PCR诱变教学讲解课件

PCRPCR诱变诱变1ppt课件.PCR诱变1ppt课件.PCRPCR诱变诱变（1 1）PCRPCR定点诱变定点诱变（2 2）几种碱基变化的）几种碱基变化的PCRPCR引入引入（3 3）PCRPCR随机诱变（易错随机诱变（易错PCRPCR）2ppt课件.PCR诱变（1）PCR定点诱变2ppt课件.一、一、PCRPCR定点诱变定点诱变 应用应用PCRPCR原理，可以直接进行定点诱变，并且原理，可以直接进行定点诱变，并且不需要采用噬菌体不需要采用噬菌体M13.M13.首先，把需诱变的基因克隆于质粒上，把首先，把需诱变的基因克隆于质粒上，把带有诱变目标基因的质粒，分成两个反应管，带有诱变目标基因的质粒，分成两个反应管，每个反应管加入不同的引物，每个反应管的每个反应管加入不同的引物，每个反应管的一对引物中，有一个引物需按诱变意图改变一对引物中，有一个引物需按诱变意图改变碱基，即该碱基是错配的，每对引物的互补碱基，即该碱基是错配的，每对引物的互补位置不同，同一管中每条几乎处于同一起点位置不同，同一管中每条几乎处于同一起点但放向相反。但放向相反。3ppt课件.一、PCR定点诱变 应用PCR原理，可以直接进行定点诱变，并经经PCRPCR后，每个管产生了含有改变了特定碱基的后，每个管产生了含有改变了特定碱基的产物，但留有缺口。因此，产物是线状的产物，但留有缺口。因此，产物是线状的DNADNA链，由于引物互补位置不同，两个管的产物链，由于引物互补位置不同，两个管的产物的缺口位置也不同，当把两个反应管的产物的缺口位置也不同，当把两个反应管的产物混合，经变性和退火处理，来自不同反应管混合，经变性和退火处理，来自不同反应管的线状的线状DNADNA链可杂交形成双链环状的链可杂交形成双链环状的DNADNA分子，分子，但仍有缺口。由于环化分子可以转化大肠埃但仍有缺口。由于环化分子可以转化大肠埃希菌，在体内可把缺口修复，这样可以获得希菌，在体内可把缺口修复，这样可以获得定点改变了特低碱基的基因。定点改变了特低碱基的基因。4ppt课件.经PCR后，每个管产生了含有改变了特定碱基的产物，但留有缺口5ppt课件.5ppt课件.1 1、重叠延伸、重叠延伸PCR(over-lap extension PCR,PCR(over-lap extension PCR,OE-PCR)OE-PCR)2 2、大引物、大引物PCRPCR法（法（megaprimer PCR)megaprimer PCR)3 3、环状诱变、环状诱变 PCR PCR 法法4 4、TAMS TAMS 定点诱变技术定点诱变技术6ppt课件.1、重叠延伸PCR(over-lap extension 1 1、重叠延伸、重叠延伸PCR PCR（OE-PCROE-PCR）首先设计两个首先设计两个PCRPCR反应以产生两个含反应以产生两个含突变位点的突变位点的DNADNA片段，随后将上述两个片段，随后将上述两个PCRPCR产物混合，二者通过产物混合，二者通过末端互补区结合末端互补区结合并在适宜的温度下并在适宜的温度下互为引物延伸互为引物延伸得到完得到完整的含突变的基因，对第一次整的含突变的基因，对第一次PCRPCR产物进产物进行纯化处理可显著提高突变效率行纯化处理可显著提高突变效率7ppt课件.1、重叠延伸PCR（OE-PCR）首先设计两个P8ppt课件.8ppt课件.2 2、大引物、大引物PCRPCR法法（megaprimer PCR)megaprimer PCR)先设置一个先设置一个PCRPCR反应产生一个含突变的反应产生一个含突变的DNADNA片段，然后再以此片段，然后再以此DNADNA片段作为引物与原模板片段作为引物与原模板退火进行退火进行PCRPCR扩增得到含突变的完整的基因。扩增得到含突变的完整的基因。因为作为引物使用的因为作为引物使用的DNADNA片段较通常的引物要片段较通常的引物要大许多甚至有上百碱基，所以命名为大引物大许多甚至有上百碱基，所以命名为大引物PCRPCR法。法。9ppt课件.2、大引物PCR法（megaprimer PCR)大引物大引物PCR PCR 定点诱变技术路线定点诱变技术路线（圆点指突变位点）（圆点指突变位点）10ppt课件.大引物PCR 定点诱变技术路线（圆点指突变位点）10ppt课3 3、环状诱变、环状诱变 PCR PCR 法法定义：以整个带有目的基因的质粒为模板，用诱变剂定义：以整个带有目的基因的质粒为模板，用诱变剂进行扩增，最后产生环状的带有目的突变的质粒。进行扩增，最后产生环状的带有目的突变的质粒。方法方法：两个引物反向、紧邻但没有重叠区，扩增产物是平两个引物反向、紧邻但没有重叠区，扩增产物是平末端的线性末端的线性DNADNA，需用，需用T4T4连接酶环化处理。连接酶环化处理。以以StratageneStratagene公司开发的定点突变试剂盒为代表，公司开发的定点突变试剂盒为代表，两个引物也是反向的并且其两个引物也是反向的并且其5 5端有端有l5l5个碱基以上的个碱基以上的重叠区，扩增产物为带黏性末端的线性重叠区，扩增产物为带黏性末端的线性DNADNA，可自行，可自行环化。环化。11ppt课件.3、环状诱变 PCR 法定义：以整个带有目的基因的质粒为模板环状诱变环状诱变 PCR PCR 法法12ppt课件.环状诱变 PCR 法12ppt课件.环状诱变环状诱变 PCR PCR 法法13ppt课件.环状诱变 PCR 法13ppt课件.4 4、TAMSTAMS定点诱变技术定点诱变技术 有目的地扩增突变链定点诱变技术有目的地扩增突变链定点诱变技术:能够一次引入多个能够一次引入多个位点的突变，并且能够有目的扩增突变链，从而使突变链位点的突变，并且能够有目的扩增突变链，从而使突变链效率几乎达到效率几乎达到100%100%1 1、线性单链、线性单链DNADNA模板的制备。模板的制备。（线性（线性PCRPCR）2 2、突变链的合成、突变链的合成:用用2 2个锚锭引物个锚锭引物(Anchor5(Anchor5和和Anchor3Anchor3 )和多个诱变引物和多个诱变引物(Mut1(Mut1和和Mut2)Mut2)，首先在多核苷酸激酶的，首先在多核苷酸激酶的作用下使每个引物作用下使每个引物磷酸化磷酸化，接着在，接着在DNADNA聚合酶聚合酶的作用下使的作用下使引物与线性模板退火、延伸，最后在引物与线性模板退火、延伸，最后在DNADNA连接酶连接酶的作用下。的作用下。合成突变链。合成突变链。3 3、有目的地扩增突变链、有目的地扩增突变链：设计扩增引物：设计扩增引物(PCR5(PCR5和和PCR3)PCR3)，使其使其3 3端碱基分别与锚锭引物引入的突变碱基配对，扩端碱基分别与锚锭引物引入的突变碱基配对，扩增引物只能退火到突变链而不是亲本链，所以只有突变链增引物只能退火到突变链而不是亲本链，所以只有突变链才能扩增。才能扩增。14ppt课件.4、TAMS定点诱变技术 有目的地扩增突变链定点诱变TAMSTAMS定点诱变技术定点诱变技术15ppt课件.TAMS定点诱变技术15ppt课件.二二 几种碱基变化的几种碱基变化的PCRPCR引入引入 首先，在诱变引物合成时，按设计使某位置发生首先，在诱变引物合成时，按设计使某位置发生4 4种核苷酸均有出现的可能。例如，要合成一段含三个种核苷酸均有出现的可能。例如，要合成一段含三个G G的引物，只要在的引物，只要在G G原料中加入一定比例的原料中加入一定比例的A A、C C、T T，那么，那么可以出现在可以出现在G G位置上含位置上含G G、A A、T T或或C C的产物。这段引物是的产物。这段引物是结合于基因上需要诱变的位置的。在结合于基因上需要诱变的位置的。在PCRPCR之前，需把目标之前，需把目标目标基因或序列克隆于质粒，并使目标基因两端的质粒上目标基因或序列克隆于质粒，并使目标基因两端的质粒上均有内切酶切点，以方便把克隆片段切出。均有内切酶切点，以方便把克隆片段切出。16ppt课件.二 几种碱基变化的PCR引入 首先，在诱变引物合成时，按设计扩增战略：扩增战略：17ppt课件.扩增战略：17ppt课件.三、三、PCRPCR随机诱变随机诱变 当对目的序列了解很少的情况下，需当对目的序列了解很少的情况下，需要引入大量的随机诱变，构建突变库，再要引入大量的随机诱变，构建突变库，再逐个筛选和鉴定逐个筛选和鉴定策略策略1 1、利用简并引物、利用简并引物2 2、易错、易错 PCR(error-prone PCR)PCR(error-prone PCR)18ppt课件.三、PCR随机诱变 当对目的序列了解很少的情况下，1 1、利用简并引物、利用简并引物 简并引物的特点简并引物的特点 5 5端有十几个碱基是随机组合的。这一方端有十几个碱基是随机组合的。这一方法除引物特殊外，其余均与定点突变技术完法除引物特殊外，其余均与定点突变技术完全一样。利用简并引物可以产生大量随机突全一样。利用简并引物可以产生大量随机突变，并且这些突变都集中在很窄的一段区域变，并且这些突变都集中在很窄的一段区域内。内。19ppt课件.1、利用简并引物 简并引物的特点19ppt课件.2 2 易错易错PCRPCR（error-prone PCRerror-prone PCR）DNADNA聚合酶在进行扩增目的聚合酶在进行扩增目的DNADNA时会以一定的时会以一定的频率发生碱基错配，这一现象恰好提供了一频率发生碱基错配，这一现象恰好提供了一种特定基因进行随机诱变的可能方法。种特定基因进行随机诱变的可能方法。利用利用PCRPCR过程中出现的碱基错配进行特定基因过程中出现的碱基错配进行特定基因随机诱变的技术就称为易错随机诱变的技术就称为易错PCRPCR。原理：较低的聚合酶（如原理：较低的聚合酶（如TaqTaq酶）在特定措施下酶）在特定措施下很容易向扩增产物中掺入随机突变很容易向扩增产物中掺入随机突变20ppt课件.2 易错PCR（error-prone PCR）DNA聚方法：增加方法：增加MgMg2+2+的浓度、改变的浓度、改变dNTPdNTP的比例、调的比例、调 节热循环参数、利用节热循环参数、利用MnMn2+2+替代天然辅助因子替代天然辅助因子 MgMg2+2+、加入、加入dITPdITP（三磷酸脱氧核苷酸类似物）（三磷酸脱氧核苷酸类似物）此方法可获得改善活性和稳定性的突变产物，此方法可获得改善活性和稳定性的突变产物，但易错但易错PCRPCR一般只产生点突变，因此其产生的一般只产生点突变，因此其产生的突变体在多样性方面尚有一定缺陷。突变体在多样性方面尚有一定缺陷。21ppt课件.方法：增加Mg2+的浓度、改变dNTP的比例、调 节热循环 连续易错连续易错PCRPCR（sequential error-prone PCR)sequential error-prone PCR)在通常情况下，经过一次易错在通常情况下，经过一次易错PCRPCR很难获得满很难获得满意结果，由此发展出连续易错意结果，由此发展出连续易错PCRPCR 将一次将一次PCRPCR扩增得到的有用突变基因作为下一扩增得到的有用突变基因作为下一次次PCRPCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。益突变。22ppt课件.连续易错PCR（sequential error-23ppt课件.Thank you!23ppt课件.课件部分内容来源于网络，如对内容有异议或侵权的请及时联系删除！此课件可编辑版，请放心使用！24ppt课件.课件部分内容来源于网络，如对内容有异议或侵权的请及时联系删除此课件下载可自行编辑修改，供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！此课件下载可自行编辑修改，供参考！