模拟酶核酶极端酶课件

第十一章 模拟酶 核酶 极端酶11.1 11.1 模拟酶模拟酶11.1.1 模拟酶的概念模拟酶的概念 模拟酶又称人工酶或酶模型，是在分子水模拟酶又称人工酶或酶模型，是在分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微环境平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微环境等结构特征，以及酶的作用机制和立体化学的等结构特征，以及酶的作用机制和立体化学的一门学科，是从分子水平上模拟生物功能的一一门学科，是从分子水平上模拟生物功能的一门边缘学科。门边缘学科。模拟酶是模拟酶是20世纪世纪60年代发展起来的一个新年代发展起来的一个新的研究领域，是仿生高分子的一个重要的内容。的研究领域，是仿生高分子的一个重要的内容。n n用合成高分子来模拟酶的结构、特性、作用原理以用合成高分子来模拟酶的结构、特性、作用原理以用合成高分子来模拟酶的结构、特性、作用原理以用合成高分子来模拟酶的结构、特性、作用原理以及酶在生物体内的及酶在生物体内的及酶在生物体内的及酶在生物体内的化学反应化学反应化学反应化学反应过程。过程。过程。过程。n n酶是一类有催化活性的蛋白质，它具有催化效率高、酶是一类有催化活性的蛋白质，它具有催化效率高、酶是一类有催化活性的蛋白质，它具有催化效率高、酶是一类有催化活性的蛋白质，它具有催化效率高、专一性强、反应条件温和等特点。酶容易受到多种专一性强、反应条件温和等特点。酶容易受到多种专一性强、反应条件温和等特点。酶容易受到多种专一性强、反应条件温和等特点。酶容易受到多种物理、化学因素的影响而失活，所以不能用酶广泛物理、化学因素的影响而失活，所以不能用酶广泛物理、化学因素的影响而失活，所以不能用酶广泛物理、化学因素的影响而失活，所以不能用酶广泛取代工业取代工业取代工业取代工业催化剂催化剂催化剂催化剂。n n研究模拟酶主要是为了解决酶的以上缺点。研究模拟酶主要是为了解决酶的以上缺点。研究模拟酶主要是为了解决酶的以上缺点。研究模拟酶主要是为了解决酶的以上缺点。模拟酶的酶学基础模拟酶的酶学基础酶的作用机制：过渡态理论酶的作用机制：过渡态理论对简化的人工体系中识别、结合和催化的研究对简化的人工体系中识别、结合和催化的研究11.1.2.11.1.2.模拟酶理论基础模拟酶理论基础超分子化学超分子化学主主-客体化学：主体和客体在结合部位的空间及客体化学：主体和客体在结合部位的空间及电子排列的互补电子排列的互补超分子：该分子形成源于底物和受体的结合，超分子：该分子形成源于底物和受体的结合，这种结合基于非共价键相互作用，当接受体与这种结合基于非共价键相互作用，当接受体与络合离子或分子结合形成稳定的，具有稳定结络合离子或分子结合形成稳定的，具有稳定结构和性质的实体，形成超分子构和性质的实体，形成超分子功能：分子识别、催化、选择性输出功能：分子识别、催化、选择性输出11.1.311.1.3设计要点设计要点n n设计前：设计前：n n酶活性中心酶活性中心酶活性中心酶活性中心-底物复合物的结构底物复合物的结构底物复合物的结构底物复合物的结构n n酶的专一性及其同底物结合方式的能力酶的专一性及其同底物结合方式的能力酶的专一性及其同底物结合方式的能力酶的专一性及其同底物结合方式的能力n n反应的动力学及各中间物的知识反应的动力学及各中间物的知识反应的动力学及各中间物的知识反应的动力学及各中间物的知识 n n设计中：设计中：n n为底物提供良好的微环境为底物提供良好的微环境为底物提供良好的微环境为底物提供良好的微环境n n催化基团必须相对于结合点尽可能同底物的催化基团必须相对于结合点尽可能同底物的催化基团必须相对于结合点尽可能同底物的催化基团必须相对于结合点尽可能同底物的功能团相接近功能团相接近功能团相接近功能团相接近n n应具有足够的水溶性，并在接近生理条件下应具有足够的水溶性，并在接近生理条件下应具有足够的水溶性，并在接近生理条件下应具有足够的水溶性，并在接近生理条件下保持其催化活性保持其催化活性保持其催化活性保持其催化活性11.1.4 模拟酶的分类和制备根据根据Kirby分类法分类法单纯酶模型单纯酶模型：利用利用化学化学方法通过天然酶活性的模方法通过天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性拟来重建和改造酶活性机理酶模型：通过对酶作用机制诸如识别、结合机理酶模型：通过对酶作用机制诸如识别、结合和过渡态稳定化的认识，来指导酶模型的设计和和过渡态稳定化的认识，来指导酶模型的设计和合成合成单纯合成的酶样化合物：化学合成的具有酶样催单纯合成的酶样化合物：化学合成的具有酶样催化活性的简单分子化活性的简单分子按照模拟酶的属性l主主-客体酶模型客体酶模型l胶束酶模型胶束酶模型l肽酶肽酶l抗体酶抗体酶l分子印迹酶模型分子印迹酶模型l半合成酶半合成酶主-客体模型1.环糊精模拟酶环糊精模拟酶-水解酶的模拟水解酶的模拟环糊精的分子结构环糊精的分子结构水解酶模型水解酶模型研究热点研究热点环糊精（环糊精（CD）分子）分子l原来：在原来：在CD的两面引入催化基团，通过柔性或的两面引入催化基团，通过柔性或刚性加冕引入疏水基团，改善刚性加冕引入疏水基团，改善CD的疏水结合和的疏水结合和催化功能催化功能l现在：桥联环糊精和聚合环糊精，可得到双重现在：桥联环糊精和聚合环糊精，可得到双重或多重疏水结合作用和多重识别作用或多重疏水结合作用和多重识别作用2.冠醚化合物的模拟酶冠醚水解酶模拟物胶束模拟酶单单分分子子胶胶束束酶酶模模型型胶束酶模型胶束酶模型目前模拟酶的研究主要有以下几方面：目前模拟酶的研究主要有以下几方面：1.1.1.1.模拟酶的金属辅基模拟酶的金属辅基模拟酶的金属辅基模拟酶的金属辅基:有一类复合酶有一类复合酶有一类复合酶有一类复合酶,除蛋白质外除蛋白质外除蛋白质外除蛋白质外,还有含金属的有机小分还有含金属的有机小分还有含金属的有机小分还有含金属的有机小分子物质或简单的金属，叫做辅酶或辅基。辅基在催子物质或简单的金属，叫做辅酶或辅基。辅基在催子物质或简单的金属，叫做辅酶或辅基。辅基在催子物质或简单的金属，叫做辅酶或辅基。辅基在催化反应中起着重要的作用。有一些研究工作就是模化反应中起着重要的作用。有一些研究工作就是模化反应中起着重要的作用。有一些研究工作就是模化反应中起着重要的作用。有一些研究工作就是模拟酶分子中的金属辅基。拟酶分子中的金属辅基。拟酶分子中的金属辅基。拟酶分子中的金属辅基。例如，模拟过氧化氢酶分子中的铁卟啉辅基，合成例如，模拟过氧化氢酶分子中的铁卟啉辅基，合成例如，模拟过氧化氢酶分子中的铁卟啉辅基，合成例如，模拟过氧化氢酶分子中的铁卟啉辅基，合成了分解过氧化氢的酶模型了分解过氧化氢的酶模型了分解过氧化氢的酶模型了分解过氧化氢的酶模型三亚乙基四胺与三价三亚乙基四胺与三价三亚乙基四胺与三价三亚乙基四胺与三价铁离子的络合物。这个模型在铁离子的络合物。这个模型在铁离子的络合物。这个模型在铁离子的络合物。这个模型在pH 9.5pH 9.5pH 9.5pH 9.5和和和和25252525的条件的条件的条件的条件下，其催化速率是血红蛋白或正铁血红素在同样条下，其催化速率是血红蛋白或正铁血红素在同样条下，其催化速率是血红蛋白或正铁血红素在同样条下，其催化速率是血红蛋白或正铁血红素在同样条件下的一万倍。化学模拟生物固氮同样是模拟固氮件下的一万倍。化学模拟生物固氮同样是模拟固氮件下的一万倍。化学模拟生物固氮同样是模拟固氮件下的一万倍。化学模拟生物固氮同样是模拟固氮酶的金属辅基。酶的金属辅基。酶的金属辅基。酶的金属辅基。2.2.2.2.模拟酶的活性功能基模拟酶的活性功能基模拟酶的活性功能基模拟酶的活性功能基 酶酶酶酶分分分分子子子子中中中中直直直直接接接接与与与与酶酶酶酶催催催催化化化化反反反反应应应应有有有有关关关关的的的的活活活活性性性性中中中中心心心心，通通通通常常常常是是是是由由由由几几几几个个个个活活活活性功能基组成。性功能基组成。性功能基组成。性功能基组成。例例例例如如如如牛牛牛牛胰胰胰胰核核核核糖糖糖糖核核核核酸酸酸酸酶酶酶酶的的的的催催催催化化化化中中中中心心心心是是是是肽肽肽肽链链链链序序序序列列列列中中中中第第第第12121212位位位位和和和和第第第第119119119119位位位位的两个组氨酸。的两个组氨酸。的两个组氨酸。的两个组氨酸。C.G.C.G.C.G.C.G.奥奥奥奥弗弗弗弗贝贝贝贝格格格格等等等等根根根根据据据据胰胰胰胰凝凝凝凝乳乳乳乳蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶的的的的催催催催化化化化中中中中心心心心与与与与丝丝丝丝氨氨氨氨酸酸酸酸的的的的羟羟羟羟基基基基、组组组组氨氨氨氨酸酸酸酸的的的的咪咪咪咪唑唑唑唑基基基基和和和和天天天天冬冬冬冬氨氨氨氨酸酸酸酸的的的的羧羧羧羧基基基基有有有有关关关关的的的的事事事事实实实实，用用用用乙乙乙乙烯烯烯烯基基基基苯苯苯苯酚酚酚酚与与与与乙乙乙乙烯烯烯烯基基基基咪咪咪咪唑唑唑唑进进进进行行行行共共共共聚聚聚聚合合合合，制制制制得得得得带带带带有有有有羟羟羟羟基基基基和和和和咪咪咪咪唑唑唑唑基基基基的的的的-胰胰胰胰凝凝凝凝乳乳乳乳蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶模模模模型型型型,用用用用这这这这个个个个模模模模型型型型聚聚聚聚合合合合物物物物作作作作为为为为3-3-3-3-乙乙乙乙酰酰酰酰氧氧氧氧基基基基N N N N三三三三甲甲甲甲基基基基碘碘碘碘化化化化苯苯苯苯胺胺胺胺,水水水水解解解解的的的的催催催催化化化化剂剂剂剂，当当当当pHpHpHpH为为为为9.19.19.19.1时时时时,其其其其活活活活性性性性比比比比单单单单一一一一的的的的乙乙乙乙烯烯烯烯基基基基咪唑高咪唑高咪唑高咪唑高63636363倍。倍。倍。倍。3.3.模拟酶与底物的作用模拟酶与底物的作用 酶分子具有一定的空间构型，它与被催化酶分子具有一定的空间构型，它与被催化的底物的作用在构型上有较严格的匹配关的底物的作用在构型上有较严格的匹配关系，体现了酶的专一性。为了模拟酶的结系，体现了酶的专一性。为了模拟酶的结合功能，近年来人们合成了许多冠醚化合合功能，近年来人们合成了许多冠醚化合物来模拟酶。随着冠醚空穴尺寸的不同，物来模拟酶。随着冠醚空穴尺寸的不同，其对底物的选择性也不一样。其对底物的选择性也不一样。4.4.模拟酶的性状在水溶液中，酶形成巨大的分子模拟酶的性状在水溶液中，酶形成巨大的分子模拟酶的性状在水溶液中，酶形成巨大的分子模拟酶的性状在水溶液中，酶形成巨大的分子缔合体（胶束），构成同一分子内的疏水和亲水缔合体（胶束），构成同一分子内的疏水和亲水缔合体（胶束），构成同一分子内的疏水和亲水缔合体（胶束），构成同一分子内的疏水和亲水微环境。模拟酶的这种微环境中的化学反应的特微环境。模拟酶的这种微环境中的化学反应的特微环境。模拟酶的这种微环境中的化学反应的特微环境。模拟酶的这种微环境中的化学反应的特殊性质，也是模拟酶的一个重要方面。殊性质，也是模拟酶的一个重要方面。殊性质，也是模拟酶的一个重要方面。殊性质，也是模拟酶的一个重要方面。有人利用组氨酸的衍生物十四酰组氨酸与十六有人利用组氨酸的衍生物十四酰组氨酸与十六有人利用组氨酸的衍生物十四酰组氨酸与十六有人利用组氨酸的衍生物十四酰组氨酸与十六酰烷基三甲基溴化铵组成两种分子的混合微胶酰烷基三甲基溴化铵组成两种分子的混合微胶酰烷基三甲基溴化铵组成两种分子的混合微胶酰烷基三甲基溴化铵组成两种分子的混合微胶束，来催化乙酸对硝基苯酯的水解，其速率比组束，来催化乙酸对硝基苯酯的水解，其速率比组束，来催化乙酸对硝基苯酯的水解，其速率比组束，来催化乙酸对硝基苯酯的水解，其速率比组氨酸增加了氨酸增加了氨酸增加了氨酸增加了100100倍。倍。倍。倍。5.5.5.5.模拟酶的高分子作用方式模拟酶的高分子作用方式模拟酶的高分子作用方式模拟酶的高分子作用方式 酶是一类由氨基酸组成，以多肽链为骨架的生物酶是一类由氨基酸组成，以多肽链为骨架的生物酶是一类由氨基酸组成，以多肽链为骨架的生物酶是一类由氨基酸组成，以多肽链为骨架的生物大分子。人们利用高分子化合物作为模型化合物的大分子。人们利用高分子化合物作为模型化合物的大分子。人们利用高分子化合物作为模型化合物的大分子。人们利用高分子化合物作为模型化合物的骨架，引入活性功能基来模拟酶的高分子作用方式。骨架，引入活性功能基来模拟酶的高分子作用方式。骨架，引入活性功能基来模拟酶的高分子作用方式。骨架，引入活性功能基来模拟酶的高分子作用方式。例如，用分子量为例如，用分子量为例如，用分子量为例如，用分子量为4000040000400004000060000600006000060000的聚亚乙基亚胺的聚亚乙基亚胺的聚亚乙基亚胺的聚亚乙基亚胺作为模型化合物的骨架，引入作为模型化合物的骨架，引入作为模型化合物的骨架，引入作为模型化合物的骨架，引入10101010摩尔的十二烷基摩尔的十二烷基摩尔的十二烷基摩尔的十二烷基和和和和15151515摩尔的咪唑基，合成一个硫酸酯酶模型摩尔的咪唑基，合成一个硫酸酯酶模型摩尔的咪唑基，合成一个硫酸酯酶模型摩尔的咪唑基，合成一个硫酸酯酶模型.用用用用这个模型聚合物催化苯酚硫酸酯类化合物的水解，这个模型聚合物催化苯酚硫酸酯类化合物的水解，这个模型聚合物催化苯酚硫酸酯类化合物的水解，这个模型聚合物催化苯酚硫酸酯类化合物的水解，其活性比天然的其活性比天然的其活性比天然的其活性比天然的型芳基硫酸酯酶高型芳基硫酸酯酶高型芳基硫酸酯酶高型芳基硫酸酯酶高100100100100倍。倍。倍。倍。n n 抗体酶概念抗体酶概念n n 抗体酶产生的理论基础抗体酶产生的理论基础n n 抗体酶的制备方法抗体酶的制备方法n n 抗体酶的应用抗体酶的应用11.2 11.2 抗体酶抗体酶（Abzyme)Abzyme)抗体n n由抗原诱导产生的，在结构上与抗原高度由抗原诱导产生的，在结构上与抗原高度互补并与抗原具有特异结合功能的免疫球互补并与抗原具有特异结合功能的免疫球蛋白。蛋白。n n抗体的最显著的特征是抗体的最显著的特征是多样性和专一性多样性和专一性抗体中的每条链中有恒定区和可变区。抗体中的每条链中有恒定区和可变区。相同点：相同点：都是蛋白质，都有特异性。都是蛋白质，都有特异性。不同点：不同点：1 1）酶与抗体的差别：酶是能与反应过渡态底物酶与抗体的差别：酶是能与反应过渡态底物结合的催化性物质，抗体是和基态分子结合的结合的催化性物质，抗体是和基态分子结合的催化性物质。催化性物质。2 2）酶的活性和合成受到代谢调节，种类有限。）酶的活性和合成受到代谢调节，种类有限。抗体只有在抗原存在时才产生，种类无限。抗体只有在抗原存在时才产生，种类无限。抗体与酶的异同：酶是生物催化剂n n酶是一类具有催化功能的生物分子酶是一类具有催化功能的生物分子n n酶反应有两个主要的特征：酶反应有两个主要的特征：n n高催化效率、高选择性高催化效率、高选择性高催化效率、高选择性高催化效率、高选择性n n19461946年，年，PaulingPauling用过渡态理论阐明酶催化用过渡态理论阐明酶催化的实质的实质n n酶之所以具有催化活力是因为它能特异性结合酶之所以具有催化活力是因为它能特异性结合酶之所以具有催化活力是因为它能特异性结合酶之所以具有催化活力是因为它能特异性结合并稳定化学反应的过渡态并稳定化学反应的过渡态并稳定化学反应的过渡态并稳定化学反应的过渡态(底物激态底物激态底物激态底物激态)，从而降，从而降，从而降，从而降低反应能级。低反应能级。低反应能级。低反应能级。n n对任何化学反应，反应物在对任何化学反应，反应物在对任何化学反应，反应物在对任何化学反应，反应物在变为产物之前，必须获得一变为产物之前，必须获得一变为产物之前，必须获得一变为产物之前，必须获得一定的能量，成为定的能量，成为定的能量，成为定的能量，成为活化态或活化态或称过渡态称过渡态。过渡态处于最。过渡态处于最。过渡态处于最。过渡态处于最高能阶上。高能阶上。高能阶上。高能阶上。n n过渡态与反应物的能阶之差过渡态与反应物的能阶之差过渡态与反应物的能阶之差过渡态与反应物的能阶之差称为称为称为称为活化能活化能。n n获得活化能的多少与反应的获得活化能的多少与反应的获得活化能的多少与反应的获得活化能的多少与反应的速度成正比。速度成正比。速度成正比。速度成正比。S 过渡态理论是解释酶催化原理的经典理论。过渡态理论是解释酶催化原理的经典理论。过渡态理论S过渡态理论认为，酶与底物的结合经历了一个过渡态理论认为，酶与底物的结合经历了一个易于形成产物的过渡态，实际上是降低了反应易于形成产物的过渡态，实际上是降低了反应所需的活化能。所需的活化能。过渡态理论与反应过渡状态结合作用n n在酶催化的反应中，与酶的活性中心形在酶催化的反应中，与酶的活性中心形成复合物的实际上是底物形成的过渡状成复合物的实际上是底物形成的过渡状态，态，n n酶与过渡状态的亲和力要大于酶与底物酶与过渡状态的亲和力要大于酶与底物或产物的亲和力。或产物的亲和力。n n19691969年年JencksJencks根根据据抗抗体体结结合合抗抗原原的的高高度度特特异异性性，与与天天然然酶酶结结合合底底物物的的高高度度专专一一性性相相类类似似的的特特性性，在在过过渡渡态态理理论论的的基基础础上上首首先先提出设想：提出设想：n n能能能能与与与与化化化化学学学学反反反反应应应应中中中中过过过过渡渡渡渡态态态态结结结结合合合合的的的的抗抗抗抗体体体体，可可可可能能能能具具具具有有有有酶的活性，催化反应的进行。酶的活性，催化反应的进行。酶的活性，催化反应的进行。酶的活性，催化反应的进行。n n19861986年年LernerLerner和和SchultzSchultz证实了这一设想。证实了这一设想。抗体酶设想抗体酶的发现n nLernerLerner和和SchultzSchultz分别领导各自的研究小组分别领导各自的研究小组首次观察到了抗体具有选择性的催化活性。首次观察到了抗体具有选择性的催化活性。n n19861986年美国年美国LernerLerner和和SchultzSchultz两个实验室同两个实验室同时在时在ScienceScience上发表论文，报道他们成功地上发表论文，报道他们成功地得到了具有催化活性的抗体。得到了具有催化活性的抗体。n n并将这类具催化能力的免疫球蛋白称为并将这类具催化能力的免疫球蛋白称为催化催化抗体抗体，即，即抗体酶抗体酶。n n1986198619861986年年年年SchultzSchultzSchultzSchultz以对硝基苯酚磷酸胆碱酯以对硝基苯酚磷酸胆碱酯以对硝基苯酚磷酸胆碱酯以对硝基苯酚磷酸胆碱酯（PNPPCPNPPCPNPPCPNPPC）作为相应的羧酸二酯的过渡态类似物。）作为相应的羧酸二酯的过渡态类似物。）作为相应的羧酸二酯的过渡态类似物。）作为相应的羧酸二酯的过渡态类似物。n n诱导产生的抗体酶使水解反应速度加快诱导产生的抗体酶使水解反应速度加快诱导产生的抗体酶使水解反应速度加快诱导产生的抗体酶使水解反应速度加快12000120001200012000倍。倍。倍。倍。抗体酶n n抗体酶（抗体酶（AbzymeAbzyme）或催化抗体（）或催化抗体（Catalytic Catalytic antibody)antibody)是抗体的高度选择性和酶的高效是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。催化能力巧妙结合的产物。n n本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性。可变区赋予了酶的属性。可变区赋予了酶的属性。可变区赋予了酶的属性。n n它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研究的成果，是究的成果，是究的成果，是究的成果，是抗体的高度选择性抗体的高度选择性抗体的高度选择性抗体的高度选择性和和和和酶的高效催化酶的高效催化酶的高效催化酶的高效催化能力能力能力能力巧妙结合的产物。巧妙结合的产物。巧妙结合的产物。巧妙结合的产物。抗体酶具有典型的酶反应特性抗体酶具有典型的酶反应特性n n与配体与配体与配体与配体(底物底物底物底物)结合的专一性，包括立体专一性，结合的专一性，包括立体专一性，结合的专一性，包括立体专一性，结合的专一性，包括立体专一性，抗体酶催化反应的专一性可以达到甚至超过天然抗体酶催化反应的专一性可以达到甚至超过天然抗体酶催化反应的专一性可以达到甚至超过天然抗体酶催化反应的专一性可以达到甚至超过天然酶的专一性；酶的专一性；酶的专一性；酶的专一性；n n具有高效催化性，一般抗体酶催化反应速度比非具有高效催化性，一般抗体酶催化反应速度比非具有高效催化性，一般抗体酶催化反应速度比非具有高效催化性，一般抗体酶催化反应速度比非催化反应快催化反应快催化反应快催化反应快101010102 2 2 2101010106 6 6 6倍，有的反应速度已接近于天倍，有的反应速度已接近于天倍，有的反应速度已接近于天倍，有的反应速度已接近于天然酶促反应速度；然酶促反应速度；然酶促反应速度；然酶促反应速度；n n抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方程动力学及抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方程动力学及抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方程动力学及抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方程动力学及pHpHpHpH依赖性等。依赖性等。依赖性等。依赖性等。过渡态理论与抗体酶过渡态理论与抗体酶n n如果使抗原最大限度地接近某一特定反应如果使抗原最大限度地接近某一特定反应的过渡态，就可能使诱导的抗体在与之结的过渡态，就可能使诱导的抗体在与之结合时发挥催化作用。合时发挥催化作用。n n实际所采用的过渡态抗原知识推测而设计实际所采用的过渡态抗原知识推测而设计的的过渡态类似物过渡态类似物。n n用过渡态类似物诱导的抗体所催化的反应用过渡态类似物诱导的抗体所催化的反应并非该类似物本身，而是与其相似的另一并非该类似物本身，而是与其相似的另一种反应。种反应。抗体酶的特性抗体酶的特性n n能催化一些天然酶不能催化的反应能催化一些天然酶不能催化的反应能催化一些天然酶不能催化的反应能催化一些天然酶不能催化的反应n n有许多化学反应还没有已知酶催化进行有许多化学反应还没有已知酶催化进行有许多化学反应还没有已知酶催化进行有许多化学反应还没有已知酶催化进行n n抗体的多样性决定了抗体酶催化反应类型多抗体的多样性决定了抗体酶催化反应类型多抗体的多样性决定了抗体酶催化反应类型多抗体的多样性决定了抗体酶催化反应类型多样性样性样性样性n n抗体酶可以根据需要人工裁制抗体酶可以根据需要人工裁制抗体酶可以根据需要人工裁制抗体酶可以根据需要人工裁制n n一种对酶促反应过渡态特异的抗体一种对酶促反应过渡态特异的抗体一种对酶促反应过渡态特异的抗体一种对酶促反应过渡态特异的抗体n n结合了酶与抗体的优点，既可以起酶促催化结合了酶与抗体的优点，既可以起酶促催化结合了酶与抗体的优点，既可以起酶促催化结合了酶与抗体的优点，既可以起酶促催化作用，又可以起抗体的选择性和专一性结合作用，又可以起抗体的选择性和专一性结合作用，又可以起抗体的选择性和专一性结合作用，又可以起抗体的选择性和专一性结合抗原的作用。抗原的作用。抗原的作用。抗原的作用。n n有更强的专一性和稳定性有更强的专一性和稳定性有更强的专一性和稳定性有更强的专一性和稳定性n n抗体的精细识别使其能结合几乎任何天然的抗体的精细识别使其能结合几乎任何天然的抗体的精细识别使其能结合几乎任何天然的抗体的精细识别使其能结合几乎任何天然的或合成的分子或合成的分子或合成的分子或合成的分子n n抗体酶催化反应的介质效应抗体酶催化反应的介质效应抗体酶催化反应的介质效应抗体酶催化反应的介质效应n n酯解反应中介质效应酯解反应中介质效应酯解反应中介质效应酯解反应中介质效应 ：抗体酶在有机溶抗体酶在有机溶抗体酶在有机溶抗体酶在有机溶剂中具稳定性。剂中具稳定性。剂中具稳定性。剂中具稳定性。n n脱羧反应中介质效应：有机溶剂引起脱羧脱羧反应中介质效应：有机溶剂引起脱羧脱羧反应中介质效应：有机溶剂引起脱羧脱羧反应中介质效应：有机溶剂引起脱羧反应速率增加。反应速率增加。反应速率增加。反应速率增加。n n酰基转移反应中介质效应酰基转移反应中介质效应酰基转移反应中介质效应酰基转移反应中介质效应 ：在疏水溶剂中，：在疏水溶剂中，：在疏水溶剂中，：在疏水溶剂中，活性较高。活性较高。活性较高。活性较高。抗体酶的催化反应类型抗体酶的催化反应类型n n转酰基反应转酰基反应转酰基反应转酰基反应n n水解反应水解反应水解反应水解反应n nClaisenClaisenClaisenClaisen重排反应重排反应重排反应重排反应n n酰胺合成反应酰胺合成反应酰胺合成反应酰胺合成反应n nDiels-AlderDiels-AlderDiels-AlderDiels-Alder反应反应反应反应n n转酯反应转酯反应转酯反应转酯反应n n光诱导反应光诱导反应光诱导反应光诱导反应n n氧化还原反应氧化还原反应氧化还原反应氧化还原反应n n脱羧反应脱羧反应脱羧反应脱羧反应n n顺反异构化反应顺反异构化反应顺反异构化反应顺反异构化反应抗体酶的制备抗体酶的制备n n将抗体转变为酶可通过诱导法、拷贝法、引入法、将抗体转变为酶可通过诱导法、拷贝法、引入法、将抗体转变为酶可通过诱导法、拷贝法、引入法、将抗体转变为酶可通过诱导法、拷贝法、引入法、化学修饰法等途径。化学修饰法等途径。化学修饰法等途径。化学修饰法等途径。n n诱导法诱导法诱导法诱导法是利用反应过渡态类似物为半抗原制是利用反应过渡态类似物为半抗原制是利用反应过渡态类似物为半抗原制是利用反应过渡态类似物为半抗原制作单克隆抗体，筛选出具高催化活性的单抗作单克隆抗体，筛选出具高催化活性的单抗作单克隆抗体，筛选出具高催化活性的单抗作单克隆抗体，筛选出具高催化活性的单抗即抗体酶。即抗体酶。即抗体酶。即抗体酶。n n拷贝法拷贝法拷贝法拷贝法主要根据抗体生成过程中抗原主要根据抗体生成过程中抗原主要根据抗体生成过程中抗原主要根据抗体生成过程中抗原-抗体互抗体互抗体互抗体互补性来设计的。补性来设计的。补性来设计的。补性来设计的。n n引入法引入法引入法引入法则借助基因工程和蛋白质工程将催化则借助基因工程和蛋白质工程将催化则借助基因工程和蛋白质工程将催化则借助基因工程和蛋白质工程将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，使基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，使基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，使基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，使其获得催化功能。其获得催化功能。其获得催化功能。其获得催化功能。n n化学修饰法化学修饰法化学修饰法化学修饰法对抗体进行化学修饰，使抗体与对抗体进行化学修饰，使抗体与对抗体进行化学修饰，使抗体与对抗体进行化学修饰，使抗体与催化基团相连。催化基团相连。催化基团相连。催化基团相连。1.1.诱导法诱导法 用设计好的半抗原，通过与载体蛋白用设计好的半抗原，通过与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。然后（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。然后对动物进行对动物进行免疫免疫，取免疫动物的脾细胞与，取免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞杂交，杂交细胞则分泌单克隆骨髓瘤细胞杂交，杂交细胞则分泌单克隆抗体，经筛选和纯化，得抗体酶。抗体，经筛选和纯化，得抗体酶。用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，获得具有原来酶活性的抗体酶。获得具有原来酶活性的抗体酶。2.2.拷贝法拷贝法3.3.引入法引入法将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原结将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原结合部位，可采用选择性化学修饰方法，亦可合部位，可采用选择性化学修饰方法，亦可利用蛋白质工程和基因工程技术利用蛋白质工程和基因工程技术n 戒毒戒毒:用可卡因水解的用可卡因水解的过渡态类似物过渡态类似物-磷酸单酯为半磷酸单酯为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，水解后的可卡因片断失去可卡因刺激功能。水解后的可卡因片断失去可卡因刺激功能。抗体酶的应用n肿瘤治疗肿瘤治疗 抗体介导的酶前体药治疗技术抗体介导的酶前体药治疗技术:将能水解前药将能水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，则酶通过和肿瘤结合的抗体存在于细胞的表面。静则酶通过和肿瘤结合的抗体存在于细胞的表面。静脉给药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近，脉给药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近，抗体酶将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物。抗体酶将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物。11.311.3 核核酶（酶（Ribozyme)n n核酶的概念核酶的概念n n核酶的种类核酶的种类n n核酶的应用核酶的应用n n核酶面临的问题核酶面临的问题n n影响核酶活性的因素影响核酶活性的因素 具有生物催化功能的RNA。一、核酶的概念生物催化剂生物催化剂（Biocatalyst）蛋白质类：天然酶蛋白质类：天然酶 enzyme 极端酶极端酶 extremozyme 抗体酶抗体酶 abzyme 生物工程酶生物工程酶其它：模拟酶其它：模拟酶核酸类核酸类:克隆酶克隆酶遗传修饰酶遗传修饰酶蛋白质工程新酶蛋白质工程新酶、RibozymeDeoxyribozyme I型内含子剪接型核酶 II型内含子 锤头核酶剪切型核酶 发夹核酶 自体催化 丁型肝炎病毒（HDV)核酶 RNaseP 异体催化 二、核酶的分类1.1.剪接型核酶剪接型核酶 剪接型核酶的作用机制是通过既剪剪接型核酶的作用机制是通过既剪又接的方式除去内含子（又接的方式除去内含子（Intron)Intron)。1）I类内含子的自我剪接(Self-splicing)n nI I I I型型型型IVS(intervening squense,IVS(intervening squense,IVS(intervening squense,IVS(intervening squense,间隔序列）是与间隔序列）是与间隔序列）是与间隔序列）是与四膜虫四膜虫四膜虫四膜虫26srRNA26srRNA26srRNA26srRNA前体的前体的前体的前体的IVSIVSIVSIVS结构相似的间隔序列，结构相似的间隔序列，结构相似的间隔序列，结构相似的间隔序列，具有环状结构。通过转磷酸酯反应，生成成熟的具有环状结构。通过转磷酸酯反应，生成成熟的具有环状结构。通过转磷酸酯反应，生成成熟的具有环状结构。通过转磷酸酯反应，生成成熟的26srRNA26srRNA26srRNA26srRNA及及及及G-IVSG-IVSG-IVSG-IVS，G-IVSG-IVSG-IVSG-IVS经两次环化生成经两次环化生成经两次环化生成经两次环化生成L-19IVSL-19IVSL-19IVSL-19IVS。催化过程需要鸟苷酸或鸟苷以及镁离子参与。催化过程需要鸟苷酸或鸟苷以及镁离子参与。催化过程需要鸟苷酸或鸟苷以及镁离子参与。催化过程需要鸟苷酸或鸟苷以及镁离子参与。n n剪接机制剪接机制剪接机制剪接机制n nL-19IVSL-19IVSL-19IVSL-19IVS在体外的多种酶活性在体外的多种酶活性在体外的多种酶活性在体外的多种酶活性p 3 HO-Gp3 pP-GOHp P-G3HO 类内含子的剪接机制Mg 2+或Mn 2+GMP,GDP,GTP外显子外显子 内含子或居间序列内含子或居间序列（Intervening sequence,IVS)5 UCUAAAIVSGUAAPre-rRNAUCU A AAGUAAUCUoH35GAAAGUAAUCUUAA5GAAAGOH 3 G-IVSL-19IVS19nt53rRNA535pGOH353四膜虫rRNA前体自我剪接反应1、转核苷酸作用转核苷酸作用 2CpCpCpCpC CpCpCpCpCpC +CpCpCpC2、水解作用水解作用 CpCpCpCpC CpCpCpC+pC3、转磷酸作用转磷酸作用CpCpCpCpCpCp+UpCpU CpCpCpCpCpC+UpCpUp4、去磷酸作用去磷酸作用 CpCpCpCpCp CpCpCpCpC+Pi5、限制性内切酶作用限制性内切酶作用 CpUpCpUpN +G CpUpCpU +GpN 2）类内含子的自我剪接n n型型IVSIVS是与细胞核是与细胞核mRNAmRNA前体的前体的IVSIVS结构结构相似的间隔序列。通过转磷酸酯反应，相似的间隔序列。通过转磷酸酯反应，生成成熟的生成成熟的RNARNA及套环状的及套环状的IVSIVS。催化的。催化的剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参加，但剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参加，但仍需要镁离子仍需要镁离子(Mg(Mg2+2+)。n n剪接机制剪接机制p 2 HO-Ap p-A p3OHpP-AHO 3类内含子的剪接机制Mg 2+套环的形成套环的形成53外显子连接外显子连接2.剪切型核酶 这类RNA进行自身催化的反应是只切不接。1）自体催化剪切型 剪切机制 转酯化过程：转酯化过程：由靠近切割由靠近切割位点位点3 3端的端的2 2OHOH或氧原子对或氧原子对切割位点的磷原切割位点的磷原子实施亲核攻击，子实施亲核攻击，产生产生5 5-OH-OH 和和2 2，3 3-环磷酸环磷酸二酯二酯。剪剪 切切 机机 制制核酶自身剪切反应核酶自身剪切反应锤头型核酶的二级结构 和空间立体结构示意图三个双螺旋区。三个双螺旋区。1313个核苷酸残基个核苷酸残基保守序列。保守序列。剪切反应在右上剪切反应在右上方方GUXGUX序列的序列的3 3端自动发生。端自动发生。发夹（hairpin）结构n n19891989年汉普（年汉普（HampleHample）研究烟草环斑病毒）研究烟草环斑病毒（sTRSVsTRSV）的负链）的负链RNARNA的自我剪切反应，提的自我剪切反应，提出发夹结构（出发夹结构（hairpin structurehairpin structure）模型。）模型。n n发夹核酶结构模型发夹核酶结构模型四个螺旋区、三个四个螺旋区、三个连接区和两个环。连接区和两个环。剪切反应发生在底剪切反应发生在底物识别序列物识别序列GUCGUC的的5 5端。端。53 发夹二级结构模型剪切位点剪切位点2)2)异体催化剪切型异体催化剪切型 核糖核酸酶核糖核酸酶P(RNaseP)P(RNaseP)是内切核酸酶，是内切核酸酶，是核糖核酸蛋白体复合物，能剪切所有是核糖核酸蛋白体复合物，能剪切所有tRNAtRNA前体的前体的5 5端，除去多余的序列，形成端，除去多余的序列，形成3 3-OH-OH 和和 5 5-磷酸末端。磷酸末端。l RNasePRNaseP由由M1RNAM1RNA和蛋白质亚基组成。和蛋白质亚基组成。携带氨基酸携带氨基酸辨认并结合氨基酰辨认并结合氨基酰tRNA合成酶合成酶识别识别mRNA上的密码上的密码识别并结合识别并结合核蛋白体核蛋白体氨基酸臂氨基酸臂DHU臂臂反密码臂反密码臂可变臂可变臂T C臂臂三、核酶的应用三、核酶的应用1.1.基础理论：生命起源的探索基础理论：生命起源的探索2.2.医药：医药：1 1）通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，）通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强。如抗肝炎病毒、抗人类免抑制效率高，专一性强。如抗肝炎病毒、抗人类免疫缺陷病毒疫缺陷病毒型（型（HIV-)HIV-)、抗肿瘤。、抗肿瘤。2 2）免疫原性低，很少引起免疫反应。）免疫原性低，很少引起免疫反应。3.3.植物抗病毒植物抗病毒 四、核酶面临的问题四、核酶面临的问题1 1、核酶催化效率低。、核酶催化效率低。2 2、核酶本身是、核酶本身是RNARNA，很容易被核酸水解酶，很容易被核酸水解酶 RNaseRNase破坏。破坏。五、影响核酶活性的因素五、影响核酶活性的因素1 1、pHpH值对活性的影响：值对活性的影响：pH7.0-7.5pH7.0-7.5时核酶活性最高。时核酶活性最高。2 2、二价金属阳离子对活性的影响、二价金属阳离子对活性的影响:Mg:Mg2+2+Mn Mn2+2+3 3、抗生素对活性的影响：大多数为抑制效应、抗生素对活性的影响：大多数为抑制效应4 4、变性剂对活性的影响、变性剂对活性的影响:5 5、温度对活性的影响、温度对活性的影响:1 1、极端微生物和极端酶、极端微生物和极端酶p 极端微生物：极端微生物：又称嗜极菌（又称嗜极菌（extremophilesextremophiles），是在），是在超常生态环境条件下生存的微生物。超常生态环境条件下生存的微生物。11.3 11.3 极端酶（极端酶（extremozymeextremozyme）根据所耐受的环境条件不同，分为：根据所耐受的环境条件不同，分为：嗜热菌（嗜热菌（thermophiles）超嗜热菌（超嗜热菌（hyperthermophiles）嗜冷菌（嗜冷菌（psychrophiles）嗜盐菌（嗜盐菌（halophiles）嗜酸菌（嗜酸菌（acidophiles）嗜碱菌嗜碱菌（alkaliphiles）嗜压菌（嗜压菌（barophiles）抗辐射的微生物抗辐射的微生物2.2.极端酶的制备极端酶的制备 1 1）天然极端酶的筛选和生产）天然极端酶的筛选和生产 2 2）蛋白质工程生产极端酶）蛋白质工程生产极端酶