血液系统疾病动物模型制备课件

20172017年年1 1月月8 8日日ZeyunZhuZeyunZhu血液系统疾病动物模型制备及应用血栓形成的动物模型贫血的动物模型DIC的动物模型血液系统疾病动物模型制备及应用一一.血栓形成的实验动物模型血栓形成的实验动物模型在活体心血管系统内血液成分形成固体质块的过程称为血栓形成(thrombosis)。血管的止血功能血管的止血功能血液凝固反应血液凝固反应血小板的作用血小板的作用3机体的止、凝血功能血小板血小板纤维蛋白纤维蛋白血管壁的损伤：内皮损伤，内皮下基质(ECM)裸露血流状态的改变：血流缓慢或涡流形成血液性质的改变：高凝状态血栓形成的机理：血管内皮损伤 损伤的因素：感染、免疫因素、机械性损伤、损伤的因素：感染、免疫因素、机械性损伤、化学物质和代谢产物的作用化学物质和代谢产物的作用 促血栓形成机制：u内皮屏障缺失:暴露内皮下粘附分子，促血小板聚集u内皮下的胶原纤维暴露，从而激活因子，内源性凝血系统被激活。u内皮促凝作用增强：表达组织因子,激活外凝系统u抗凝作用减弱：TFPI、AT-III、TM减少u纤溶作用减弱：t-PA和PAI-1比例失调，t-PA减少u血管收缩和痉挛：ET、PAF增多，PGI2和NO减少血流变慢，有利于血栓形成图9-1凝血瀑布反应过程：TF：组织因子；PL：磷脂；Fbg：纤维蛋白原；SFM：可溶性纤维蛋白单体；Fibrin：交联的纤维蛋白；“a”的表示活化因子凝血酶原激活凝血酶原激活物的形成物的形成凝血酶的形成凝血酶的形成纤维蛋白的形成纤维蛋白的形成4万倍万倍凝凝 血血 系系 统统 血小板的粘附与活化形成纤维蛋白纤维蛋白原聚合血管性血友病因子粘附释放因子因子I,纤维蛋白原、因子纤维蛋白原、因子II,凝血酶原、因子凝血酶原、因子III,组织因子组织因子抑制抑制II,X活化活化促促t-PA,u-PA释放释放抗抗 凝凝 血血 系系 统统体液抗凝系统体液抗凝系统(续续)纤溶酶原纤溶酶原纤溶酶纤溶酶抑制物抑制物外激活途经：外激活途经：t-PA,u-PA,内激活途径：内激活途径：IIa,f,KFbg FDP Fbn Fbg FDP Fbn (A,B,C,X,Y,D,E)(A,B,C,X,Y,D,E)1、纤溶酶原的激活纤溶酶原的激活2、纤维蛋白的降解纤维蛋白的降解纤纤 溶溶 系系 统统1.兔体外血栓形成模型兔体外血栓形成模型造模原理：血流缓慢或有涡流,血小板进入边流,增加黏附于管壁的可能性凝血因子易于在局部堆积和活化，启动凝血过程血液接触异物能使凝血系统和血小板激活造模方法：Rabbitsanesthetizedwithintramuscularinjectionsof5mg/kgxylazine(甲苯噻嗪)and 30 mg/kg ketamine hydrochloride,maintaineddilutedketamine(2mg/ml,IV)atarateof1.53mg/kg/hrMechanicalventilationviaatracheotomyBodytemperaturemonitoredwitharectalprobeand maintained at 37C using a water-jacketedheatingblanket.Extracorporealcirculation(ECC,4hrs)bycannulating the left carotid artery for ECCinflow and left femoral vein（or rightexternaljugularvein）forECCoutflow通过肌内注射5mg/kg赛拉嗪（甲苯噻嗪）和30mg/kg氯胺酮盐酸盐麻醉的兔子以1.53mg/kg/hr的速率维持稀释的氯胺酮（2mg/ml，IV）通过机械通气行气管切开术用直肠探针监测体温，并使用水套加热毯维持在37。体外循环（ECC，4小时），通过插管用于ECC流入的左颈动脉和用于ECC流出的左股静脉（或右外颈静脉）15cm，1/4inchpolyurethanecatheter15cm，1/4inch亚安酯catheter8cm，3/8inch聚亚安酯catheter颈总动脉股静脉造模方法聚氨酯导管PlateletaggregationusingaChrono-Logopticalaggregometer.ObtainPRPandPPPbycentrifugation,100%lighttransmissionsetbyPPPand0%byPRP模型评估和应用Flowcytometrydetection:PlateletactivationP-selectin(CD62P)expression,ActivatedGPIIb/IIIa(fibrinogenreceptor)LeukocyteactivationMonocyteMAC-1(CD11b/CD18)andCD14expressionNutrophilMAC-1andCD14expressionPlatelet-leukocyteadhesionPlateletmarker(CD61,CD42)andleukocytemarker(CD11b),doublestained流式细胞术检测：血小板活化P-选择素（CD62P）表达，活化GPIIb/IIIa（纤维蛋白原受体）白细胞活化单核细胞MAC-1（CD11b/CD18）和CD14表达NutrophilMAC-1和CD14表达血小板-白细胞粘附血小板标志物（CD61，CD42）和白细胞标志物（CD11b），双染模型评估和应用Thrombusquantitation:Circuitsremovedafter4hrsonECCRinsedwithnormalsalineResidualthrombusinthelargertubingofECCphotographedImagequantitatedusingImageJimagingsoftware血栓定量：在ECC上4小时后，移除电路用生理盐水冲洗拍摄在ECC的较大管中的残余血栓使用ImageJ成像软件进行图像定量模型评估和应用Biomaterials.2010Apr;31(10):2736.模型评估和应用造模原理：血小板接触粗糙面发生粘附激活血小板因粘附而激活，因激活而聚集，形成白色血栓2.大鼠血栓形成模型大鼠血栓形成模型造模方法：麻醉后行气管插管分离一侧颈总动脉和另侧颈外静脉（股静脉）颈总动脉和股静脉之间接三段相连的聚乙烯管,管中充满肝素生理盐水,中段内放一段丝线经一定时间后取出沿丝线形成的血栓中段丝线颈总动脉股静脉造模方法模型评估和应用：剥离沿丝线形成的血栓，直接称量血栓,湿重和干重方法简便可靠，应用于检测处理因素（如药物）对血小板粘附和聚集功能的影响3.冠状动脉血栓形成模型冠状动脉血栓形成模型造模原理:直流电（1.5mA）刺激颈动脉壁可使血管损伤,血管内膜变得粗糙不平,引起血小板黏附、聚集和释放反应,促进凝血活性；同时，受损内膜暴露胶原纤维激活内源性凝血系统,还可通过释放组织因子激活外源性凝血系统,导致动脉管腔内逐渐形成肉眼可见的混合血栓。造模方法犬经麻醉、人工呼吸、开胸剪开心包膜,左房插管备注射药物用。分离冠状动脉左旋支,用1.5mA直流电刺激左旋支6小时以破坏血管壁,促进血栓形成。同时记录冠脉血流量、动脉血压、心外膜电图。6小时后处死动物并从左心房插管注射20%活性蓝(1ml/5kg)以测定左室心肌梗塞的大小。观察血栓形成的百分率，并称量血栓重量模型评估和应用该模型所形成的血栓组成和形态近似人冠状动脉，适用于冠状动脉急性血栓形成的机制、防治研究。4.家兔耳缘静脉血栓形成模型家兔耳缘静脉血栓形成模型血流速度变慢，促进血液凝固凝血酶使纤维蛋白原转变成纤维蛋白单体凝血酶使XIII激活，后者使纤维蛋白单体转变成纤维蛋白多聚体，导致血液凝固凝血酶激活蛋白C导致tPA释放，后者使纤溶酶原激活凝血酶同时能直接激活纤溶酶，使纤维蛋白多聚体降解导致血栓溶解造模原理:家兔耳缘静脉分离出2cm长的静脉段,用丝线同时结扎远心端和近心端,并用血管夹夹住两侧分枝以阻止血流流入用针头抽去该段血液,注入凝血酶(20NIH凝血酶单位/毫升)松开血管夹使血液流入,再夹住分枝使静脉段内形成血块撤去血管夹,放开结扎线,用透射光观察血栓消失及血流恢复时间造模方法：模型评估和应用本模型形成的血栓为红色血栓方法简便主要用于溶栓药物溶栓作用的观察。二二.DIC的动物模型的动物模型 弥散性血管内凝血(DIC)是一种由不同原因引起的以全身性血管内凝血系统激活为特征的获得性综合征，表现为先发生广泛性微血栓形成，继而因大量凝血因子和血小板被消耗（有时伴有纤溶亢进），导致多部位出血、休克、器官功能障碍及微血管病性溶血性贫血。DIC高凝期高凝期:血小板的激活血小板的激活1)血小板激活物：凝血酶血小板激活物：凝血酶,ADP,TXA2,PAF,胶胶原原,FN,vWF等等,2)血小板的作用：血小板的作用：*为凝血因子提供表面反应场所为凝血因子提供表面反应场所*变形、粘附、聚集、收缩变形、粘附、聚集、收缩*释放释放ADP,5-HT,PAF,TXA2DICDIC的发病机制示意图的发病机制示意图DIC的发生发展机制的发生发展机制发生机制发生机制主要表现主要表现实验室检查实验室检查高凝期高凝期凝血系统与凝血系统与Pt激活激活IIa微血栓形成微血栓形成血液处于高凝状态血液处于高凝状态凝血时间缩短凝血时间缩短粘附性粘附性消耗性低消耗性低凝期凝期凝血因子和血凝血因子和血小板因消耗而小板因消耗而减少减少血液处于低凝状态血液处于低凝状态有出血表现有出血表现血小板计数血小板计数凝血酶原时间凝血酶原时间纤维蛋白原含量纤维蛋白原含量出血时间出血时间凝血时间凝血时间继发性纤继发性纤溶亢进期溶亢进期产生大量纤溶产生大量纤溶酶；纤维蛋酶；纤维蛋（原）降解产（原）降解产物形成物形成明显出血明显出血FDP凝血酶时间凝血酶时间3P试验（试验（+）血小板血小板纤溶系统激活纤溶系统激活 高凝状态高凝状态 微血栓微血栓 低凝状态低凝状态DIC的发生发展机制的发生发展机制多发性出血多发性出血实验对象：成年家兔，雌雄随机1.家兔DIC模型的复制造模原理造模原理正常体内循环血液中不含组织因子，当组织正常体内循环血液中不含组织因子，当组织损伤或内皮细胞和白细胞激活时，组织因子损伤或内皮细胞和白细胞激活时，组织因子能释放或暴露于循环血液启动外源性凝血过能释放或暴露于循环血液启动外源性凝血过程。兔脑粉含有组织因子，静脉注射兔脑粉程。兔脑粉含有组织因子，静脉注射兔脑粉后通过激活外源性凝血途径引起后通过激活外源性凝血途径引起DIC.兔脑粉浸液的制备：健康成年家兔安乐处死后,即刻开颅摘取兔脑，除去血管、脑膜和其它结缔组织，用PBS洗净后，置于研钵中伴丙酮研磨成粥状悬液，静置数分钟后弃上清液，再加入丙酮研磨重复前述步骤多次，直至脑组织完全脱水成白色粉末，置4oC保存待用。造模方法：称重后，用20%乌拉坦4ml/kg耳缘静脉注射麻醉 动物用生理盐水配制4兔脑粉溶液，按2mlkg体重计算兔脑粉溶液，加生理盐水稀释至20m1后，由耳缘静脉缓慢注入（10min）。分别于注入兔脑粉溶液前15min、注入后15min和45min，记录家兔的血压和呼吸，并取血置于有肝素的注射器中，以测定3P试验、PT、纤维蛋白原、血小板计数。造模方法复制DIC模型：凝血酶原时间(PT)测定P试液配制：取兔脑粉0.2g，加入5ml NS充分混匀，置C37oC恒温水浴箱内孵育1hr，孵育期间用 玻 璃 棒 搅 拌 3至 4次，孵 育 后 混 匀、离 心(1000rpm x 5min）,取上清液与等量氯化钙（0.025molL）溶液混匀。取被检血浆0.1ml，置于小试管内放于37水浴中。取待测血浆0.1ml加入P试液0.2ml，轻轻地侧动，直至液体停止流动或出现粗颗粒，即为凝血酶原时间.重复3次，取平均值,家兔正常值为68sec。造模方法检查急性DIC的几种血液学常规方法：血小板计数吸取20l全血加入到0.38ml血小板稀释液中混匀，用滴管将上述混悬液一小滴滴入血球计数板内，静置15min后，用高倍镜计数。数5个方格内之血小板数，乘以1000，即得每立方毫米血小板数。造模方法鱼精蛋白副凝实验(3P实验)取全血置于EP管中，离心（5000rpmx3min）后，取上清液即血浆。取血浆0.4ml置于试管中，加入0.1ml1%硫酸鱼精蛋白液混匀。室温下静置30min后摇动试管，出现白色纤维或凝块者为阳性，均匀浑浊而没有出现白色纤维者为阴性。造模方法鱼精蛋白鱼精蛋白游离单体游离单体(FM)多聚体凝块多聚体凝块(Fbn)FbgFMFbna aXaFDPPLnPLnFMX(可溶性复合物可溶性复合物)(A,B,CX,Y)3P试试验验:血血浆浆鱼鱼精精蛋蛋白白副副凝凝试试验验（plasma protaminparacoagulationtest）血清纤维蛋白(原)含量测定(饱和盐水法)取血浆0.5m1置于12X100mm的试管中，加入饱和氯化钠溶液4.5m1，充分混匀，置于37水浴中孵育3min，取血后再次混匀，用721型分光光度计比色，测定光密度.以生理盐水代替饱和氯化钠溶液，进行同样操作作为对照。对照管调零点，测出光密度(波长520mm)后，按下式计算纤维蛋白原含量：测定管光密度 1000=mg%0.5造模方法动 物 死 后观 察 各 脏器 的 变 化造模方法尸检三三.贫血的动物模型贫血的动物模型贫血是指人体外周血红细胞容量减少，低于正常范围下限的一种常见的临床症状。1、缺铁性贫血动物模型造模原理：缺铁性贫血（irondeficiencyanemia，IDA）是指各种原因引起的缺铁导致红细胞生成减少而导致的贫血。通过低铁饲料喂养动物使铁摄入减少，外加多次少量放血使铁丢失，造成体内铁的缺乏。造模方法实验动物：选用4周龄SD大鼠，雌雄不拘，体重65g左右，HGB130g/L。建模方法：采用EDTA浸泡处理以去除饲料中的铁（低铁饲料）后喂养动物。采用去离子水作为动物饮水，以排除饮水中铁离子的影响。在低铁饲料饲喂2周后进行，常用尾静脉放血法，11.5ml/次，2次/周。饲料中的含铁量是诱导IDA模型的关键：（1）饲喂含铁量15.63mg/Kg的饲料35天，SD大鼠出现典型IDA表现；（2）饲喂含铁40.30mg/Kg的饲料SD大鼠出现缺铁，但并不表现贫血症状。模型指标：（1）HGB100g/L；（2）血象：红细胞体积较正常红细胞偏小，大小不一，中心淡染区扩大，MCV减小、MCHC降低；（3）血清铁降低，60mol/L。用于缺铁性贫血药物作用和缺铁性贫血机制的研究，但不适用于铁吸收不良相关的防治研究。模型评估和应用2、溶血性贫血动物模型溶血性贫血(hemolyticanemia,)是一种常见的贫血类型，是指由于某种原因使红细胞存活期缩短(15-20天），破坏增加，超过了骨髓代偿能力（6-8倍）所引起的一类贫血，是常见的造血系统疾病。造模原理：动物注射一定量的乙酰苯肼(acetylphenylhydrazine,APH)，APH是一种强氧化剂，能特异性地对红细胞起缓慢而进行性地氧化损伤作用，尤其是干扰红细胞内的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，促进血红蛋白变性而形成海氏小体，也可直接破坏红细胞的膜蛋白和脂类，使膜溶解破裂，红细胞崩解，造成溶血性贫血。造模方法：小鼠第1、4、7天皮下注射APH生理盐水溶液0.2g/kg、0.1g/kg、0.2g/kg，第9天造模成功，其他给药方法也可以造成此模型。大鼠第1、4天皮下注射APH生理盐水溶液0.16g/kg、0.08g/kg，第8天造模成功；或两次剂量均为0.2g/kg，第10天造模成功。家兔以2APH生理盐水溶液给实验动物皮下或肌内注射23次，剂量为0.1g/kg，即可建立溶血性贫血模型。外周血血红蛋白和红细胞进行性下降；网织红细胞、海氏小体和白细胞总数则显著增多。本方法建模周期短，操作简便，模型动物症状和外周血象、血细胞的生化学变化与人类溶血性贫血基本相似，为研究实验性溶血性贫血提供了一种简易模型。模型评估和应用3.失血性贫血动物模型造模原理：急性失血后贫血(posthemorrhagicanemia)是快速大量出血引起的贫血；慢性失血后贫血是由于长期中度出血所致的小细胞性贫血。通过人为放血导致动物血容量和血细胞的减少，从而导致动物出现短期的贫血特征，以此制作失血性贫血模型。造模方法：小鼠:眼眶后静脉丛放血68滴(约0.5ml)，隔日放血1次，连续5次可形成慢性失血性贫血模型。每天剪尾放血0.5ml，连续7天，也可造成贫血。大鼠:大鼠剪尾放血1.52ml，隔日1次，连续5次，可形成慢性失血性贫血。家兔或犬:从动物静脉或者动脉采集全血容量的1/3，每天1次，反复几次，即可造成失血性贫血动物模型。模型评估和应用：通过较短时间内向体外大量放血，造成急性失血性贫血。也可通过反复多次放血，造成慢性失血性贫血。该方法操作简单，指标明确，但样本间失血量较难控制完全一致。该模型用于一般失血性贫血的发病机制及其新药药效学筛选研究。4、再生障碍性贫血动物模型再生障碍性贫血（aplasticanemia），简称再障，系多种病因引起的造血系统退行性变，红骨髓总容量不断减少，黄骨髓不断增加，造血衰竭，以全血细胞减少为主要表现的一组综合征。建模方法包括化学建模、物理建模及免疫介导等。再障的发病机制尚未完全阐明。化学方法建模：造模原理：化学药物的毒副作用抑制骨髓造血功能，诱导再生障碍性贫血。腺嘌呤可导致肾脏病变，使促红细胞生成素（EPO）分泌不足，进而导致红系和巨核系造血障碍。白消安可选择性抑制骨髓。苯类化学物质进入动物体内后，在骨髓富集（可达血清浓度的20倍），对骨髓有较强的抑制作用，可导致再障。腺嘌呤致大鼠肾性贫血模型：实验动物：SD大鼠，雌雄不拘。利用饲喂含腺嘌呤0.75%，投饲量300mg/kg/d，连续喂养6-7周，获得肾衰竭贫血模型实验动物红细胞、血红蛋白及红细胞压积等主要红系指标均、血小板均显著下降。白消安致骨髓抑制的再障模型：实验动物：小鼠、SD大鼠、家兔，雌雄不拘。建模方法：白消安（马利兰）（1）口服给药，15mg/kg/周或30mg/kg/周，总给药剂量达到120-150mg/kg时，可致家兔的再障，出现全血细胞减少、淋巴细胞比值增加、骨髓黄化和骨髓纤维化。（2）一次性给药，20-35mg/kg腹腔注射，可致大鼠再障。（3）小鼠每天腹腔注射15mg/kg，持续8-9天，停药60天后，可使骨髓造血功能抑制。出现血细胞减少和骨髓有核细胞降低，建模稳定、实验动物存活率高。苯致骨髓抑制的再障模型：实验动物：CD1小鼠、家兔。建模方法：苯类化学物质进入动物体内后，在骨髓富集（可达血清浓度的20倍），对骨髓有较强的抑制作用，可导致再障。（1）皮下注射给药，苯与玉米油1:1混合物，4.0ml/kg，3次/周，共给药25次，可致CD1小鼠再障，表现为全血细胞减少、骨髓黄化、脂肪细胞等非造血细胞数目增多，骨髓间质血窦充血、出血伴水肿。（2）皮下注射给药，纯苯，0.5-1.0ml/kg/天，3次/周，连续给药2-3周，可致全血细胞减少、造血细胞减少。化学毒物诱导再障动物模型与人类再生障碍性贫血有相似之处，该模型成功率高，结果稳定，但造模时间过长，易造成骨髓永久损害。可作再生障碍性贫血的发病机制研究、疾病进展研究和治疗药物筛选的动物模型。模型评估和应用物理方法建模造模原理：放射物质产生的高能射线可穿透机体，起DNA损伤，干扰DNA复制，阻断有丝分裂，对造血干细胞等分裂增值活跃的细胞有强抑制作用，可使动物造血干细胞和袓细胞减少，破坏骨髓造血细胞的增殖能力。造模方法-外部照射建模法：实验动物：小鼠，雌雄不拘。建模方法：射线等高能射线可穿透机体，起DNA损伤，丝分裂，对造血干细胞等分裂增值活跃的细胞有强抑制作用。使用钴60等放射性同位素，照射剂量3-4Gy（戈瑞），可使造血干细胞数量减少；亚致死剂量（6.0Gy）照射以后，可致小鼠全血再障，维持时间较长，但辐照的剂量不好控制，稍大易致小鼠死亡，稍低则个别小鼠不易达到造血抑制效果。造模方法-内部照射建模法：实验动物：小鼠，雌雄不拘。建模方法：放射性同位素153Sm（钐）、89Sr（锶）、32P（32磷）、186Re(186铼)、188Re(188铼)、105Rh（105铑）、177LU（177镥）和60Co（60钴），能产生射线及亲骨性特点，进入人体后对造血组织进行内照射。将32磷给小鼠一次静脉注射1.4mCi/kg体重可致再障；氯化锶，按每克体重6或2Ci（居里）腹腔注射给予1112周龄的小鼠，6Ci组动物于35d后全部死亡2Ci组动物全部存活。6Ci组的小鼠于21d后股骨骨髓显示为脂肪髓。全血细胞减少，骨髓有核细胞数和CFU-S产率都减少。本模型与人类再生障碍性贫血相似，该模型成功率高，结果稳定，但需要特殊设备及防护，亦为防护照射损伤的研究提供了良好实验方法。模型评估和应用