生物可降解塑料课件

第八章 可降解塑料的生物合成第一节第一节 可降解塑料概述可降解塑料概述第二节第二节 PHAs的结构、物理化学性质和应用的结构、物理化学性质和应用1第八章 可降解塑料的生物合成第一节 可降解塑料概述1第一节 塑料废物污染和可降解塑料q二十世纪七十年代以来塑料工业得到迅猛的发展，无论是工业、农业、建筑业，还是人们的日常生活无不与塑料密切相关。q化学合成塑料在自然环境中很难分解，亦不会被腐蚀，燃烧处理又会产生有害气体，塑料垃圾对环境造成了巨大的危害。2第一节 塑料废物污染和可降解塑料二十世纪七十年代以来塑料工业普通塑料对环境污染的特点成分成分为合成合成树脂脂(1)污染范染范围广广(2)污染物增染物增长量快。量快。全世界每年对塑料的需求量为1亿吨。美国专家估计每10年产量将增加1倍。1995年我国的塑料需求量为600万吨，其中对环境有威胁的地膜为88万吨，包装用品为150-200万吨。美国、日本的塑料垃圾占垃圾总量的7%。3普通塑料对环境污染的特点成分为合成树脂3普通塑料对环境污染的特点-续(3)处理理难。塑料具有耐酸碱、抗氧化、难腐蚀、难降解的特性，埋地处理百年不烂；燃烧时产生大量有毒气体，如HCl、SOx、CO等。4普通塑料对环境污染的特点-续(3)处理难。塑料具有耐酸碱、普通塑料对环境污染的特点(4)回回收收利利用用难。塑料制品种类多，填料、颜料多样，难以分拣回收再利用。(5)生生态环境境危危害害大大。地膜降低耕地质量，农作物植株矮小，抗病力差。5普通塑料对环境污染的特点(4)回收利用难。塑料制品种类多，填q研究和开发生物可降解塑料已迫在眉捷q用可生物降解塑料代替部分石油化工合成塑料，禁用某些塑料制品如意大利已立法规定自1991年起所有包装用塑料都必须生物可降解，我国也已开始考虑禁用塑料方便餐盒等不可降解的塑料制品。生物可降解塑料6研究和开发生物可降解塑料已迫在眉捷生物可降解塑料6国内外出现的生物可降解塑料PCL-聚已内酰胺聚已内酰胺;PVA-聚乙烯醇聚乙烯醇;PE-聚乙烯聚乙烯7国内外出现的生物可降解塑料PCL-聚已内酰胺;PVA-聚乙烯生物可降解塑料的特点q工艺简单q生产过程污染轻q生物可降解性和生物可相容性q可进行高分子材料的结构调整：控制营养、环境条件8生物可降解塑料的特点工艺简单8第二节、PHAs的生物合成与应用q采用微生物发酵法生产的聚-羟基烷酸(简称PHAs)，成为应用环境生物学方面的一个研究的热点聚-羟基丁酸PHB3-羟基丁酸与3-羟基戊酸的共聚物P(3HB-co-3HV)或PHBV9第二节、PHAs的生物合成与应用采用微生物发酵法生产的聚-qPHAs除具有高分子化合物的基本特性，如质轻、弹性、可塑性、耐磨性、抗射线等外，还具有生物可降解性和生物可相容性。PHAs香波瓶100年个月合成塑料PHAs原原料料降降解解10PHAs除具有高分子化合物的基本特性，如质轻、弹性、可塑性、一、PHAs的结构、物理化学性质和应用q多种微生物在一定条件下能在胞内积累PHAs作为碳源和能源的贮存物。q由于PHAs具有低溶解性和高分子量，它在胞内的积累不会引起渗透压的增加，是理想的胞内贮藏物，比糖原、多聚磷酸或脂肪更加普遍地存在于微生物中。qPHAs的通式可写成：单体数目11一、PHAs的结构、物理化学性质和应用多种微生物在一定条件下R为甲基时，单体为-羟基丁酸(HB)；R为乙基时，单体为-羟基戊酸(HV)；R为丙基时，单体为-羟基已酸(HC)；R为丁基时，单体为-羟基庚酸(HH)；R为戊基时，单体为-羟基辛酸(HO)；R为已基时，单体为-羟基壬酸(HN)；R为庚基时，单体为-羟基癸酸(HD)；R为辛基时，单体为-羟基十一酸(HUD)；R为壬基时，单体为-羟基十二酸(HDD)；nR多为不同链长正烷基，也可以是支链的、不饱和的或带取代基的烷基12R为甲基时，单体为-羟基丁酸(HB)；R多为不同链长正烷聚合物命名qR为甲基时，其聚合物为聚-羟基丁酸(PHB)qR为乙基时，其聚合物为聚-羟基戊酸(PHV)q在一定条件下两种或两种以上的单体还能形成共聚物，其典型代表是3HB和3HV组成的共聚物P(3HB-co-3HV)。13聚合物命名R为甲基时，其聚合物为聚-羟基丁酸(PHB)1q每个PHAs颗粒含有数千条多聚体链。这些多聚物的物理化学性质和机械性能如韧度、脆性、溶点、玻璃态温度和抗溶剂性等与单体的组成有极大的关系。例如PHBV共聚物中羟基戊酸组分的增加可使熔点从180(PHB均聚物)降至75(PHBV共聚物中HV组分的摩尔分数为3040%)。PHAs的结构、物理化学性质HV-羟基戊酸14每个PHAs颗粒含有数千条多聚体链。这些多聚物的物理化学性质q大多数有关细菌PHAs的物化性质的研究是针对PHB和PHBV两种聚合物进行的。qPHB是高度结晶的晶体，结晶度的范围在5580%，其在物理性质甚至分子结构上与聚丙烯(PP)很相似，例如熔点、玻璃态温度、结晶度、抗张强度等，而比重大、透氧率低和抗紫外线照射以及具有光学活性、阻湿性等则是PHB的优点，见表7-2-1。PHAs的结构、物理化学性质-续15大多数有关细菌PHAs的物化性质的研究是针对PHB和PHBV1616qPHB较脆和发硬，但可通过与适量HV共聚而补偿。q随着PHBV中HV组分的增加，聚合物的劲度降低而韧性增加，且共聚物的熔点随着HV组分的增加而降低，使得较易对其进行热加工处理。q单体4HB的聚合物或3HB与4HB的共聚物P(3HB-co-4HB)则是高弹体，且其生物降解的速度比均聚PHB或PHBV更快。PHAs的结构、物理化学性质-续HV-羟基戊酸HB-羟基丁酸17PHB较脆和发硬，但可通过与适量HV共聚而补偿。PHAs的结PHB的工业化应用主要存在两个缺点qPHB较差的熔化稳定性，其分解温度约为200，该温度与其熔点相近(约175)；可通过在发酵过程中加入3HV的前体合成PHBV共聚体或将PHB与其它多聚物相混合使用来解决；q在环境条件下贮存数日后，PHB易发脆。PHB的老化问题可通过简单的淬火处理来较大程度地解决。18PHB的工业化应用主要存在两个缺点PHB较差的熔化稳定性，其思考题q含有PHAs的微生物能通过什么染料鉴别？q能利用糖蜜生产PHB的最有效菌株是什么？q工业生产PHAs的微生物菌种需要考虑哪些因素？q目前报道利用葡萄糖基质生产PHB的最高记录是多少？q一般发酵过程分为哪两个阶段？19思考题含有PHAs的微生物能通过什么染料鉴别？19PHAs的应用的应用shampoo bottles bicycle helmet 20PHAs的应用shampoo bottles bicycle二、PHAs的生物合成q合成PHAs的主要微生物q合成PHAs的主要基质qPHAs的代谢途径与调控21二、PHAs的生物合成合成PHAs的主要微生物21PHAsPHAs的生物合成的生物合成一一 合成合成PHAs的主要微生物的主要微生物1 PHAs的发现及形成机制的发现及形成机制 PHB最初由最初由 Lemoigne于于1925年首先发现。年首先发现。从从巨大芽孢杆菌巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium)分离鉴分离鉴定。阐明该菌定。阐明该菌形成芽孢时产生形成芽孢时产生PHB。20世纪世纪50年代，发现年代，发现PHB的生成量的生成量随培养基中随培养基中碳氮比的增加而增加碳氮比的增加而增加22PHAs的生物合成一 合成PHAs的主要微生物1 PHAsq 能产生PHAs的微生物分布极广，包括光能和化能自养及异养菌计65个属中的近300种微生物。q目前研究的较多的微生物：产碱杆菌属(Alcaligenes europhus,现在更名为Ralstonia eutropha)假单胞菌属(Pseudonomas)甲基营养菌(Methylotrophs)固氮菌属(Azotobacter)红螺菌属(Rhodospirilum)（一）合成PHAs的主要微生物23 能产生PHAs的微生物分布极广，包括光能和化能自养及异养菌活性污泥中微生物产生的PHB24活性污泥中微生物产生的PHB24表表7-4 各种微生物利用不同碳源合成各种微生物利用不同碳源合成PHVs的情况及水平比较的情况及水平比较 25表7-4 各种微生物利用不同碳源合成PHVs的情况及水平比选择工业生产选择工业生产PHAs的菌种考虑的因素：的菌种考虑的因素：能利用廉价碳源的能力能利用廉价碳源的能力生长速率问题生长速率问题多聚物合成速率多聚物合成速率在细胞内最大量积累多聚物的能力在细胞内最大量积累多聚物的能力26选择工业生产PHAs的菌种考虑的因素：能利用廉价碳源的能力2英国英国ICI公司进行考察，发现公司进行考察，发现：固氮菌固氮菌：产生多糖，：产生多糖，PHB的比产率降低，技术问题。的比产率降低，技术问题。甲基营养菌甲基营养菌：PHB产率中等。产率中等。真养产碱杆菌真养产碱杆菌：生长快，易培养、胞内：生长快，易培养、胞内PHB含量高、含量高、聚合物分子量大并能利用各种较经济的能源。聚合物分子量大并能利用各种较经济的能源。最终选择了最终选择了 真养产碱杆菌（真养产碱杆菌（A.eutrophus）ICIImperial Chemical Industries帝国化学工业公司帝国化学工业公司27英国ICI公司进行考察，发现：固氮菌：产生多糖，PHB的比产q真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha)为革兰氏阴性的兼性化能自养型细菌积累PHB可达细胞干重的90%以上能利用糖加丙酸或戊酸产生P(3HB-co-3HV)改变基质该菌还能将4HB和5HV结合到3HB的结构中去，形成4HB或5HV单体与3HB的共聚物。q采用带有真养产碱杆菌PHB合成基因的重组大肠杆菌(E.coli)。工业化生产PHAs的微生物28真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha)为革兰氏带有带有A.eutrophus PHB合成基因合成基因的的重组重组E.coli 成为新的选择成为新的选择！A.eutrophus重组重组E.coli1 生长快，容易培养（培养条件简单）生长快，容易培养（培养条件简单）2 胞内聚合物含量高胞内聚合物含量高3 聚合物分子量大聚合物分子量大4 提取相对较困难提取相对较困难5 生产共聚物较容易，易调节共聚比生产共聚物较容易，易调节共聚比6 分子量分布控制较难分子量分布控制较难7 已有工业化产品已有工业化产品1 发酵周期短发酵周期短2 胞内聚合物积累量大胞内聚合物积累量大3 胞内无聚合物降解酶，分子量大胞内无聚合物降解酶，分子量大4 易于提取易于提取5 胞内聚合物颗粒大、结晶度高胞内聚合物颗粒大、结晶度高6 能利用多种碳源能利用多种碳源7 在复杂培养条件下，胞内聚合物才能高积在复杂培养条件下，胞内聚合物才能高积累。累。8 有较成熟的高密度细胞培养技术有较成熟的高密度细胞培养技术生产生产PHB(V)的的A.eutrophus 和重组和重组E.coli 特点特点29带有A.eutrophus PHB合成基因的A.eutrop二二 合成合成PHAs PHAs 的主要基质的主要基质1 1 糖质碳源糖质碳源2 2 甲醇甲醇3 3 气体（气体（H H2 2、COCO2 2、O O2 2 ）4 4 烷烃及其衍生物烷烃及其衍生物30二 合成PHAs 的主要基质1 糖质碳源301 糖质碳源糖质碳源 葡萄糖葡萄糖A.eutrophus的变异株利用葡萄糖已用于工的变异株利用葡萄糖已用于工业生产业生产PHB。Kim等人采用等人采用细胞密度培养细胞密度培养的方的方法，法，50h细胞浓度达细胞浓度达164g/L，干细胞中，干细胞中 PHB含含76，PHB生产强度为生产强度为2.42g/(L.h)是目前世界上已报道的是目前世界上已报道的最高记录最高记录.311 糖质碳源 葡萄糖31重组重组E.coli 利用丰富酵母膏、蛋白胨的葡萄糖培养基培养，利用丰富酵母膏、蛋白胨的葡萄糖培养基培养，42h细胞浓度达细胞浓度达117g/L，PHB占细胞干重占细胞干重76，PHB生产强度生产强度2.11g/(L.h)降低成本，用合成培养基培养降低成本，用合成培养基培养35h，细胞浓度为，细胞浓度为71.4g/L，PHB干重干重22.8。即。即 在合成培养基在合成培养基上不能大量积累上不能大量积累PHB（乙酰（乙酰CoA不足）。不足）。在合成培养基上加有机氮源，改进方法，细胞浓在合成培养基上加有机氮源，改进方法，细胞浓度达度达116g/L，PHB干重达干重达62.2。32重组E.coli 32 蔗糖和糖蜜蔗糖和糖蜜带有稳定高拷贝数的带有稳定高拷贝数的pSYL104质粒的重组质粒的重组E.coli 能利用蔗糖生产能利用蔗糖生产PHB。在含蔗糖的合成培养基中采用恒定在含蔗糖的合成培养基中采用恒定pH的分批补的分批补料方式培养料方式培养48h，细胞浓度达，细胞浓度达124.6g/L,PHB浓度浓度34.3g/L。加有机氮可以改善。加有机氮可以改善。利用糖蜜原料有困难：杂质多，利用糖蜜原料有困难：杂质多，PHB难积累。难积累。需精制后使用。需精制后使用。33 蔗糖和糖蜜带有稳定高拷贝数的pSYL104质粒的重组E.c2、甲醇q甲醇是最便宜的基质之一，qICI拥有生产甲醇单细胞蛋白的技术经验，曾考虑用甲醇作基质生产PHB。甲醇菌积累PHB含量不高，PHB回收成本大，获得的PHB的分子量较小，故放弃该路线。q但可以作为寻求新的菌种和开发更有效的培养方法的途径。342、甲醇3435353、气体、气体H2/CO2/O2q真养产碱杆菌等一些爆鸣气细菌能利用H2/CO2/O2产生PHB，其中H2作为能源，CO2是碳源。q以H2作为基质按其价格和产率而言(见表1)在经济上是划算的，且H2又是一种干净的可再生资源。可以同时解决两个严重的环境污染问题：温室效应及废弃的非降解塑料对生态环境的危害。q安全性问题：解决混合气体爆鸣的安全问题和气体的循环利用问题。控制基质气相中氧的浓度低于气体爆炸的下限(6.9%)是安全的。363、气体H2/CO2/O2真养产碱杆菌等一些爆鸣气细菌能利用4、烷烃及其衍生物、烷烃及其衍生物q假单胞菌能利用中等链长的烷烃或其衍生物醇、酸等产生中等链长羟基烷酸的共聚物(PHAMCL)，共聚物中单体的组成与基质碳架的长度有关。q 以辛烷作基质连续培养食油假单胞菌(P.oleovorans)，稳定态细胞浓度11.6g/l，PHA的生产强度为0.58g/Lh，374、烷烃及其衍生物假单胞菌能利用中等链长的烷烃或其衍生物醇、（三）PHAs的代谢途径与调控qPHAs的的产生机理生机理微生物在碳源过量而其他营养如氮、磷、镁或氧不足时，积累大量PHAs作为碳源和能源的贮存物，或作为胞内还原性物质还原能力的一种储备。当限制性营养物再次被提供时，PHAs能被胞内酶降解后作为碳源和能源利用。38（三）PHAs的代谢途径与调控PHAs的产生机理38 胞中积累的PHAs存在形式以单个粒子的形态存在，每个细胞含有的颗粒数量的大小随微生物种类而不同，在Ralstonia eutropha中，每个细胞含有8-10个颗粒，每个颗粒直径大小为0.2-0.5m；以非晶体形式存在。具有高度的折光性，颗粒外面包裹着一层膜，没有生物膜那样的典型双层结构，膜中含有PHAs合成酶的降解酶系统。39 胞中积累的PHAs存在形式以单个粒子的形态存在，每个细胞含Scanning electron microscope of PHB granules in Ralstonia eutropha40Scanning electron microscope o补料分批培养补料分批培养45h收获的菌体收获的菌体细胞的电镜照相细胞的电镜照相41补料分批培养45h收获的菌体细胞的电镜照相41PHAs的代谢途径的代谢途径n 不同微生物合成PHAs的途径不同，基质不同其合成途径也有差异(图7-2)。真养产碱杆菌及多数细菌从糖合成PHB；深红红螺菌从糖合成PHB；食油假单孢菌等从链烃、醇及酸合成具有与基质链长有关的HA单位的PHAs；一株产碱杆菌从长链偶碳脂肪酸合成PHB；铜绿假单孢菌等从糖质碳源(如葡萄糖酸)合成具中链HA单位的P HAs；真养产碱杆菌等利用糖加丙酸合成PHBV。HA-羟基烷酸羟基烷酸42PHAs的代谢途径 不同微生物合成PHAs的途径不同，基质不A43A43PHAs的生物合成和降解同时存在q的丁酰丁酰CoA44PHAs的生物合成和降解同时存在的丁酰CoA44基因重组细菌q 20世纪80年代后期开始将重组DNA技术应用于生物合成PHB，来自于多种细菌的PHA生物合成酶PHA生物合成途径的关键酶，已被在分子水平进行了详细的研究，PHA生物合成酶基因已被克隆成功。q3个实验室独立地将真养产碱杆菌H16的PHB生物合成基因phbA、phbB和phbC克隆并在大肠杆菌中表达。45基因重组细菌 20世纪80年代后期开始将重组DNA技术应用于基因重组细菌q研究发现，在真养产碱杆菌中，PHA合成酶的结构基因排列在称为phbC-A-B的一个操纵子上，分别编码PHA合成酶、-酮基硫酯酶和依赖于NADPH的乙酰乙酰CoA还原酶(见图7-4)。46基因重组细菌研究发现，在真养产碱杆菌中，PHA合成酶的结构基三、三、PHAs的发酵生产的发酵生产qPHAs实现大规模工业化生产的主要障碍是生产成本。英国帝国化学公司(ICI)认为影响PHAs生产成本的主要因素有菌种原料操作方式提取方法47三、PHAs的发酵生产PHAs实现大规模工业化生产的主要障碍因而降低PHAs的生产成本主要措施q(1)采用廉价基质(如CO2、H2和O2，甲醇，乙醇，葡萄糖及来自农业废物的有机酸等)和提高产物对基质的产率系数，降低发酵原材料的成本；q(2)提高生产强度(如选育高产菌株、采用合适的发酵生产方式等)，以降低操作成本；q(3)改进提取、纯化技术(如不采用价格昂贵的有机溶剂、简化操作等)，以降低提取成本。48因而降低PHAs的生产成本主要措施(1)采用廉价基质(如COPHAs的流加发酵q选定了较适宜的菌种、基质和提取方法后，要进一步降低PHAs的生产成本，最主要的关键在于采取适当的发酵方式，以获得高的产物转化率、高的产物浓度。采取适宜的发酵生产方式是提高聚合物的生产率和改进其质量的关键。49PHAs的流加发酵选定了较适宜的菌种、基质和提取方法后，要进PHAs的流加发酵的流加发酵q 在PHAs的生产中，通常采用分批发酵法和流加发酵法，有时用连续培养法来获得高的生产强度。q由于真养产碱杆菌只有在某种营养成份氮、磷或氧等缺乏而碳源过量的不平衡生长条件下才能大量积累PHAs，一般可将发酵过程分成两个阶段来进行控制：第一阶段为菌体细胞的形成阶段，在此阶段微生物利用基质形成大量菌体，而多聚体PHAs的积累量很少；第二阶段为多聚体形成阶段，当培养基中某种营养耗尽时，细胞进入PHAs形成阶段，在此阶段PHAs大量形成而菌体细胞基本上不繁殖。50PHAs的流加发酵 在PHAs的生产中，通常采用分批发酵法和q采用流加发酵法进行PHAs的生产时，可以在某些必须的营养成分成为生长限制性因素之前，对其进行定量流加，延长细胞的对数生长期，从而可以获得较高的菌体浓度。51采用流加发酵法进行PHAs的生产时，可以在某些必须的营养成分q减少菌体细胞在生长阶段积累多聚体，也需通过流加法来控制，培养液中氨离子浓度不小于200 mg/L，否则会降低共聚体的最终产率。q在多聚体形成阶段，限制氮源能刺激细胞积累PHAs，但氮源的完全缺乏会极大地损害微生物细胞的合成活性，所以将在PHAs合成阶段以较低的速率限量流加氮源。与分批发酵中氮源完全缺乏相比，流加发酵细胞中的PHAs含量增加更快。PHAs的流加发酵的流加发酵52减少菌体细胞在生长阶段积累多聚体，也需通过流加法来控制，培养q此外，与传统的分批发酵相比，流加发酵通常具有染菌和退化的几率小，可以获得较高的转化率，对发酵易实现优化控制等优点。53531、采用流加培养法生产PHB（1）选择限制培养基中的氮源作为流加控制的手段，可以提高PHB产率；（2）控制碳氮比相当重要。541、采用流加培养法生产PHB542、采用流加培养法生产共聚物P(HB-CO-HV)聚羟基烷酸（PHAs）是一类具有广泛工业应用价值的耐热塑料，某些共聚物PHA比均聚物PHB具有更有用的热机械性能，如PHB较脆和发硬，而HB和HV形成的共聚物PHA比PHB的硬度降低而韧度增加。552、采用流加培养法生产共聚物P(HB-CO-HV)55q在共聚物P(HB-CO-HV)的生产过程当中，流加发酵比分批发酵具有明显优势。丙酸和戊酸是生产共聚物P(HB-CO-HV)所必需的基质，由于这些有机酸对菌体细胞具有一定的毒性，故采用简单的分批发酵不可能获得高产，采用流加培养法，可以避免由于培养基中有机酸的积累而使细胞活力受到损害，从而达到提高P(HB-CO-HV)产率的目的。56在共聚物P(HB-CO-HV)的生产过程当中，流加发酵比分批q另外为了减少菌体细胞在生长阶段积累多聚体，也需通过流加的方法来控制培养液中铵离子浓度不小于200mg/L，否则会降低共聚体的产率。5757（三）流加培养条件对多聚体相对分子量的影响 多聚体的相对分子量常常影响其质量和生物降解的速度。不同用途对生物可降解多聚体的平均相对分子质量大小要求不同，一般来说平均相对分子质量大且相对分子质量分布范围窄的多聚体具有更广泛的工业应用前景，并且提取也较为方便。58（三）流加培养条件对多聚体相对分子量的影响58 多聚体的平均相对分子量大小受流加培养条件的影响。当培养条件恒定时，其平均相对分子量也保持相对恒定，因而只要控制适宜的流加培养条件，就可以将相对分子量控制在所需的范围之内。59 多聚体的平均相对分子量大小受流加培养条件的影响。对于共聚物P(HB-CO-HV)而言，由于大多数微生物即使在氮源和磷等因素不受限制的细胞生长阶段也能在胞内积累少量的PHB，因而在加入任何能激发其形成共聚体的基质时，菌体胞内已含有一些均聚物PHB，因而得到的是各种HV单体含量的共聚体的混合物。60 对于共聚物P(HB-CO-HV)而言，q 为了得到更均质的共聚体，在共聚物P(HB-CO-HV)的积累阶段开始时，应先使培养物处于碳源饥饿状态，这样使细胞内源PHB的量大大降低，得到的共聚物也就较为均一。61 为了得到更均质的共聚体，在共聚物P(HB-Cq另外，共聚体中HB/HV单体比例依赖于流加过程中糖/丙酸或者丁酸/戊酸的比例，且基质流加速率应小于其最大可能的利用速率，以避免对细胞有毒性的基质的积累，确保产生的共聚物具有恒定的HB/HV比例。62另外，共聚体中HB/HV单体比例依赖于流加过程中糖/丙酸或者第四节 PHAs的提取qPHB的提取涉及到两个方面的问题：一是方法的合理性，主要表现在提取率、产物的纯度，提取过程是否对PHB的结构产生影响，以及是否方便操作，预后处理是否复杂、环境是否污染等方面。二是过程的经济性，表现在提取的材料的费用、能量的消耗和设备的投资等。63第四节 PHAs的提取PHB的提取涉及到两个方面的问题：一是四、四、PHAs的提取技术的提取技术q有机溶剂法q次氯酸钠提取法q酶法q表面活性剂-次氯酸钠法q其他方法64四、PHAs的提取技术有机溶剂法641.有机溶剂法q对于由真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha)生产PHB，研究初期通常采用的提取方法是有机溶剂法。包括:氯仿、二氯乙烷、1,1,2三氯乙烷、乙酸酐、碳酸乙烯酯及碳酸丙烯酯等。q原理：有机溶剂一方面能改变细胞壁和膜的通透性，另一方面能使PHB溶解到溶剂中，而非PHB的细胞物质(NPCM)不能溶解，从而将PHB与其它物质分离开来。具体操作步骤如图7-5所示。651.有机溶剂法对于由真养产碱杆菌(Ralstonia e图7-5 有机溶剂提取PHB的过程示意图66图7-5 有机溶剂提取PHB的过程示意图66(1)当溶剂中含有超过5%(w/v)的PHB时，溶液变得很粘，要去掉细胞的残余物就变得很困难；(2)提取率难以达到很高；(3)使用大量的有机溶剂；(4)造成严重环境污染，操作不便。优点：点：引起PHB的降解非常小，得到PHB的纯度非常高。因此，用有机溶剂提取PHB通常作为一种实验室方法。有机溶剂的方法的缺点67(1)当溶剂中含有超过5%(w/v)的PHB时，溶液变得很粘2 次氯酸钠提取法q次氯酸钠能够破胞且对细胞中的非PHB的细胞物质的消化很有效，因而用该方法破胞所得产品的纯度较高、提取速度快，避免了有机溶剂提取过程中繁琐的前、后处理工作。q但是PHB分子量只有原来的一半。q具体操作过程见图2。682 次氯酸钠提取法次氯酸钠能够破胞且对细胞中的非PHB的细胞图2 次氯酸钠提取PHB过程示意图69图2 次氯酸钠提取PHB过程示意图69次氯酸钠提取法优点：不使用大量的有机溶剂。缺点：次氯酸钠对PHB分子有严重的降解作用，因而所获得的PHB的分子量较小。70次氯酸钠提取法优点：不使用大量的有机溶剂。70次氯酸钠次氯酸钠/氯仿提取法氯仿提取法 改进：根据氯仿提取时PHB纯度高且被降解程度小，而次氯酸钠对非PHB细胞物质消化很有效的优点，结合PHB疏水亲油物质，而细胞膜具有亲水性的特点的原理，发明了用分散的次氯酸钠/氯仿提取PHB的方法。71次氯酸钠/氯仿提取法 改进：根据氯仿提取时PHB纯度高且 冷冷冻干燥的菌体干燥的菌体+次次氯酸酸钠+氯仿破壁仿破壁 离心离心分离分离 氯仿相中加入非溶仿相中加入非溶剂物物质使使PHB沉淀沉淀 离心离心过滤分离分离 烘干烘干 成品成品72 冷冻干燥的菌体+次氯酸钠+氯仿破壁 q在该方法中次氯酸钠主要起破胞作用，而氯仿则对破胞产生的PHB起保护作用，因而不但可得到较高纯度的PHB，而且PHB被次氯酸钠降解的程度大大降低。同时由于破胞较完全，因而可以获得较好的提取收率。7373q优点：提取率较高，得到的PHB的分子量较大。q缺点：需要大量的有机溶剂，并且操作复杂，限制了工业化生产。74优点：提取率较高，得到的PHB的分子量较大。74三、三、酶法法 基本原理与次氯酸钠法相似，即让大量的NPCM溶解而PHB不溶解，从而达到分离提纯的目的。但是由于NPCM通常包括核酸、类脂物、磷脂、肽聚糖以及蛋白质等物质，因此实际上是通过多种酶的多步或协同作用来达到消化NPCM的目的。75三、酶法75 单独的使用酶来消化细胞中的杂质物质，所得到的PHB的纯度不高，往往要结合其他的方法，例如再用表面活性剂处理，才能得到较高纯度的PHB。该法包括细胞的热处理、酶处理和阴离子表面活性剂处理等步骤，因此操作十分复杂。76 单独的使用酶来消化细胞中的杂质物质，所得到的PH 由于细胞杂质成分比较复杂，特别是酶作用的条件比较苛刻，需要处理的步骤较多、操作较为复杂，因此酶法的应用在提取成本、过程放大方面受到了很大的限制。77 由于细胞杂质成分比较复杂，特别是酶作用四、表面活性四、表面活性剂/次次氯酸酸钠法法 基本原理：当表面活性剂浓度较低时，其单个分子进入到细胞膜的磷脂双层中；随着表面活性剂浓度的增加，更多的表面活性剂分子结合到磷脂双层中，细胞膜的体积就会不断的增大；一旦磷脂双层中的表面活性剂饱和，再增加表面活性剂就会使细胞膜收到破坏，表面活性剂与磷脂形成大量的胶团，胞内PHB物质释放出来。78四、表面活性剂/次氯酸钠法78 冷冷冻干燥菌体表面活性干燥菌体表面活性剂破胞破胞 离心离心过滤分离分离 次次氯酸酸钠洗洗涤 离心离心过滤分离分离 水洗水洗 离心离心过滤分离分离 烘干烘干 产品品79 冷冻干燥菌体表面活性剂破胞 该方法能够比较方便的实现在水相中提取PHB，这是它的突出优点，但要使用大量的表面活性剂，而且次氯酸钠的使用不可避免的造成了PHB的降解。80 该方法能够比较方便的实现在水相中提取PHB，这是它五、其他方法五、其他方法 基因工程技术重组大肠杆菌生产PHB的方法，用氨水从这类细胞中提取PHB就是其中的一种方法。81五、其他方法81各种提取各种提取PHB的方法比较的方法比较 82各种提取PHB的方法比较 82（一）降解机制（一）降解机制1 1 胞内降解胞内降解q胞内PHB的代谢是个循环过程。q 图7-9中第四步到第七步是降解过程。首先(第四步)胞内无定形PHB颗粒在解聚酶作用下降解，形成单体和二聚体的混合物。二聚体随之在二聚体水解酶作用下形成单体。五、五、PHAs的生物降解的生物降解 83（一）降解机制五、PHAs的生物降解 83图图7-9 PHB的代谢过程的代谢过程84图7-9 PHB的代谢过程842 胞外降解胞外降解q 聚羟基丁酸(PHB)的胞外降解有两种机制，在无菌条件下通过水解进行。这种机制对于PHB在医疗方面的应用(如作为药物的缓适载体、手术缝线等)特别重要。在自然环境中，是酶降解机制。许多细菌和真菌可分泌外解聚酶，有些甚至可以利用PHB作为唯一碳源生长。852 胞外降解 聚羟基丁酸(PHB)的胞外降解有两种机制，8（二）（二）PHB在环境中的降解在环境中的降解q影响PHB降解速度的因素较多包括环境类型：微生物种群及活力，水份，温度塑料制品性质：厚度，表面组织形态，孔隙度，制品中的第二组分,如填充料、颜料q在自然环境中，能降解PHB的微生物包括细菌、放线菌、和霉菌等。J.Mergaertd等在土壤中发现有295种微生物可降解PHB，包括105种革兰氏阴性菌，36种革兰氏阳性菌，68种放线菌和86种霉菌。86（二）PHB在环境中的降解影响PHB降解速度的因素较多86 研究表明，在一定的范围之内，PHB的降解速度与温度呈正相关，其降解可以分为两个阶段。第一阶段相对分子量下降；第二阶段是相对分子量下降到13000后开始腐蚀。87 研究表明，在一定的范围之内，PHB的降 环境中有许多微生物能降解PHB，但每种的数量不一定很多，活力不一定很高。当PHB出现在环境中后，经过一定的迟滞期，能降解的PHB的微生物会逐渐增多，活力升高，降解的速度增快。88 环境中有许多微生物能降解PHB，但每种表7-10PHB在环境中的降解在环境中的降解89表7-10PHB在环境中的降解89q通常情况下，PHB厌氧降解比有氧降解快真养产碱杆菌在厌氧条件下，主要代谢产物是乙酸和R3羟基丁酸，乙酰CoA转变成乙酸的同时生成ATP。而在有氧情况下，乙酰CoA完全分解成CO2和H2O，产生12个ATP。q与PHB相比较，有较长侧链的PHA在环境中降解速度较慢，因为低分子量的有机化合物离子化速度比结构复杂的要快，并且长侧链的重复单元增加了PHA的疏水性，抑制或阻碍了微生物在聚体表面的生长。PHB在环境中的降解在环境中的降解90通常情况下，PHB厌氧降解比有氧降解快PHB在环境中的降解9六、PHAs工业化和研究进展(一)影响PHAs工业化的因素(二)国内外研究PHAs的水平(三)研究进展91六、PHAs工业化和研究进展(一)影响PHAs工业化的因素9(一)影响PHAs工业化的因素qPHAs早在20世纪60年代就已引起了人们的广泛关注q在过去几十年中，有数家公司一直在探索PHB工业生产的可能性。q1962，Baptist在美国申请了有关PHB生产的专利。q20世纪80年代初，ICI公司和奥地利生物技术有限公司等将微生物合成PHAs的研究推向试生产阶段。92(一)影响PHAs工业化的因素PHAs早在20世纪60年代就q1982年，ICI公司使用真养产碱杆菌突变株为生产菌种，以葡萄糖为惟一碳源，在35m3气升环流反应器及200m3机械搅拌反应罐内试生产PHB成功，并以葡萄糖加丙酸为碳源生产聚-羟基丁酸和聚-羟基戊酸无序共聚物P(HB-co-HV)。PHB 价格：33美元/kg5.58美元/kg左右聚丙烯的价格(1美元/kg)q降低PHAs的生产成本：菌种、发酵方式、提取方法。931982年，ICI公司使用真养产碱杆菌突变株为生产菌种，以葡9494(二)国内外研究PHAs的水平q国内外的研究内容主要集中于：微生物菌种的改良；发酵生产技术研究，流加发酵控制技术、高密度细胞培养技术；新型反应器研制，提高传氧效率、降低能耗；产品提取工艺开发，降低成本，采用非有机溶剂提取方法。95(二)国内外研究PHAs的水平国内外的研究内容主要集中于：9国内外从事PHAs研究机构q国外英国ICI公司、韩国现代科学技术研究所(KAIST)、奥地利生物技术公司和日本名古屋大学等。q国内起步于20世纪80年代的中后期。中科院微生物所、山东大学、北京农业大学和无锡轻工大学等。中国科学院微生物所、清华大学生物系和化工系均已有批量生产技术。但在PHB提纯方面，目前尚未达到应用水平。96国内外从事PHAs研究机构国外英国ICI公司、韩国现代科学技(三)研究进展q改性q共聚q官能化：如靠原子的引入有可能提高PHAs的绝缘性能，降低材料的表面张力，使PHAs有较高的润滑性、耐热性和耐油性。q结构设计：不同的菌种、改变培养条件，可以调节PHAs的组成q采用廉价底物q构建自溶性PHAs生产菌种：噬菌体q转基因植物97(三)研究进展改性97植物生产PHBq利用细菌发酵生产的PHB价格较高。为降低成本，人们研究利用植物资源生产PHB。相对微生物而言，植物更象一个大加工厂，更适于生产复杂、多样且具特殊用途的塑料原料。目前，人们利用生物工程技术已将关键酶基因导入拟南芥、油菜和向日葵等植物中，从这些转基因植物的细胞质或质体中获得PHB。由于植物生产便于PHB的分离提纯，降低了成本，因此，利用转基因植物生产 PHB使开发生物降解塑料前景广阔。98植物生产PHB利用细菌发酵生产的PHB价格较高。为降低成本，