鸡胚接种方法培训课件

鸡胚接种方法一、概况w 1911年年Rous和和Murphy首先应用鸡胚培养首先应用鸡胚培养研究肉瘤病毒研究肉瘤病毒(Rous肉瘤肉瘤)的繁殖。的繁殖。w 1938年年Goodpasture和和Burnet等应用鸡胚等应用鸡胚繁殖病毒、繁殖病毒、Cox应用卵黄囊培养立克次氏体。应用卵黄囊培养立克次氏体。2鸡胚接种方法近近些些年年来来由由于于组组织织培培养养技技术术和和分分子子生生物物学学技技术术的的发发展展，鸡鸡胚胚培培养养技技术术在在某某些些方方面面已已被被其其他他技技术术所所取取代代，但但是是其其在在痘痘类类病病毒毒、粘粘液液病病毒毒和和疱疱疹疹病病毒毒的的分分离离、鉴鉴定定、制制备备抗抗原原、疫疫苗苗生生产产以以及及病病毒毒性性质质等等方方面面的的研研究究上上仍仍然然是是很很重重要要的。的。3鸡胚接种方法方方法法 应应 用用 价价 值值 存存 在在 问问 题题动动物物接接种种应用最早；应用最早；方法简便；方法简便；结果易于观察结果易于观察自身带病毒；自身带病毒；有的接种后不敏感；有的接种后不敏感；动物饲养问题动物饲养问题鸡鸡胚胚培培养养来源客观，易于管理，来源客观，易于管理，带病毒机会少；多途径带病毒机会少；多途径接种接种敏感病毒谱窄敏感病毒谱窄细细胞胞培培养养应用广泛，敏感病毒谱应用广泛，敏感病毒谱广广设备技术要求条件设备技术要求条件高高病毒分离培养病毒分离培养4鸡胚接种方法 鸡胚培养法的鸡胚培养法的优点优点：1.它的组织分化程度低，可选择适当途径它的组织分化程度低，可选择适当途径接种，病毒易复制，感染病毒的膜和液体接种，病毒易复制，感染病毒的膜和液体含大量病毒。含大量病毒。2.是个整体，有神经血管的分布及脏器的是个整体，有神经血管的分布及脏器的构造。构造。3.来源充足，操作简单，通常是无菌的，来源充足，操作简单，通常是无菌的，对接种的病毒不产生抗体。对接种的病毒不产生抗体。5鸡胚接种方法 鸡胚培养法的鸡胚培养法的缺点缺点：1.一般的病毒通常不使鸡胚产生特异性的感染指一般的病毒通常不使鸡胚产生特异性的感染指征。征。2.卵黄中常常含有抗家禽病原体的母体抗体。卵黄中常常含有抗家禽病原体的母体抗体。3.某些细菌、衣原体和病毒能够从感染的母鸡传某些细菌、衣原体和病毒能够从感染的母鸡传递到鸡胚。递到鸡胚。4.通常鸡胚常常含有白血病病毒。通常鸡胚常常含有白血病病毒。5.在鸡食物中加入抗菌素，母鸡吃后会传递给鸡在鸡食物中加入抗菌素，母鸡吃后会传递给鸡胚，鸡胚就会产生对立克次体和衣原体感染的抵胚，鸡胚就会产生对立克次体和衣原体感染的抵抗。抗。6鸡胚接种方法二、鸡胚的结构与生理 鸡胚是由三个胚层发育起鸡胚是由三个胚层发育起来的，即来的，即外胚层外胚层，中胚层中胚层和和内内胚层胚层，它们构成胚胎的组织与，它们构成胚胎的组织与器官。器官。（约（约10日龄鸡胚的结构见图）日龄鸡胚的结构见图）7鸡胚接种方法气室鸡胚卵黄囊尿囊腔羊膜腔绒毛尿囊膜卵白卵膜8鸡胚接种方法鸡胚的管理鸡胚的管理（一）鸡胚的选择（一）鸡胚的选择首首选选健健康康莱莱亨亨鸡鸡受受精精卵卵，其其壳壳洁洁白白易易于于观观察察胚胚胎胎，其其他他受受精精卵卵也也可可使使用用。接接种种病病毒毒的的受受精精鸡鸡卵卵应应未未感感染染已已知知病病毒毒或或其其它它微微生生物物（如如新新城城疫疫病病毒毒或或支支原原体体等等），最最好好来来自自无无特特定定病病 原原 体体（specified-pathogens free，SPF）鸡鸡群群，接接种种立立克克次次体体的的受受精精鸡鸡卵卵应应来来自未食用高浓度抗生素的鸡群。自未食用高浓度抗生素的鸡群。9鸡胚接种方法 鸡胚的孵育鸡胚的孵育受受精精鸡鸡卵卵孵孵育育时时不不要要擦擦洗洗，以以免免受受细细菌菌污污染染。最最好好用用能能自自动动调调节节温温度度、湿湿度度、气气流流及及翻翻卵卵的的孵孵卵卵箱箱孵孵育育。如如没没有有，也也可可用用普普通通恒恒温温箱箱，但但要要在在温温箱箱中中放放一一盛盛满满水水的的方方盘盘，以以保保持持适适当当的的湿湿度度。孵孵育育应应在在3739、40%70%的的相相对对湿湿度度下下进进行行。湿湿度度太太高高会会使使气气室室发发育育过过度度，而而湿湿度度过过低低又又会会导导致致气气室室发发育育不不良良，甚甚至至造造成成鸡鸡胚胚死死亡亡。通通气气也也很很重重要要，如如果果空空气气不不流流通通，也也可可造造成成鸡鸡胚胚死死亡亡。为为了了避避免免胚胚胎胎膜膜粘粘连连和和胚胚胎胎发发育育不不均均匀匀，应应每每隔隔一一段段时时间间转转动动一次受精鸡卵。一次受精鸡卵。10鸡胚接种方法检卵检卵在在发发育育的的早早期期，鸡鸡胚胚不不易易辨辨认认，要要到到45天天后后才才容容易易看看见见。因因此此，检检卵卵要要在在孵孵育育45天天后后进进行行。活活的的鸡鸡胚胚绒绒毛毛尿尿囊囊膜膜界界线线较较明明显显，上上面面的的血血管管清清晰晰可可见见、成成网网状状，可可看看到到明明显显的的胚胚胎胎自自主主运运动动。如如果果胚胚胎胎活活动动呆呆滞滞或或不不能能自自主主运运动动，血血管管模模糊糊、变变细细、折折断断脱脱落落，绒绒毛毛尿尿囊囊膜膜界界线线模模糊糊，说说明明鸡鸡胚胚已已濒濒临临死死亡亡或或已经死亡。已经死亡。11鸡胚接种方法 接种前后都要检卵。接种前接种前后都要检卵。接种前检卵是要了解鸡胚的存活情况，检卵是要了解鸡胚的存活情况，标记气室边界和胚胎位置；接种标记气室边界和胚胎位置；接种后检卵是为了观察接种后胚胎的后检卵是为了观察接种后胚胎的状况。状况。12鸡胚接种方法发育正常胚与异常胚的辩别1、正常胚 头照可见眼点明显，血管色鲜红，呈放射状；二照可见整个蛋除气室外均布满鲜红血管（合拢）三照时蛋的小头看不到发亮部分（封门），气室界线边缘血管鲜红。2、弱胚蛋 头照胚体小，呈低阶段纤细血管，眼点不明显；二照可见小头有0.5cm2以上区域无血管分布；三照时小头发亮，气室界线边缘的血管面较大。13鸡胚接种方法3、死胚蛋 头照可见血点、血线或血环紧贴内壳面，血管色因氧化而比活胚深，有时散黄或有灰白色凝块；中期死胚特征是气室界线模糊，胚胎呈黑团状，常与壳粘连，不动，当手摇胚蛋时，胚胎随之转动，停止摇晃时也随之停止。而活胚时刻在活动；三照死胚的小头发亮，血管色深，气室界线模糊，蛋体发凉；对尚未出壳的也可用温水来判断将蛋放入40C温水中，凡是在水中轻微晃动的为活胚，反之则为死胚。14鸡胚接种方法三、材料（一）受精鸡卵（一）受精鸡卵（二）孵卵箱或恒温箱（二）孵卵箱或恒温箱（三）捡卵灯，照卵灯（三）捡卵灯，照卵灯（四）砂轮、三棱针（四）砂轮、三棱针（五）卵盘、卵杯（五）卵盘、卵杯（六六）其其它它：1 1mlml注注射射器器，针针头头，2.5%2.5%碘碘酒酒，75%75%酒酒精精，镊镊子子，无无菌菌生生理理盐盐水水，毛毛细细吸吸管管，橡胶吸头，液体石蜡，蜡和胶布等。橡胶吸头，液体石蜡，蜡和胶布等。15鸡胚接种方法四、接种技术（一）活胚检查（一）活胚检查 1.血管血管：活胚可见清晰的血管，有时可见血管搏动，死胚血管模糊成淤血带或淤血块。2.胎动胎动：活胚可见明显的自然运动，尤其在转动胚胎时，死胚见不到任何胎动，胚胎发红像出血样，有的呈现黑块。3.血管网是否丰满血管网是否丰满：发育好的鸡胚可见密布丰满的血管网，也就是绒毛尿囊膜，死胚则见不到这一现象。16鸡胚接种方法17鸡胚接种方法第一天w胚盘直径0.7cm，胚重0.2mg，在胚盘明区形成原条，其前方为原结，原结前端为头突，头突发育形成脊索神经管，中胚层的细胞沿着经管两侧，形成左右对称的呈方形薄片的体节4-5对，中胚层进入暗区在胚部的边缘出现许多红点，俗称血岛；18鸡胚接种方法第二天w胚盘直径1.0cm，胚重3mg，卵黄囊羊膜绒毛膜开始形成，胚胎头部开始从胚盘分离出来，血岛合并形成血管，入孵25小时心脏开始形成，30-42小时后心脏开始跳运，可见到20-27对体节，照蛋时可见卵黄囊血管区，形似樱桃，俗称樱桃珠19鸡胚接种方法第三天w胚长0.55cm，胚重20mg，尿囊开始长出，胚的位置与蛋的长轴垂直，开始形成前后肢芽，出现5个脑胞的原基，眼的色素开始沉着，有35对体节，照蛋时，可见胚和伸展的卵黄囊血管形似蚊子，俗称“蚊虫珠”；20鸡胚接种方法第4天w胚长0.77cm，胚重50mg，孵黄囊血管包围蛋黄达1/3，肉眼明显看到尿囊，羊膜腔形成，胚和蛋黄分离，由于中脑迅速生长，胚胎头部明显增大，舌开始形成，照蛋时蛋黄不容易转动，胚与卵黄囊血管形似蜘蛛，俗称小蜘蛛；21鸡胚接种方法第5天w胚长1.0cm，胚重0.13g，生殖腺已性分化，组织学上可确定胚的公母，胚极度弯曲，整个胚胎成“C”形，可见指（趾）原基，眼的黑色素大量沉着，照蛋时可明显看到黑色的眼点，俗称单珠或黑眼；22鸡胚接种方法第6天w胚长1.38cm，胚重0.29g，尿囊已达蛋壳膜内表面，卵黄囊分布在蛋黄表面的1/2以上，由于羊膜壁上的平滑肌收缩，胚胎有规律运动，蛋黄由于蛋白水分的渗入而达到最大重量，由约占蛋重的30.01%增至65.48%，喙原基出现，躯干部增长，翅脚已可区分，照蛋时，可见头部和增大的躯干部两个小圆团，俗称双珠；23鸡胚接种方法第7天w胚长1.42cm，0.57g，尿囊液急剧增加，上喙前端出现小白点形的破壳器（卵齿），口腔鼻孔肌胃形成，胚胎已显示鸟类特征，胚胎自身有体温，照蛋时胚在羊水中不容易看清，半个蛋表面布满血管；24鸡胚接种方法第8天w胚 长 1.5cm，胚 重1.15g，肋骨肺胃明显可辨，颈背四肢出现羽毛，乳头突起，右侧卵巢开始退化，照蛋时胚在羊水中浮游，背面两边蛋黄不易晃动，俗称边口发硬；25鸡胚接种方法第9天w胚 长 2cm，胚 重1.53g，喙开始角质化，软骨开始骨化，眼睑已达虹膜，解剖时心肝胃肾肠已发育良好，尿囊几乎包围整个胚胎，照蛋时可见卵黄两边易晃动，尿囊血管伸展越过卵黄囊，俗称窜筋；26鸡胚接种方法第10天w胚 长 2.1cm，胚 重2.26g，尿囊血管到达蛋的小头，整个背颈、大腿部都覆盖有羽毛，乳头突起、龙骨突形成，照蛋时可见尿囊血管在蛋的小头合拢，除气室外，整个蛋布满血管，俗称合拢；27鸡胚接种方法第11天w胚长2.54cm，胚重3.68g，背部出现绒毛，腺胃明显可辩，冠锯齿状，尿囊液达最大量，照蛋时血管加粗，色加深；28鸡胚接种方法第12天w胚长3.57cm，胚重5.07g，身躯覆盖绒毛，肾肠开始有功能，开始用喙吞食蛋白29鸡胚接种方法第13天w胚长4.34cm，胚重7.37g，头部和身体大部分覆盖绒毛，胫趾出现角质鳞片原基，蛋白通过浆羊膜道迅速进入羊膜腔，眼睑达瞳孔，照蛋时蛋小头发亮部分随胚龄增加而逐渐减少30鸡胚接种方法第14天w胚长4.7cm，胚重9.74g，胚胎全身覆盖绒毛，头向气室，胚胎开始改变为横着的位置，逐渐与蛋长横平行31鸡胚接种方法（二）接种途径（二）接种途径1.尿囊腔接种尿囊腔接种：该途径一般用于流感、新城鸡瘟病毒和腮腺炎的适应和传代。2.羊膜腔接种羊膜腔接种：这途径主要用于临床材料（如患者的鼻洗液及咽漱液）分离病毒。3.卵黄囊接种卵黄囊接种：该接种途径主要用于抗流感病毒药物实验。4.绒毛尿囊膜绒毛尿囊膜壳块培养法壳块培养法：该法可用于流感病毒滴定、中和试验和药物实验。32鸡胚接种方法1.尿囊腔接种尿囊腔接种尿尿囊囊腔腔接接种种常常用用于于流流感感病病毒毒、新新城城疫疫病病毒毒和和腮腮腺腺炎炎病病毒毒的的适适应应和和传传代代。进进入入尿尿囊囊腔腔的的这这些些病病毒毒，能能够够在在尿尿囊囊的的内内胚胚层层细细胞胞中中大大量量繁繁殖殖，随随后后释释放放到到尿尿囊囊液液中中。由由于于这这一一接接种种途途径径可可获获得得大大量量的的病病毒毒，也也常常被被用用于于大大量量制制备备抗抗原、疫苗等。原、疫苗等。33鸡胚接种方法接种方法：接种方法：选选9 91111日日龄龄鸡鸡胚胚照照检检后后，标标出出气气室室边边界界和和胚胚胎胎位位置置。在在胚胚胎胎面面气气室室上上方方靠靠近近边边界界23mm处处，避避开开血血管管作作一一标标记记，用用碘碘酒酒消消毒毒标标记记处处的的卵卵壳壳，在在标标记记处处钻钻一一孔孔，再再次次用用碘碘酒酒消消毒毒钻钻孔孔区区，将将注注射射器器针针头头经经孔孔刺刺入入尿尿囊囊腔腔，注注入入0.10.10.20.2mlml接接种种物物，将将蜡蜡熔熔化化封封孔孔，33333535孵孵育育48487272小小时时。每日照检，每日照检，2424小时内死亡的应弃去。小时内死亡的应弃去。34鸡胚接种方法收获：收获：收收获获前前先先将将鸡鸡卵卵置置4冷冷冻冻618小小时时，如如急急于于收收获获也也可可将将鸡鸡胚胚置置-20-20、1 1小小时时左左右右。冷冷冻冻后后的的鸡鸡卵卵钝钝端端向向上上置置于于卵卵杯杯上上，将将气气室室上上方方卵卵壳壳用用碘碘酒酒或或70%70%的的酒酒精精消消毒毒后后去去除除，暴暴露露壳壳膜膜，用用无无菌菌镊镊子子小小心心地地将将壳壳膜膜从从绒绒毛毛尿尿囊囊膜膜上上撕撕下下，不不要要损损伤伤绒绒毛毛尿尿囊囊膜膜。用用注注射射器器或或吸吸管管经经绒绒毛毛尿尿囊囊膜膜刺刺入入尿尿囊囊腔腔，吸吸出出尿尿囊囊液液，置置低低温温保保存存。同同时做无菌培养。时做无菌培养。35鸡胚接种方法2.羊膜腔接种羊膜腔接种 羊羊膜膜腔腔接接种种主主要要用用于于从从临临床床或或现现场场材材料料（如如患患者者咽咽漱漱液液等等）中中分分离离病病毒毒。接接种种到到羊羊膜膜腔腔中中的的接接种种物物能能够够被被胚胚胎胎吞吞咽咽和和进进入入呼呼吸吸管管，可可遍遍及及各各种种组组织织和和细细胞胞，使使具具有有特特定定细细胞胞亲亲嗜嗜性性的的病病毒毒被被充充分分利利用用，从从而而提提高高病病毒毒繁繁殖殖的的可可能能性性。由由于于可可收收获获的的羊羊膜膜组组织织或或羊羊水水较较少少，为为了了使使病病毒毒适适应应在在尿尿囊囊内内胚胚层层生生长长，从从而而获获得得大大量量的的病病毒毒，可可将将经经羊羊膜膜腔腔接接种种分分离离到到的的病病毒毒再再经经尿尿囊囊腔腔传代。传代。36鸡胚接种方法接种方法：接种方法：选选1012日日龄龄鸡鸡胚胚检检卵卵后后，标标出出气气室室边边界界和和胚胚胎胎位位置置。用用碘碘酒酒消消毒毒鸡鸡卵卵钝钝端端（气气室室上上方方）的的蛋蛋壳壳，在在气气室室上上方方靠靠近近胚胚胎胎侧侧的的卵卵壳壳上上钻钻一一孔孔，钻钻孔孔区区再再次次用用碘碘酒酒消消毒毒。用用无无菌菌眼眼科科小小剪剪子子沿沿钻钻孔孔周周围围剪剪去去少少许许，开开一一小小窗窗，勿勿损损伤伤内内层层壳壳膜膜，经经小小窗窗向向气气室室内内滴滴入入一一滴滴无无菌菌液液体体石石蜡蜡。将将卵卵置置照照卵卵灯灯上上，可可清清楚楚地地看看到到胚胚胎胎的的位位置置。将将注注射射器器瞄瞄准准胚胚胎胎的的腭腭下下胸胸前前，刺刺入入后后注注入入0.10.2ml接接种种物物。用用沾沾有有碘碘酒酒通通过过火火焰焰的的小小块块胶胶布布将将窗窗口口封封上上。接接种种后后的的受受精精卵卵根根据据接接种种的的病病毒毒在在33、35或或37的条件下孵育的条件下孵育4872小时。小时。37鸡胚接种方法收获：收获：收收获获前前先先将将鸡鸡卵卵置置4冷冷冻冻618小小时时，时时间间不不能能过过长长，过过长长会会引引起起散散黄黄。冷冷冻冻后后的的鸡鸡卵卵钝钝端端向向上上置置于于卵卵杯杯上上，将将气气室室上上方方卵卵壳壳用用碘碘酒酒或或75%75%的的酒酒精精消消毒毒后后去去除除，暴暴露露壳壳膜膜，用用无无菌菌镊镊子子小小心心地地去去除除壳壳膜膜，使使其其与与绒绒毛毛尿尿囊囊膜膜分分开开，不不要要损损伤伤绒绒毛毛尿尿囊囊膜膜。用用注注射射器器或或吸吸管管经经绒绒毛毛尿尿囊囊膜膜刺刺入入尿尿囊囊腔腔，吸吸出出尿尿囊囊液液。然然后后，一一只只手手持持镊镊子子将将羊羊膜膜轻轻轻轻提提起起，另另一一只只手手持持注注射射器器或或吸吸管管刺刺入入羊羊膜膜腔腔吸吸取取羊羊水水，置置低低温温保保存存。同同时时做无菌培养。做无菌培养。38鸡胚接种方法39鸡胚接种方法3.绒毛尿囊膜接种绒毛尿囊膜接种绒绒毛毛尿尿囊囊膜膜接接种种常常常常用用于于分分离离和和繁繁殖殖在在绒绒毛毛尿尿囊囊膜膜上上产产生生斑斑和和痘痘的的病病毒毒，如如牛牛痘痘、天天花花、单单纯纯疱疱疹疹和和鸟鸟痘痘病病毒毒。可可在在绒绒毛毛尿尿囊囊膜膜上上滴滴定定这这些些病病毒毒，因因为为感感染染性性病病毒毒颗颗粒粒的的量量可可以以通通过过产产生生的的斑斑和和痘痘的的数数目目来来计计算算。还还可可用用于于抗抗体体滴滴定定试试验验，因因为为斑斑和和痘痘的的个个数数减减少少的的程程度与抗体浓度有关。度与抗体浓度有关。40鸡胚接种方法定位：定位：将胎盘部分将胎盘部分及自然气室部分用铅及自然气室部分用铅笔画出，在胎盘与蛋笔画出，在胎盘与蛋白交界处（无血管区）白交界处（无血管区）画一直径约画一直径约1cm的等的等边三角形。边三角形。卵窗41鸡胚接种方法 气室鸡胚卵黄囊尿囊腔羊膜腔绒毛尿囊膜卵白卵膜42鸡胚接种方法取卵壳：取卵壳：消毒后取下所画三角形区域的消毒后取下所画三角形区域的卵壳，注意卵膜不要碰破，于卵膜中央刺卵壳，注意卵膜不要碰破，于卵膜中央刺一小口（不要伤及绒毛尿囊膜），一小口（不要伤及绒毛尿囊膜），造人工气室造人工气室：在自然气室部分用大注射：在自然气室部分用大注射器针头钻一孔，用橡皮头自气室端小孔将器针头钻一孔，用橡皮头自气室端小孔将气室中空气吸出，使绒毛尿囊膜下陷形成气室中空气吸出，使绒毛尿囊膜下陷形成一一“人工气室人工气室”43鸡胚接种方法n接种：接种：去除卵膜，于绒毛尿囊膜上去除卵膜，于绒毛尿囊膜上滴上病毒滴上病毒0.10.2ml。n封口：封口：用胶布封口，胶布事先用碘用胶布封口，胶布事先用碘酒消毒，并通过火焰烧去余碘。酒消毒，并通过火焰烧去余碘。n培养：培养：放入温箱培育放入温箱培育4天，然后收天，然后收获病毒。获病毒。44鸡胚接种方法收获：收获：收收获获前前检检卵卵，看看人人工工气气室室是是否否仍仍然然存存在在，如如果果不不存存在在，轻轻轻轻地地吸吸气气室室上上的的孔孔。用用碘碘酒酒消消毒毒人人工工气气室室上上的的卵卵壳壳，去去掉掉壳壳和和壳壳膜膜至至人人工工气气室室的的边边缘缘，尽尽量量最最大大范范围围地地暴暴露露绒绒毛毛尿尿囊囊膜膜，用用无无菌菌剪剪子子沿沿人人工工气气室室的的边边缘缘将将接接种种病病毒毒的的绒绒毛毛尿尿囊囊膜膜剪剪下，低温保存。同时做无菌培养。下，低温保存。同时做无菌培养。45鸡胚接种方法4.卵黄囊接种卵黄囊接种 卵黄囊接种常用于分离和繁殖卵黄囊接种常用于分离和繁殖立克次体，也可用于分离和传代衣立克次体，也可用于分离和传代衣原体。这些大的病原微生物易于在原体。这些大的病原微生物易于在沿卵黄排列的内胚层细胞中生长。沿卵黄排列的内胚层细胞中生长。46鸡胚接种方法接种方法：接种方法：选选用用5 56 6日日龄龄鸡鸡胚胚，因因为为卵卵黄黄囊囊在在这这个个阶阶段段比比较较大大，易易于于接接种种，并并为为病病毒毒的的繁繁殖殖提提供供了了一一个个比比较较大大的的表表面面。检检卵卵后后，用用碘碘酒酒消消毒毒气气室室端端卵卵壳壳，在在气气室室中中心心的的卵卵壳壳上上钻钻一一孔孔，再再次次用用碘碘酒酒消消毒毒钻钻孔孔处处，将将注注射射器器的的针针头头经经钻钻孔孔沿沿卵卵的的纵纵轴轴刺刺入入3 3cmcm左左右右，进进入入卵卵黄黄囊囊中中，通通常常注注入入0.50.51 1mlml接接种种物物。用用蜡蜡熔熔化化封封口口，35353737孵孵育育3 38 8天天，视视接接种种的的病病毒毒或或立立克次体而定。克次体而定。47鸡胚接种方法图5-5 卵黄囊接种示意图48鸡胚接种方法收获：收获：先先将将鸡鸡胚胚冷冷冻冻，去去除除气气室室上上方方卵卵壳壳，用用无无菌菌镊镊子子揭揭去去壳壳膜膜，撕撕开开绒绒毛毛尿尿囊囊膜膜后后，将将鸡鸡胚胚内内容容物物倒倒入入无无菌菌培培养养皿皿中中，注注意意要要避避免免内内容容物物沿沿卵卵壳壳流流下下而而发发生生污污染染。将将鸡鸡胚胚从从卵卵黄黄囊囊上上剪剪下下，如如收收获获鸡鸡胚胚，则则去去双双眼眼、爪爪和和嘴嘴，置置无无菌菌瓶瓶中中低低温温保保存存。倒倒出出卵卵黄黄囊囊中中的的卵卵黄黄，用用生生理理盐盐水水将将卵卵黄黄囊囊洗洗净净，置置无无菌菌培培养养皿皿或或烧烧瓶瓶中中低温保存。并取一块做无菌试验。低温保存。并取一块做无菌试验。49鸡胚接种方法注意事项 鸡胚为一活的有机体，因此要严格无菌操作，同时动作要仔细，以免造成物理死亡。接种后24小时内死亡应不计结果。50鸡胚接种方法收获物的检测收获物的检测（一）无菌试验（一）无菌试验鸡鸡胚胚培培养养所所收收获获的的材材料料应应当当未未受受细细菌菌污污染染。检检查查收收获获物物是是否否受受到到细细菌菌污污染染，可可在在收收获获时时取取一一小小块块组组织织或或将将第第一一滴滴液液体体（如如尿尿囊囊液液）放放入入盛盛有有2 23 3mlml无无菌菌肉肉汤汤的的小小试试管管中中，3737培培养养3636小小时时。如如肉肉汤汤依依旧旧清清亮亮透透明明，无无菌菌落落出出现现，说说明明没没有有污污染染；如如肉肉汤汤变变混混浊浊，有有絮絮状状菌菌落落出出现现，说说明明受受到到细细菌菌污染。被细菌污染的收获物应灭菌后弃掉。污染。被细菌污染的收获物应灭菌后弃掉。51鸡胚接种方法病毒检测检测鸡胚培养的收获物中是否有病毒存在，有直接观察法和试验法两种方法。1、直接观察法有些病毒在鸡胚中繁殖，可对鸡胚产生眼睛可见的直接损害，可通过直接观察法确认病毒的存在。52鸡胚接种方法 这些损害有：这些损害有：（1 1）在绒毛尿囊膜上形成特殊的增生性损）在绒毛尿囊膜上形成特殊的增生性损害或痘疱，如各种痘类病毒和疱疹病毒，常害或痘疱，如各种痘类病毒和疱疹病毒，常产生白色或灰色痘疱，并常伴有膜上血管充产生白色或灰色痘疱，并常伴有膜上血管充血，偶可见出血；血，偶可见出血；（2 2）引起鸡胚死亡，如新城疫病毒、流行）引起鸡胚死亡，如新城疫病毒、流行性乙型脑炎病毒，但应与接种损伤和细菌污性乙型脑炎病毒，但应与接种损伤和细菌污染引起的死亡区别开；染引起的死亡区别开；（3 3）造成鸡胚特殊损害和胚胎生长迟缓）造成鸡胚特殊损害和胚胎生长迟缓53鸡胚接种方法2、试验法、试验法 有些病毒在鸡胚中繁殖并不造成可见有些病毒在鸡胚中繁殖并不造成可见损害，直接观察无法确认病毒的存在，损害，直接观察无法确认病毒的存在，必须用试验加以证实。有些病毒能引起必须用试验加以证实。有些病毒能引起红细胞凝集，可对羊水或尿囊液进行血红细胞凝集，可对羊水或尿囊液进行血凝试验证明病毒的存在，如流感病毒、凝试验证明病毒的存在，如流感病毒、新城疫病毒和流行性腮腺炎病毒等。还新城疫病毒和流行性腮腺炎病毒等。还可以用特异性免疫血清与收获的液体或可以用特异性免疫血清与收获的液体或组织做补体结合试验来证明病毒的存在。组织做补体结合试验来证明病毒的存在。54鸡胚接种方法 第五节 鸡胚接种技术的应用一、人类与动物病毒的培养、分离与鉴定1流感病毒的分离和鉴定 病人须采集发病初期（一般为前3天）鼻咽洗液或含漱液，加青、链霉素杀菌后，接种于鸡胚羊膜腔内及尿囊腔中，35孵育24 d后，取羊水、尿囊液做血凝试验，检查有无病毒增殖。若试验为阴性，需在鸡胚中盲目传代三次后再试验。若血凝试验为阳性，可用已知流感病毒各型特异性抗体与新分离病毒进行血凝抑制试验鉴定型别。55鸡胚接种方法 2禽流感病毒的分离和鉴定 由于所有的禽流感病毒毒株都能在鸡胚中增殖，所以用其进行分离培养AIV及其它研究最为常见。56鸡胚接种方法3其他病毒的分离和鉴定 介绍一些病毒在鸡胚中的繁殖情况。病 毒胚龄（日）适宜接种途径 孵育 孵育 收获 时间 温度（）表现 材料流行性感冒912尿囊腔、羊膜腔3648h 3335 血凝尿囊液、羊水水痘 1013绒毛尿囊膜35d37痘疱绒毛尿囊膜牛痘 1012绒毛尿囊膜23 d37 死亡、痘疱 绒毛尿囊膜天花 1012 绒毛尿囊膜3 d37 死亡、痘疱绒毛尿囊膜流行性腮腺炎 912尿囊腔、羊膜腔57 d35血凝尿囊液、羊水流行性乙脑 68卵黄囊 3 d37 死亡 绒毛尿囊膜新城疫911绒毛尿囊、羊膜腔4 d32 死亡、血凝 绒毛尿囊膜57鸡胚接种方法 二、疫苗的研制流感疫苗是将流感病毒接种到鸡胚里，大量繁殖后经减毒或杀灭以后制成的，其有减毒活疫苗和灭活疫苗两种。活疫苗是用活的流感病毒经减毒处理以后制成的疫苗，灭活疫苗是把大量流感病毒杀灭后制成的。58鸡胚接种方法病毒的红细胞凝集试验（病毒的红细胞凝集试验（HAHA）血凝素（血凝素（hemagglutinin HA）：）：由由病毒基因编码的糖蛋白刺突。与病毒病毒基因编码的糖蛋白刺突。与病毒吸附和传入宿主细胞有关。吸附和传入宿主细胞有关。HA能与人能与人或其它动物多种红细胞表面或其它动物多种红细胞表面N乙酰神乙酰神经氨酸酶受体结合引起红细胞凝集。经氨酸酶受体结合引起红细胞凝集。59鸡胚接种方法Haemagglutination(HA)virusNo virus60鸡胚接种方法61鸡胚接种方法一、一、概念概念病毒的红细胞凝集现象：病毒的红细胞凝集现象：许许多多病病毒毒表表面面有有血血凝凝素素，能能与与各各种种动动物物的的红红细细胞胞表表面面受受体体结结合合，而而出出现现红红细细胞胞凝凝集集现现象象，简简称为病毒的血凝现象。称为病毒的血凝现象。62鸡胚接种方法二、应用二、应用当当动动物物感感染染某某病病毒毒而而发发病病时时，可在机体的相应器官查出病毒。可在机体的相应器官查出病毒。病病毒毒进进入入动动物物机机体体，将将发发生生特特异异性性免免疫疫反反应应，即即产产生生免免疫疫物物质质抗抗体体，而而抗抗体体90%90%都都存在于动物的血清中。存在于动物的血清中。63鸡胚接种方法病病毒毒相相当当于于免免疫疫效效应应物物质质中中的抗原。的抗原。抗抗原原和和抗抗体体发发生生特特异异性性结结合合反应。反应。当当以以被被检检动动物物的的某某一一器器官官为为病病料料，进进行行HAHA试试验验，结结果果为为阳阳性性者者，证证明明该该被被检检材材料料中中有有能能凝集红细胞的某种病毒。凝集红细胞的某种病毒。64鸡胚接种方法凝凝集集价价的的测测定定：将将被被检检病病毒毒材材料料，稀稀释释成成不不同同的的稀稀释释倍倍数数，进进行行HAHA试试验验，出出现现血血凝凝现现象象的的各各稀稀释释孔孔中中，能能出出现现病病毒毒的的红红细细胞胞凝凝集集现现象象的的病病毒毒的的最最大大稀稀释释倍倍数数者者即即定定为为凝集价。凝集价。65鸡胚接种方法凝凝集集价价稀稀释释倍倍数数中中所所含含病病毒毒数叫一个病毒的凝集单位。数叫一个病毒的凝集单位。在病毒的红细胞凝集抑制试在病毒的红细胞凝集抑制试验（验（HIHI试验）中，确定病毒的试验）中，确定病毒的稀释倍数，应按含有稀释倍数，应按含有4 4个病毒个病毒凝集单位为标准。凝集单位为标准。66鸡胚接种方法2.2.用用上上述述注注射射器器，采采用用无无菌菌法法抽抽取取健健康康的的未未免免疫疫鸡鸡的的静静脉脉血，与抗凝剂等量。血，与抗凝剂等量。3.3.混混匀匀，加加生生理理盐盐水水适适量量，洗洗涤涤离离心心，共共离离心心三三次次（第第一一、二二次次20002000转转/分分5 5分分钟钟、第第三三次次30003000转转/分分 8 8分分钟钟）洗洗去去血血清及白细胞。清及白细胞。所所余余的的纯纯红红细细胞胞，用用生生理理盐盐水水稀稀释释100100倍倍，即即成成1%1%的的鸡鸡红红细胞悬液。细胞悬液。68鸡胚接种方法（二）按下表顺序加样二）按下表顺序加样 弃去弃去.025试管号试管号 123.10对照对照 对照对照 生生 理盐水理盐水 0.025 0.025 0.025.0.025 0.025 0.025 病病 毒毒 0.025 0.025 0.025.0.025 0.025 0.0 红细胞红细胞 0.025 0.025 0.025.0.025 0.00.025 病毒稀释病毒稀释倍数倍数 21 22 23.210 69鸡胚接种方法（三）置于振荡器上振荡（三）置于振荡器上振荡1 1分钟。分钟。（四）（四）3737恒温箱恒温箱2020分钟观察结果。分钟观察结果。（五）判定结果：（五）判定结果：（）凝凝集集反反应应者者，凝凝集集的的红红细细胞胞呈呈薄薄膜膜状状，均均匀匀的的复复满满孔孔底底，有有的的似有红细胞沉积于中央。似有红细胞沉积于中央。（）红红细细胞胞全全部部沉沉于于孔孔底底中中央央，周围无散在的红细胞。周围无散在的红细胞。70鸡胚接种方法6）观察结果：一层红细胞均匀地铺于孔壁上者为+。基本同上，但边缘不整齐，铺的面积稍小些者为+。红细胞形成一个环状，四周有小凝集块者为+。红细胞形成一个小团，但边缘不光滑，四周有小凝块者为+。如用鸡红细胞于孔底形成一个小团，边缘光滑有立体感，将板倾斜片刻，就可见红细胞滑动像人的眼泪样为-。如用豚鼠或人红细胞形成一个小圆圈，边缘光滑无任何小凝集者为-。“”即为可疑，计算时以“-”（阴性）处理。71鸡胚接种方法HaemagglutinationDilution248163264 128 256 512prozonetitre1024Novirus72鸡胚接种方法病毒的红细胞凝集抑制试验（病毒的红细胞凝集抑制试验（HI）一、一、概念概念病毒引起的血凝现象能被相应的抗血凝病毒引起的血凝现象能被相应的抗血凝素抗体所抑制，称血凝抑制。利用血凝素抗体所抑制，称血凝抑制。利用血凝素特异性抗体与病毒表面相应的素特异性抗体与病毒表面相应的HAHA相互相互作用，使病毒血凝现象抑制的试验称血作用，使病毒血凝现象抑制的试验称血凝抑制试验。凝抑制试验。73鸡胚接种方法血凝原理血凝抑制原理74鸡胚接种方法血血清清学学试试验验：体体外外的的抗抗原原抗抗体体反反应应叫叫血血清学试验。清学试验。HIHI试试验验：病病毒毒的的红红细细胞胞凝凝集集现现象象，可可以以被特异性免疫血清所抑制，称被特异性免疫血清所抑制，称HIHI试验。试验。抗体效价：出现红细胞凝集抑制现象的抗体效价：出现红细胞凝集抑制现象的血清的最大稀释倍数叫抗体效价。血清的最大稀释倍数叫抗体效价。75鸡胚接种方法二、动物体内抗体存在情况二、动物体内抗体存在情况病病畜畜体体内内，因因受受病病毒毒抗抗原原刺刺激激，产产生生大大量量相相应应抗抗体体，故故体内抗体效价较高。体内抗体效价较高。健健康康动动物物，免免疫疫接接种种后后，因因受受疫疫苗苗（抗抗原原）刺刺激激，而而发发生生免免疫疫应应答答反反应应，体体内内抗抗体体效价较高。效价较高。76鸡胚接种方法三、实验材料：微量血凝反三、实验材料：微量血凝反应板、振荡器、微量移液应板、振荡器、微量移液器、生理盐水、病毒（器、生理盐水、病毒（4 4个个血凝单位）、红细胞悬液、血凝单位）、红细胞悬液、恒温箱、被检血清等。恒温箱、被检血清等。77鸡胚接种方法试管号试管号 123.10对照 对照 血清稀释倍数血清稀释倍数 21 22 23.210 生理盐水生理盐水 0.025 0.025 0.025.0.025 0.025 0.025血清血清 0.025 0.025 0.025.0.025 0.025病毒病毒 0.025 0.025 0.025.0.025 0.025振荡1分钟，37温箱10分钟 红细胞悬液红细胞悬液 0.025 0.025 0.025 0.025.0.025 0.025 振荡1分钟，37温箱1520分钟 四、方法与步骤：78鸡胚接种方法血凝抑制试验结果判定测定孔 RBC沉于孔底中心，呈纽扣状。(+)凝集 （-）血清对照孔：RBC沉于孔底，无自凝病毒对照孔：凝集RBC对照孔：无自凝血凝抑制试验效价：呈完全血凝抑制使的最高血清稀释度。79鸡胚接种方法（五）判定结果：（五）判定结果：诊断疫病诊断疫病抗抗体体效效价价大大于于2 25 5或或效效价价值值参参差差不不齐齐，并并伴伴有有相相应应病病症症者为阳性。者为阳性。抗体效价为抗体效价为2 24 4为可疑。为可疑。抗体效价小于抗体效价小于2 23 3为阴性。为阴性。80鸡胚接种方法免疫监测免疫监测雏雏鸡鸡母母源源抗抗体体效效价价在在2 23 3以以下下时时，对对免免疫疫接接种种有有应应答答反反应应，此此时时可可以以注注谢谢疫疫苗苗，如如不不及及时时接种，有感染疫病的可能。接种，有感染疫病的可能。成成鸡鸡抗抗体体效效价价在在2 25 5以以下下时时，应立即注射疫苗。应立即注射疫苗。81鸡胚接种方法