调控信息。一般在寻找新基因或研究基因差异表达时用究基因差异表达时用5端端EST较好，大部分较好，大部分EST计划都是选用计划都是选用5端进行端进行测序的，而且从测序的，而且从5端测序有利于将端测序有利于将EST拼接成较长的基因序列。拼接成较长的基因序列。3端端3端端mRNA有一有一20200bp的的plyA结构，同时靠近结构，同时靠近plyA又有特异性的又有特异性的非编码区，所以从非编码区，所以从3端测得端测得EST含有编码的信息较少但研究也表明，含有编码的信息较少但研究也表明，10的的mRNA3端有重复序列，这可以作为端有重复序列，这可以作为SSR标记；非编码区有品标记；非编码区有品种的特异性，可以作为种的特异性，可以作为STS标记标记两端测序两端测序获得更全面的信息。获得更全面的信息。第56页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology2.Preprocessing去除低质量的序列（去除低质量的序列（Phred）应用应用BLAST、RepeatMasker或或Crossmatch遮蔽数据组中不属于表遮蔽数据组中不属于表达的基因的赝象序列达的基因的赝象序列(artifactualsequences)载体序列载体序列(ftp:/ncbi.nlm.nih.gov/repository/vector)重复序列重复序列(RepBase,http:/www.girinst.org)污染序列污染序列(如核糖体如核糖体RNA、细菌或其它物种的基因组、细菌或其它物种的基因组DNA等等)去除其中的去除其中的镶嵌克隆镶嵌克隆。最后去除长度小于最后去除长度小于100bp的序列。的序列。第57页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology镶嵌克隆的识别镶嵌克隆的识别Backtobackpoly(A)+tailsLinkertolinkerinmiddleofthesequenceBlastn/Blastxsearch第58页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology3.Clustring聚类作用：聚类作用：产生较长的一致性序列产生较长的一致性序列(consensussequence)，用于注释，用于注释降低数据的冗余，纠正错误数据降低数据的冗余，纠正错误数据可以用于检测选择性剪切可以用于检测选择性剪切ESTs聚类的数据库主要有三个：聚类的数据库主要有三个：UniGene(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene)TIGRGeneIndices(http:/www.tigr.org/tdb/tgi/)STACK(http:/www.sanbi.ac.za/Dbases.html)聚类的目的就是将来自同一个基因或同一个转录本的具有重叠部分聚类的目的就是将来自同一个基因或同一个转录本的具有重叠部分(overlapping)的的ESTs整合至单一的簇整合至单一的簇(cluster)中。中。第59页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology常用的拼接软件常用的拼接软件Phraphttp:/www.genome.washington.edu/UWGC/analysistools/Phrap.cfmCAP3(XiaoqiuHuang,huangmtu.edu)d2_cluster(http:/www.sanbi.ac.za/)第60页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology错拼漏拼的原因错拼漏拼的原因错拼错拼3断断polyA尾巴的存在尾巴的存在镶嵌镶嵌clone的存在的存在重复序列重复序列漏拼漏拼拼接参数太严格拼接参数太严格重复序列重复序列镶嵌镶嵌clone第61页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology解决方法解决方法调整拼接参数调整拼接参数EST和和consensus进行对比进行对比根据注释结果来判断根据注释结果来判断第62页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology4.Cluster的连接的连接利用利用cDNA克隆的信息和克隆的信息和5，3端端Reads的信息，不同的的信息，不同的Cluster可以连接在一起。可以连接在一起。第63页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology5.基因注释基因注释注释：注释：序列联配序列联配，一级序列同源对比，一级序列同源对比Blastn，Blastx蛋白质功能域搜索蛋白质功能域搜索(二结构比对二结构比对)，蛋白质结构，蛋白质结构域和功能位点预测域和功能位点预测PfamInterpro第64页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology后续分析后续分析比较基因组学分析比较基因组学分析基因表达谱分析基因表达谱分析新基因研究新基因研究基因可变剪切分析基因可变剪切分析实验验证实验验证MicroArrayGeneChipRTPCRNorthenbloting第65页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology如何提交如何提交EST序列序列提交至提交至dbEST发邮件至发邮件至batchsubncbi.nlm.nih.gov准备以下文件准备以下文件a.Publicationb.Libraryc.Contactd.EST第66页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology应用应用日本血吸虫（中国大陆株）表达基因的分离和序日本血吸虫（中国大陆株）表达基因的分离和序列测定列测定第67页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology研究背景研究背景1995年，年，Fanco首先应用首先应用EST法对曼氏血吸虫法对曼氏血吸虫(Sm)的基因进行了分离的基因进行了分离和序列测定和序列测定。到到目目前为止前为止(1999.5)，在，在NCBI的的GenBank中已收录的血中已收录的血吸虫吸虫EST序列序列9737条，条，其中其中Sm有有8216条条，日本血吸虫日本血吸虫(Sj)有有834条条，分别占分别占GenBank中已收录的中已收录的Sm和和Sj基因序列的基因序列的94.26和和86.60。尽管目前对尽管目前对SmEST的分离与测定进展迅速，的分离与测定进展迅速，但已知但已知SjEST序列只占序列只占Sj表达基因数的表达基因数的4.17，所所以以继续开展日本血吸虫编码基因的分离和序列继续开展日本血吸虫编码基因的分离和序列测测定仍具有重要的意义。定仍具有重要的意义。第68页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology材料材料日本血吸虫（中国大陆株）成虫日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库由南京医科大学陈淑贞教授文库由南京医科大学陈淑贞教授构建。该文库系采用定向克隆构建于构建。该文库系采用定向克隆构建于gt11/1090系统中，所构建的基系统中，所构建的基因表达文库容量为因表达文库容量为3.13106重组子。重组子。第69页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology方法方法设计并合成引物设计并合成引物单个重组噬菌体的随机挑选单个重组噬菌体的随机挑选重组克隆重组克隆PCR直接序列分析直接序列分析ESTs的同源性分析的同源性分析第70页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology结果与分析结果与分析重组克隆的分离及重组克隆的分离及PCR鉴定鉴定第71页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology未知基因未知基因EST序列的确认序列的确认获得新基因获得新基因EST序列进入序列进入NCBI的序列进入编号，其序列编号分别为的序列进入编号，其序列编号分别为AI725357、AI725360、AI725361和和AI740189AI740204第72页/共73页CollegeofLifeScienceandBiotechnology参考文献参考文献1 1 沈倍奋分子文库北京：科学出版社，沈倍奋分子文库北京：科学出版社，2001.2001.2 2 赵亚华分子生物学教程赵亚华分子生物学教程.北京：科学出版社，北京：科学出版社，200420043 P.c.3 P.c.特纳等分子生物学北京：科学出版社，特纳等分子生物学北京：科学出版社，2001200144朱利军朱利军,长孙东亭长孙东亭,罗素兰罗素兰.cDNA.cDNA文库在药用海洋生物研究文库在药用海洋生物研究中的应用中的应用J.J.中国海洋药物杂志中国海洋药物杂志,2009,28(1):53-58.,2009,28(1):53-58.55王庆胜王庆胜.我国我国cDNAcDNA文库研究现状文库研究现状J.J.黑龙江农业科学黑龙江农业科学,2009(1):3-4.2009(1):3-4.66吴忠道，余新炳，郑亦男等日本血吸虫（中国大陆株）吴忠道，余新炳，郑亦男等日本血吸虫（中国大陆株）表达基因的分离和表达基因的分离和ESTEST序列测定序列测定JJ中国人兽共患病杂志，中国人兽共患病杂志，2000,16(1):3-62000,16(1):3-LOGO第73页/共73页