蛋白质类药物的分离纯-课件

四四.生物药物的制备生物药物的制备3.3.蛋白质类药物的分离纯化方法蛋白质类药物的分离纯化方法1生产过程生产过程上游构建上游构建（基因工程）（基因工程）发酵生产发酵生产(发酵工程发酵工程)纯化制备纯化制备2 来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞；来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞；分离和纯化过程都必须在温和条件下进行。分离和纯化过程都必须在温和条件下进行。蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化3 产物特性产物特性产物特性产物特性 作用作用作用作用等电点等电点等电点等电点 决定离子交换种类及条件决定离子交换种类及条件决定离子交换种类及条件决定离子交换种类及条件相对分子量相对分子量相对分子量相对分子量 选择不同孔径的介质选择不同孔径的介质选择不同孔径的介质选择不同孔径的介质疏水性疏水性疏水性疏水性 与疏水、反相介质结合的程与疏水、反相介质结合的程与疏水、反相介质结合的程与疏水、反相介质结合的程度度度度生物特异性生物特异性生物特异性生物特异性 决定亲和配基决定亲和配基决定亲和配基决定亲和配基溶解性溶解性溶解性溶解性 决定分离体系及蛋白浓度决定分离体系及蛋白浓度决定分离体系及蛋白浓度决定分离体系及蛋白浓度稳定性稳定性稳定性稳定性 决定工艺采用温度及流程时决定工艺采用温度及流程时决定工艺采用温度及流程时决定工艺采用温度及流程时间间间间1 1）蛋白质的基本特性）蛋白质的基本特性4 蛋白质分子中存在蛋白质分子中存在游离氨基游离氨基和和羧基羧基，具有两，具有两性解离性质。性解离性质。当蛋白质溶液处于某当蛋白质溶液处于某pHpH时，蛋白质分子解离时，蛋白质分子解离成正、负离子的趋势相等，净电荷为零，此时溶成正、负离子的趋势相等，净电荷为零，此时溶液液pHpH称为蛋白质的等电点称为蛋白质的等电点pIpI。两性解离与等电点两性解离与等电点5 利用蛋白质两性电离的性质，可通过电利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。白质。6 蛋白质分子量很大，分子粒径为蛋白质分子量很大，分子粒径为1 1100nm100nm，属亲水胶体在水中能形成稳定胶体溶液。蛋白质属亲水胶体在水中能形成稳定胶体溶液。蛋白质分子表面的分子表面的水化膜水化膜和和表面电荷表面电荷是稳定亲水溶胶的是稳定亲水溶胶的两个重要因素。两个重要因素。蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质7 蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀 蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所 带的电荷和水化作用有关。带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质 在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来蛋白质沉淀蛋白质沉淀 蛋白质的肽链相互聚集，从溶液中析出。蛋白质的肽链相互聚集，从溶液中析出。8+蛋白质胶体颗粒的沉淀蛋白质胶体颗粒的沉淀+-+-（沉淀）（沉淀）（疏水胶体）（疏水胶体）（疏水胶体）（疏水胶体）9 沉淀过程中，蛋白质结构和性质都不发生变化，沉淀过程中，蛋白质结构和性质都不发生变化，在适当条件下，可以重新溶解形成溶液。在适当条件下，可以重新溶解形成溶液。是分离、纯化蛋白质的基本方法。如：等电点是分离、纯化蛋白质的基本方法。如：等电点 沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法等。沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法等。去除变性因素后，恢复原有空间构象和生物活去除变性因素后，恢复原有空间构象和生物活性。性。蛋白质的非变性沉淀蛋白质的非变性沉淀10核糖核酸酶可逆变性核糖核酸酶可逆变性11在强烈沉淀条件下，蛋白质胶体溶液的稳定性、在强烈沉淀条件下，蛋白质胶体溶液的稳定性、蛋白质分子结构和性质均被破坏，沉淀不能重新蛋白质分子结构和性质均被破坏，沉淀不能重新溶解于水。溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以是变性沉淀。化，所以是变性沉淀。加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀、生物加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀、生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。碱沉淀等都属于不可逆沉淀。蛋白质的变性沉淀蛋白质的变性沉淀12盐析盐析电泳电泳透析透析层析层析分子筛分子筛超速离心超速离心2 2）蛋白质的分离纯化方法）蛋白质的分离纯化方法13定定 义：义：加入大量中性盐以破坏加入大量中性盐以破坏Pr的稳定因素并的稳定因素并 使从溶液中沉淀析出的现象。使从溶液中沉淀析出的现象。原原 理：理：破坏破坏Pr两个稳定因素：水化膜和电荷层。两个稳定因素：水化膜和电荷层。中性盐：中性盐：(NH4)2SO4；Na2SO4；NaCl等。等。优优 点：点：Pr不变性，常用不变性，常用。盐析（盐析（Salting out)14定义：定义：带电粒子在电场力作用下向着所带电荷相带电粒子在电场力作用下向着所带电荷相 反方向泳动的现象叫电泳。反方向泳动的现象叫电泳。原理：原理：Pr分子在溶液中可带净负电荷或净正电荷，可分子在溶液中可带净负电荷或净正电荷，可在电场中移动。在电场中移动。不不 同同 Pr分分 子子 携携 带带 电电 荷荷 量量 不不 同同，分分 子子 大大 小小 也也 不同，故在电场中泳动速度不同，可彼此分离。不同，故在电场中泳动速度不同，可彼此分离。电泳（电泳（electrophoresis)15电场中，带净电荷电场中，带净电荷Q Q的粒子所受电荷引力：的粒子所受电荷引力：溶液中，运动粒子与溶液之间存在阻力溶液中，运动粒子与溶液之间存在阻力F F阻阻：当当F F引引=F=F阻阻时：时：16 粒子粒子泳动速度泳动速度V与场强与场强E、粒子电量、粒子电量Q成正比成正比；V与粒子半径与粒子半径r、溶液粘度、溶液粘度成反比；成反比；V与粒子形状有关。与粒子形状有关。非球形分子（如线状非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受到）在电泳过程中受到更大的阻力。更大的阻力。17电泳过程示意图电泳过程示意图1819A.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE）以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶机械强度好，有弹性，透明，聚丙烯酰胺凝胶机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对化学性质稳定，对pHpH和温度变化小，吸附和和温度变化小，吸附和 电渗作用小，是很好的电泳支持介质。电渗作用小，是很好的电泳支持介质。丙烯酰胺丙烯酰胺单体单体 N N，N-N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺交联剂交联剂催化合成催化合成20CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺丙烯酰胺N,N-甲叉甲叉双丙烯酰胺双丙烯酰胺CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CH C=O NH CH2 NH C=O CH2-CHCH2 CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH()n()n()m()m21常规聚丙烯酰胺凝胶电泳主要特点常规聚丙烯酰胺凝胶电泳主要特点 凝胶由上、下两层凝胶组成凝胶由上、下两层凝胶组成 上层上层大孔径浓缩胶，浓度大孔径浓缩胶，浓度2 23 3；下层下层小孔径分离胶，浓度小孔径分离胶，浓度5 51515；缓冲液中主要阴离子缓冲液中主要阴离子GlyGly-,Cl,Cl-；凝胶凝胶pHpH不同不同 电极缓冲液电极缓冲液pH8.3pH8.3的的Tris-Tris-甘氨酸缓冲液；甘氨酸缓冲液；浓缩胶浓缩胶pH6.8pH6.8的的Tris-HClTris-HCl缓冲液；缓冲液；分离胶分离胶pH8.9 pH8.9 的的Tris-HClTris-HCl缓冲液；缓冲液；三种物理效应三种物理效应样品浓缩效应，凝胶分子筛效应，样品浓缩效应，凝胶分子筛效应，电荷效应。电荷效应。分离效果好，分辨率高。分离效果好，分辨率高。2223Tris-Gly pH=8.3Tris-Gly pH=8.3Tris-HCl pH=6.8T=3%Tris-HCl pH=8.9T=7.5%24板状电泳板状电泳25B.SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳当电泳体系含有十二烷基硫酸钠（当电泳体系含有十二烷基硫酸钠（SDS）时）时,电泳电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，可直接迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，可直接由电泳迁移率由电泳迁移率计算蛋白质分子量计算蛋白质分子量。26SDS的作用原理的作用原理 阴离子阴离子SDS能与蛋白质结合。能与蛋白质结合。当当SDS总量为蛋白量的总量为蛋白量的310倍、且倍、且SDS单位单位浓度大于浓度大于1mol./L时，两者的结合是定量的，时，两者的结合是定量的，每克蛋白质约结合每克蛋白质约结合1.4克克SDS。蛋白质分子结合蛋白质分子结合SDS后，所带负电荷的量远远后，所带负电荷的量远远超过其原有电荷量，从而消除了不同种类蛋白超过其原有电荷量，从而消除了不同种类蛋白质间电荷负荷的差异。质间电荷负荷的差异。27 蛋白质蛋白质-SDS复合物的电荷密度趋于一致。复合物的电荷密度趋于一致。不同蛋白质不同蛋白质-SDS复合物形状相似（长椭球状）。复合物形状相似（长椭球状）。电泳过程中，迁移率仅取决于蛋白质电泳过程中，迁移率仅取决于蛋白质-SDS复合复合 物的大小，即取决于蛋白质分子量的大小，物的大小，即取决于蛋白质分子量的大小，而而 与蛋白质原来所带电荷量无关。与蛋白质原来所带电荷量无关。SDS的作用原理的作用原理 28测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量当蛋白质分子量为当蛋白质分子量为17,000165,000时，复合物时，复合物电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系：电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系：lgMW=lgKbm MW 蛋白质分子量；蛋白质分子量；m 相对迁移率；相对迁移率；K 常数；常数；b 斜率斜率。29 将已知分子量的标准蛋白质在将已知分子量的标准蛋白质在SDS-聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率对分子量的对数作图，即可胺凝胶中的电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。得到一条标准曲线。测定未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳测定未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，根据标准曲线求得其分子量。迁移率，根据标准曲线求得其分子量。测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量3031SDS-PAGE separates proteins by MW十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠32 凝胶色谱凝胶色谱 利用生物大分子的相对分子质量差异，进行利用生物大分子的相对分子质量差异，进行层析层析/色谱分离的方法。色谱分离的方法。凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等为原料，通过特殊工艺合成的层析介丙烯酰胺等为原料，通过特殊工艺合成的层析介质。目前已成为生物化学、分子生物学和生物制质。目前已成为生物化学、分子生物学和生物制药在研究和生产中必不可少的分离介质。药在研究和生产中必不可少的分离介质。凝胶层析介质是惰性球状凝胶颗粒，内部为凝胶层析介质是惰性球状凝胶颗粒，内部为多孔网状结构，形成很多孔穴。多孔网状结构，形成很多孔穴。33凝胶层析原理凝胶层析原理 凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。移动速度较慢，最后被洗脱出来。34凝胶色谱分离3536373839洗脱体积洗脱体积40凝胶色谱分离的应用凝胶色谱分离的应用生物大分子物质的分离纯化生物大分子物质的分离纯化分子量的测定分子量的测定分级分离分级分离溶液浓缩溶液浓缩平衡常数的测定平衡常数的测定细胞及颗粒的分离细胞及颗粒的分离41分子量的测定分子量的测定蛋白质通过凝胶柱的速度，即洗脱体积与其分子量有关蛋白质通过凝胶柱的速度，即洗脱体积与其分子量有关:LogM=kLogM=k1 1-k-k2 2VeVe（VeVe为洗脱体积）为洗脱体积）先测得几种标准蛋白质的先测得几种标准蛋白质的VeVe，并以，并以其分子量对数对其分子量对数对VeVe作图得一直线，作图得一直线，再测出待测样品的再测出待测样品的VeVe，查标准曲线，查标准曲线即可确定分子量。即可确定分子量。LogMLogMA AB BC CLogMLogM测测V V测测42定义定义:利用离子交换树脂作为支持物，将带有不同利用离子交换树脂作为支持物，将带有不同电荷的电荷的PrPr进行分离的方法。进行分离的方法。分类分类:阳离子交换树脂阳离子交换树脂,如羧甲基纤维素等，如羧甲基纤维素等，阴离子交换树脂阴离子交换树脂,如二乙基氨基乙基纤维素如二乙基氨基乙基纤维素 离子交换色谱离子交换色谱43原理原理:带正电荷多的带正电荷多的PrPr与树脂结合较强，而带与树脂结合较强，而带正电荷少的正电荷少的PrPr与树脂结合则较弱。用不同浓与树脂结合则较弱。用不同浓度的阳离子洗脱液，如度的阳离子洗脱液，如NaClNaCl溶液进行梯度洗溶液进行梯度洗脱，通过脱，通过NaNa+的离子交换作用，可以将带有不的离子交换作用，可以将带有不同正电荷的同正电荷的PrPr进行分离。进行分离。44带带正电荷正电荷多多蛋白紧密结合蛋白紧密结合带带负电荷负电荷多蛋多蛋白流过层析柱白流过层析柱阳阳离离子子交交换换树树脂脂工工作作示示意意图图45离离子子交交换换色色谱谱46柱柱层层析析47亲和层析法亲和层析法琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶连接臂连接臂蛋白质分子蛋白质分子48配体配体蛋白质蛋白质蛋白质和配蛋白质和配体复合物体复合物交联试剂交联试剂载体载体配体配体载体与配体载体与配体交联体交联体杂质杂质杂质杂质游离配体游离配体49亲亲和和色色谱谱50亲和层析的特点亲和层析的特点纯化效率极高：亲和层析由于配体与待纯化效率极高：亲和层析由于配体与待分离物质进行特异性结合，所以分离提分离物质进行特异性结合，所以分离提纯的效率极高，提纯度可达几千倍纯的效率极高，提纯度可达几千倍。51 透析法（Dialysis）定义：定义：利用半透膜把大小分子分开的方法。利用半透膜把大小分子分开的方法。Pr Pr溶液置半透膜袋中，置流动溶剂（如蒸馏水）溶液置半透膜袋中，置流动溶剂（如蒸馏水）中，使小分子杂质（如无机盐、单糖、双糖、中，使小分子杂质（如无机盐、单糖、双糖、AAAA、小肽等透出）蛋白质留于袋中而得到分离。小肽等透出）蛋白质留于袋中而得到分离。材料：材料：特制的半透膜，截止分子量一般为一万。特制的半透膜，截止分子量一般为一万。应用：应用：1.1.腹膜透析和人工肾腹膜透析和人工肾 ；2.超超滤滤利用压力或离心力强行使水和小分子杂利用压力或离心力强行使水和小分子杂 质通过超滤膜除去，质通过超滤膜除去，PrPr留在膜上而称之。留在膜上而称之。操作操作:52 透析工作图透析工作图53 超速离心超速离心54