聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶课件

聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶每每2组取组取3支消化管，按下表操作支消化管，按下表操作 编号编号 1（空白）（空白）2（样品）（样品）3（标准）（标准）试剂处理试剂处理 样品液样品液 1 标准磷原液标准磷原液 1 去离子水去离子水 1 524 2 2 2 加小漏斗，加小漏斗，300加热沸腾加热沸腾10分钟，分钟，250左右继续左右继续 消化消化34小时至溶液透明，冷却，待用。小时至溶液透明，冷却，待用。样品的消化（为下周实验做准备）样品的消化（为下周实验做准备）电泳装置 采用北京六一仪器厂的型垂直板电泳装置：制胶装置 制备凝胶板 电泳装置 进行凝胶电泳 每组（2人）做一块胶，两组共用一套电泳装置，两套电泳槽共用一台电泳仪。三、【操作步骤】三、【操作步骤】三、【操作步骤】三、【操作步骤】凝凝胶胶模模由由两两块块玻玻璃璃板板（一一块块长长板板，一一块块短短板板）和和一一个个密密封封框框组组成成，将将它它们们按按下下图图组组装装，四周对齐，注意手指勿接触两块玻璃板内侧的灌胶面，注意间隔条的安装。四周对齐，注意手指勿接触两块玻璃板内侧的灌胶面，注意间隔条的安装。注意：玻璃板（用海绵及洗洁精清洗）和梳子及密封框一定要清洗干净。注意：玻璃板（用海绵及洗洁精清洗）和梳子及密封框一定要清洗干净。1、安装制胶装置、安装制胶装置不能偷懒不能偷懒短板（凹形玻璃板）短板（凹形玻璃板）长板（带间隔条玻板）长板（带间隔条玻板）密封条（封胶条）密封条（封胶条）样品槽模板（梳子）样品槽模板（梳子）垂直板电泳装置制胶装置组件垂直板电泳装置制胶装置组件安装膜具装封胶条，注意封胶条平面朝下，不能有裂口盖上凹玻璃将凹玻璃冲外装进槽里将楔子插进，将底部插紧 2、配制凝胶液、配制凝胶液三组按照表中的比例和顺序在小烧杯中配制凝胶溶液，加入后，立即混匀。三组按照表中的比例和顺序在小烧杯中配制凝胶溶液，加入后，立即混匀。制备连续聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配方（三组）制备连续聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配方（三组）凝胶溶液组成凝胶溶液组成体积体积A液液 缓冲液（含）缓冲液（含）2.5 B液液 30%凝胶贮液凝胶贮液5 去离子水去离子水12.2 10（最后加）（最后加）300L 3、灌胶液 沿玻璃板尽快加入两块玻璃板之间的缝隙中，注意不要有气泡，当凝胶液面距短板上缘沿玻璃板尽快加入两块玻璃板之间的缝隙中，注意不要有气泡，当凝胶液面距短板上缘0.3 时，立即轻轻将样品槽模板插入凝胶溶液中，注意样品槽中不要有气泡，凝胶溶液应充时，立即轻轻将样品槽模板插入凝胶溶液中，注意样品槽中不要有气泡，凝胶溶液应充满样品槽间隙。制胶装置室温垂直放置，满样品槽间隙。制胶装置室温垂直放置，3060 聚合反应完成。聚合反应完成。注意：胶头滴管中的剩余胶液一定要挤出去注意：胶头滴管中的剩余胶液一定要挤出去插入梳子 4、安装电泳槽 胶聚合后，拔起锲形固定板，取出夹有凝胶的玻板，取下凹形密封条，将凹形玻板侧朝内放入胶聚合后，拔起锲形固定板，取出夹有凝胶的玻板，取下凹形密封条，将凹形玻板侧朝内放入电泳槽架，重新用锲形板固定，密封不漏液。每槽取稀释电泳槽架，重新用锲形板固定，密封不漏液。每槽取稀释10倍的电极缓冲液倍的电极缓冲液350，小心加入负极，小心加入负极槽槽(内槽内槽)约约150，使其浸没过凹形玻板进入样品槽。双手轻轻、垂直、均匀用力拔出样品槽梳子。，使其浸没过凹形玻板进入样品槽。双手轻轻、垂直、均匀用力拔出样品槽梳子。注意：不能漏水注意：不能漏水胶凝后用夹子将玻璃夹出用夹子夹紧玻璃将封胶条轻轻撕掉旋转180度，凹玻璃向里将玻璃放进槽内加缓冲液 小心将微量注射器伸入样品槽底部上方，不要扎到凝胶，分别在每个加样槽内按下列顺序和体积慢慢推入蓝色样品液(含蔗糖和少量溴酚蓝)，使其沉降到底部形成集中窄的蓝带。每位同学加四种，两边的槽不加。心肌 脑 骨骼肌 肝 心肌 脑 骨骼肌 肝 5L 10L 5L 3L 5L 10L 5L 3L 5、加样 将电泳槽架放入电泳槽内，倒入其余的电极缓冲液至正极槽(外槽)，按正负极位置放上电泳槽盖，盖紧，并按正负极连接上电泳仪。用稳压挡将电压调至80V，待样品蓝带全部进胶后，调高电压至150V，继续电泳，当指示剂溴酚蓝的蓝带泳动至胶底部并出胶后半小时到40分钟，关闭电源，停止电泳，前后共约2.5-3小时。6、电泳、电泳电泳进行中电泳进行中1.学习聚丙烯酰胺凝胶电泳学习聚丙烯酰胺凝胶电泳()原理和有关同工酶的知识。原理和有关同工酶的知识。2.掌握连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色的操作技术。掌握连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色的操作技术。一、【实验目的】一、【实验目的】一、【实验目的】一、【实验目的】（一）（一）.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 1.电泳定义和蛋白质电泳基本原理电泳定义和蛋白质电泳基本原理 带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。许多生物分子都可带电荷，如蛋白质、核酸等，这些带电胶体颗粒在电场中均可移动。以许多生物分子都可带电荷，如蛋白质、核酸等，这些带电胶体颗粒在电场中均可移动。以蛋白质为例，根据已学生化知识，蛋白质在小于或大于其等电点的时，可带不同的净电荷，蛋白质为例，根据已学生化知识，蛋白质在小于或大于其等电点的时，可带不同的净电荷，所以也有电泳现象。不同蛋白质质点带电性质、带电量多少、质点大小、形状都不同，决定所以也有电泳现象。不同蛋白质质点带电性质、带电量多少、质点大小、形状都不同，决定了各自在电场中移动速率和距离不相同，因而互相之间得以分离。了各自在电场中移动速率和距离不相同，因而互相之间得以分离。二、【实验原理】二、【实验原理】二、【实验原理】二、【实验原理】蛋白质分子蛋白质分子33蛋白质分子蛋白质分子蛋白质分子蛋白质分子2333 移向负极移向负极移向正极移向正极（总电荷：）（总电荷：）（总电荷：）（总电荷：）（总电荷：（总电荷：0）不同条件下蛋白质分子在电场中运动状态示意图不同条件下蛋白质分子在电场中运动状态示意图 2.区带电泳区带电泳 在一些惰性支持介质上进行电泳，电泳后不同组分由于带电多少不同，移动距离不同，在在一些惰性支持介质上进行电泳，电泳后不同组分由于带电多少不同，移动距离不同，在支持物上形成带状区间。支持物上形成带状区间。常见的惰性支持物有：常见的惰性支持物有：滤纸滤纸 称纸电泳称纸电泳 醋酸纤维素薄膜醋酸纤维素薄膜 薄膜电泳薄膜电泳 淀粉、琼脂淀粉、琼脂(糖糖)、聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 凝胶电泳凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的区带电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的区带电泳。3.聚丙烯酰胺凝胶的形成与结构聚丙烯酰胺凝胶的形成与结构*主要成分主要成分 单体：丙烯酰胺单体：丙烯酰胺()交联剂：交联剂：-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺()聚合反应聚合反应 催化体系：催化体系：过硫酸铵过硫酸铵()催化剂催化剂四甲基乙二胺四甲基乙二胺()加速剂加速剂*结构结构 三维网状结构的凝胶三维网状结构的凝胶 聚合反应过程催化体系 催化生成硫酸自由基：催化生成硫酸自由基：硫酸自由基的氧原子激活单体并形成单体长链：硫酸自由基的氧原子激活单体并形成单体长链：将单体长链间连成网状结构：将单体长链间连成网状结构：CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺N,N-N,N-甲叉甲叉甲叉甲叉双丙烯酰胺双丙烯酰胺双丙烯酰胺双丙烯酰胺 CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CH C=O NH CH2 NH C=O CH2-CHCH2 CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH()n()n()m()m 化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶，重复性好。聚合反应受各种因素的影响：催化剂和加速剂的浓度 应选择合适的和浓度使聚合时间控制在3060内较好，过量的催化剂和加速剂会引起烧胶和蛋白质条带的畸变。只能以游离碱的形式发挥作用，在酸性条件下，叔胺缺少自由碱基，引发产生自由基的过程会被延迟，聚合时间延长。温度温度 聚合速度与温度有关，一般是高温聚合快，而聚合的速度影响交联孔径的大小，所聚合速度与温度有关，一般是高温聚合快，而聚合的速度影响交联孔径的大小，所以凝胶聚合时必须保持温度恒定，通常用与电泳相同的温度。以凝胶聚合时必须保持温度恒定，通常用与电泳相同的温度。分子氧分子氧 分子氧的存在会阻止碳链的延长，妨碍聚合作用，在聚合过程中要尽量避免接触分子氧的存在会阻止碳链的延长，妨碍聚合作用，在聚合过程中要尽量避免接触空气。空气。杂质杂质 某些金属离子或其它杂质也会影响凝胶的化学聚合，所以应选择高纯度的、和。某些金属离子或其它杂质也会影响凝胶的化学聚合，所以应选择高纯度的、和。4 4、凝胶总浓度及交联度对凝胶的影响、凝胶总浓度及交联度对凝胶的影响 凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚丙烯酰胺凝胶特性包括其机凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚丙烯酰胺凝胶特性包括其机械性能、弹性、透明度、粘着度及孔径大小的主要因素。械性能、弹性、透明度、粘着度及孔径大小的主要因素。T为凝胶溶液中单体和交联剂的为凝胶溶液中单体和交联剂的总质量浓度，总质量浓度，C为凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总量的质量分数。为凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总量的质量分数。式中，式中，a为丙烯酰胺单体的质量为丙烯酰胺单体的质量(g)，b为交联剂的质量为交联剂的质量(g)，m为溶液的终体积为溶液的终体积()。凝胶凝胶a、b的比例决定了凝胶的物理性状。当小于的比例决定了凝胶的物理性状。当小于10时，凝胶脆且硬，不透明，呈乳白色；时，凝胶脆且硬，不透明，呈乳白色；当大于当大于100时，即使用时，即使用5%的丙烯酰胺凝胶也呈糊状；通常用在的丙烯酰胺凝胶也呈糊状；通常用在30左右，并且丙烯酰胺浓度左右，并且丙烯酰胺浓度高于高于3%，凝胶富有弹性并且透明。，凝胶富有弹性并且透明。凝胶的总质量浓度T和交联度C决定凝胶的有效孔径。凝胶的三维网状结构具有分子筛效应，不同大小和形状的大分子通过孔径时所受的阻滞力不同，加上大分子的电荷效应，使各种大分子迁移率不同得以分离。在实际工作中，常依据待分离蛋白质已知相对分子质量的大小来选择所合适的凝胶浓度，使蛋白质混合物得到最大限度的分离，大多数蛋白质在7.5%凝胶中能得到满意的结果，所以这个浓度的凝胶称为标准胶。当分析一个未知样品时，常用标准胶或梯度凝胶来测试，而后确定适宜的凝胶浓度。5、蛋白质、核酸在常规聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离原理、蛋白质、核酸在常规聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离原理 净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳是对天然状态生物大分子进行的电泳，目的是为了保持蛋白质的天然构象、其亚基之间的相互作用及其生物学活性。利用蛋白质分子中所带净电荷、分子质量、形状的差异，在电场中泳动的速度和方向不同，从而达到分离的目的。多数蛋白质的在中性偏酸性范围，通常是将样品在碱性缓冲系统中进行电泳，蛋白质分子带负电荷，以不同速度向阳极迁移，称为阳极电泳；对于一些碱性蛋白，使用酸性缓冲系统进行电泳，蛋白质分子带正电荷而向阴极迁移，称为阴极电泳。蛋白质在常规聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素蛋白质在常规聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素 电荷因素 蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同分子大小 蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不同分子形状 蛋白质分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同电荷因素分子大小分子形状 6.聚丙烯酰胺凝胶电泳类型聚丙烯酰胺凝胶电泳类型 （1）按电泳槽形式不同分）按电泳槽形式不同分 管状管状 垂直板型垂直板型(蛋白质、核酸分离蛋白质、核酸分离)水平板型水平板型(核酸分离核酸分离)几种常见的电泳槽几种常见的电泳槽(2)按制胶方式不同分按制胶方式不同分 连续系统连续系统 只有一层只有一层 分离胶，分离胶，浓度均一。浓度均一。不连续系统不连续系统 制二层胶制二层胶 分离胶分离胶 高浓度，浓度高浓度，浓度均一。浓缩胶均一。浓缩胶 低浓度低浓度 (3)按分离原理不同分：*常规也称天然状态生物分子，即在电泳过程中，生物分子如蛋白质仍保持天然构象、亚基之间的相互作用及生物学活性。是根据被分离组分的电荷、大小和形状三种因数综合效果进行分离。用于蛋白质、核酸一般分离分析。*根据被分离物的分子量大小差异进行分离，多用于测定蛋白质分子量。*根据被分离物的等电点差异进行分离，亦称等电聚焦电泳，如等电点不同的蛋白质，根据被分离物的等电点差异进行分离，亦称等电聚焦电泳，如等电点不同的蛋白质，在一个值连续变化的中电泳后，分别聚集在其等电点的处形成区带，因而得以分离。多在一个值连续变化的中电泳后，分别聚集在其等电点的处形成区带，因而得以分离。多用于测定蛋白质等电点。用于测定蛋白质等电点。*浓度梯度浓度梯度 分离胶为浓度梯度胶，即胶浓度呈均匀增加，根据分子大小进行分离。多分离胶为浓度梯度胶，即胶浓度呈均匀增加，根据分子大小进行分离。多用于测定蛋白质分子量。用于测定蛋白质分子量。（二）.分离乳酸脱氢酶()同工酶原理1、同工酶概念、同工酶概念 催化相同化学反应，但其酶蛋白的结构、组成略有不同，表现出理化性质和动力学催化相同化学反应，但其酶蛋白的结构、组成略有不同，表现出理化性质和动力学性质不同的一组酶。性质不同的一组酶。2、同工酶催化的反应、同工酶催化的反应 1959年等用电泳的方法将纯化的心肌乳酸脱氢酶()分离出5条区带，由阳极到阴极依次命名为1、2、3、4、5，它们均具有催化活性，从而首先提出了同工酶的概念。目前已知同工酶是由H和M亚基按不同比例组成的四聚体。同工酶广泛存在于动植物及微生物中，动物各组织中同工酶各组分含量不同。临床上对及同工酶的检测可作为某些疾病诊断的依据之一。同工酶亚基的聚合同工酶亚基的聚合3 3、乳酸脱氢酶同工酶活性染色原理、乳酸脱氢酶同工酶活性染色原理 (1)电泳染色方法电泳染色方法 不同物质染色方法不同，如核酸与蛋白质不同，不同蛋白质之间也不同如糖蛋白与脂不同物质染色方法不同，如核酸与蛋白质不同，不同蛋白质之间也不同如糖蛋白与脂蛋白，蛋白质染色方法很多：蛋白，蛋白质染色方法很多：*一般染色方法一般染色方法 是利用某些染料如氨基黑、考马斯亮蓝、或银液与蛋白质结合形成黑色或蓝色条带，是利用某些染料如氨基黑、考马斯亮蓝、或银液与蛋白质结合形成黑色或蓝色条带，显示出蛋白质区带位置，其专一性不强，凡系蛋白质均可呈色。显示出蛋白质区带位置，其专一性不强，凡系蛋白质均可呈色。*特殊染色法特殊染色法 如针对糖蛋白或脂蛋白的染色法，针对不同酶的活性染色法。如针对糖蛋白或脂蛋白的染色法，针对不同酶的活性染色法。(2)酶活性染色法酶活性染色法 利用该酶催化特定化学反应后，产利用该酶催化特定化学反应后，产 物直接与特定的染料反应，生成颜色而显色，或再发生其它反应，最终生成有色物显色。酶活物直接与特定的染料反应，生成颜色而显色，或再发生其它反应，最终生成有色物显色。酶活染色法利用该酶活性显色，所以专一性强，一种方法只适用于一种酶蛋白，使其显色而其它染色法利用该酶活性显色，所以专一性强，一种方法只适用于一种酶蛋白，使其显色而其它蛋白并不被显色。蛋白并不被显色。(3)同工酶活性染色法原理同工酶活性染色法原理 用活性染色对进行鉴定，将凝胶浸泡在活性染色液中，与底物的反应，用甲硫吩嗪用活性染色对进行鉴定，将凝胶浸泡在活性染色液中，与底物的反应，用甲硫吩嗪()作为电作为电子的中间载体，氯化硝基四氮唑蓝子的中间载体，氯化硝基四氮唑蓝()作为最终电子受体，底物脱下的氢最后传递给，被还原后，作为最终电子受体，底物脱下的氢最后传递给，被还原后，产生蓝紫色的不溶于水的物质以对定位。反应式如下：产生蓝紫色的不溶于水的物质以对定位。反应式如下：4、同工酶谱分析的临床应用、同工酶谱分析的临床应用 同工酶有组织特异性，在心、肾和红细胞中相对含量高，在肝、肌肉及某些癌组织中相对同工酶有组织特异性，在心、肾和红细胞中相对含量高，在肝、肌肉及某些癌组织中相对含量较高，因此，同工酶相对含量的改变在一定程度上反应了某些脏器的功能状况。临床医含量较高，因此，同工酶相对含量的改变在一定程度上反应了某些脏器的功能状况。临床医学常利用这些同工酶有血清中相对含量的改变作为某脏器病变鉴别诊断的参考。学常利用这些同工酶有血清中相对含量的改变作为某脏器病变鉴别诊断的参考。临床医学参考数据（1）急性心肌梗塞发作后，早期血清中1和2活性均升高，但1增高更早，更明显，导致12的比值升高。（2）肝炎、急性肝细胞损伤及骨骼肌损伤时5都会升高。（3）患活动性风湿性心脏病、急性病毒性心肌炎、溶血性贫血、肾坏死等病1也可升高。（4）恶性病变时3常增高。7、活性染色，脱色：、活性染色，脱色：电电泳泳结结束束后后，将将凝凝胶胶板板取取下下，用用薄薄尺尺子子轻轻轻轻将将玻玻璃璃板板撬撬开开，在在凝凝胶胶下下部部切切角角标标注注凝凝胶胶方方位位，然然后后将将带带有有凝凝胶胶的的板板反反扣扣过过来来，胶胶面面朝朝下下，用用尺尺子子小小心心地地将将凝凝胶胶的的一一角角剥剥离离，使使凝凝胶胶掉掉入入装装有有活活性性染染色色液液的的培培养养皿皿中中。轻轻轻轻摇摇动动培培养养皿皿，使使凝凝胶胶完完全全浸浸泡泡在在染染色色液液中中，染染色色过过程程注注意意避避光光，待待大大多多数数条条带带显显现现蓝蓝紫紫色色时时除除去去染染色色液液，显显色色时时间间一一般般为为1530。加加入入脱脱色色液液终终止止酶酶促促反应，摇动反应，摇动35，凝胶底色脱去直至背景清亮。，凝胶底色脱去直至背景清亮。三、【操作步骤】三、【操作步骤】三、【操作步骤】三、【操作步骤】剥 胶LDH4LDH3LDH5LDH1LDH2 1 2 3 4电泳结果实例电泳结果实例 分离小鼠同工酶活性染色结果分离小鼠同工酶活性染色结果 1.骨骼肌；骨骼肌；2.心肌；心肌；3.肝脏；肝脏；4.脑脑 往届学生往届学生 分离小鼠同工酶活性染色结果分离小鼠同工酶活性染色结果 1.心肌；心肌；2.骨骼肌；骨骼肌；3.脑；脑；4.肝脏肝脏 1 2 3 48、固定、固定 倒去脱色液，加入倒去脱色液，加入15保存液，浸泡凝胶固定保存液，浸泡凝胶固定15分钟。另取分钟。另取2张玻璃纸也浸泡于保存液中。张玻璃纸也浸泡于保存液中。附：制干胶附：制干胶 用两张玻璃纸将凝胶制成夹心式干胶，待凝胶干透后，取下玻璃板即可得到平整用两张玻璃纸将凝胶制成夹心式干胶，待凝胶干透后，取下玻璃板即可得到平整透明的电泳干胶图谱。透明的电泳干胶图谱。凝胶玻璃板玻璃纸制作干胶示意图制作干胶示意图1.一周后取下一周后取下“夹心式夹心式”干胶板，剪去多余玻璃纸，将干胶片一分为二贴在实验报告上。干胶板，剪去多余玻璃纸，将干胶片一分为二贴在实验报告上。2.对电泳图谱作定性分析对电泳图谱作定性分析 说明各种组织同工酶分离情况，条带多少、相对含量差异等。说明各种组织同工酶分离情况，条带多少、相对含量差异等。四、【结果分析】四、【结果分析】四、【结果分析】四、【结果分析】其他注意事项爱惜电泳装置，轻拿轻放，玻璃板必须用海绵清洗，避免产生划痕，损坏需赔偿。爱惜电泳装置，轻拿轻放，玻璃板必须用海绵清洗，避免产生划痕，损坏需赔偿。染色液价格昂贵，按量发放（两块胶染色液价格昂贵，按量发放（两块胶30mL），随用随取，注意避光，如果没有变绿仍可继），随用随取，注意避光，如果没有变绿仍可继续使用，不影响染色效果。续使用，不影响染色效果。每班请一位同学配制脱色液每班请一位同学配制脱色液1000 mL，每两组使用，每两组使用50 mL。实验完成后，将电泳装置洗净，所用配件放回盘中，老师检查合格后方可离开。实验完成后，将电泳装置洗净，所用配件放回盘中，老师检查合格后方可离开。谢谢！