蛋白质相互作用课件(同名1798)

蛋白蛋白质相互作用相互作用研究蛋白质相互作用的目的是发现并明确其相互作用的生物学意义蛋白质相互作用是一种表象，通过表象分析规律，是研究蛋白质相互作用的核心“种瓜得瓜，种豆得豆”是一种表象，反映了遗传这样一种本质现象 可研究对象 合适的研究方法研究蛋白质相互作用需要微观和宏观的结合象与象的一部分定量分析是研究蛋白质相互作用的基础Input：1020mg total proteinsIP sample：Immunoprecipitated from 1000mg of total proteins定量分析是研究蛋白质相互作用的基础Relative exposure level 研究蛋白质相互作用的意义1、蛋白质间的相互作用是细胞生命活动的基础。2、基因只是决定蛋白质，而蛋白质才是发挥作用的主体。蛋白质的相互作用是发挥其功能的主要活动。稳定相互作用形成蛋白质复合体（protein complex）瞬时相互作用（enzyme-substrate）生物学效应稳定的相互作用与瞬间的相互作用共同构成蛋白质相互作用的内涵。研究蛋白质相互作用是为了研究相应的生物学功能确定研究目标寻找相互作用建立相互作用网络和功能体系从蛋白质相互作用到生物学功能。运用蛋白质直接相互作用，发现相互作用蛋白质，再分析这些作用的生物学意义。容易犯的错误：研究一大堆的蛋白相互作用，却不知道这些相互作用有什么生物学意义。从物学功能到蛋白质相互作用。通过改变生物学现象，分析蛋白质间的遗传相互作用，进一步研究相关蛋白质的相互作用。容易犯的错误：找到了平行变化的不相关蛋白质。发现蛋白质相互作用蛋白质-蛋白质直接相互作用遗传功能分析序列与结构比较模拟验证蛋白质相互作用不同方法的交叉验证不同生物体系中验证Protein interaction Affinity:A+B=ABKd=AB/AB,Kd:dissociation constantInteraction KdStreptavidin-biotin binding 10-14MAntibody-antigen interaction(good)10-8-10-10MAntibody-antigen interaction(weak)10-6MEnzyme-substrate 10-6-10-10M蛋白质-蛋白质直接相互作用蛋白质-蛋白质直接相互作用Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗体结合）Affinity interaction（亲和作用）Yeast two-hybrid and phage display（酵母双杂交和噬菌体展示）Surface Plasmon ResonanceFRETProteomic analysis（蛋白质组学技术）Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗体结合）Western blot：变性抗原，主要用于检测蛋白质的存在与否。免疫共沉淀：非变性抗原，用于鉴定不同蛋白质间的相互作用。免疫共沉淀：AbPr1Pr2非特异性结合：Pr1AbPr2抗体筛库：cDNA表达库，抗体结合表达的蛋白质，从而得到基因。已经被质谱和PCR所淘汰Western blot1、电转移效率2、PVDF膜的充分浸润3、转移液中有太多的SDS4、膜的损坏5、转移时胶和膜没有完全接触6、抗体的问题7、抗体的浓度太高或太低8、还原性物质的存在9、封闭不充分SDSPAGE acrylamide的浓度蛋白质上样的量相邻泳道的蛋白质量、离子强度和样品体积转移膜：PVDF膜nitrocellulose膜抗体免疫共沉淀 免疫共沉淀：AbPr1Pr2 非特异性结合：Pr1AbPr2免疫共沉淀123541.抗体很差，2.Western blot问题3.Loading比例不对4.样品太多5.正确蛋白质-蛋白质直接相互作用Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗体结合）Affinity interaction（亲和作用）Yeast two-hybrid and phage display（酵母双杂交和噬菌体展示）Surface Plasmon ResonanceFRETProteomic analysis（蛋白质组学技术）Affinity interaction（亲和作用）GST pull down：已知蛋白质和GST融合，与细胞或组织的“蛋白质汤”混合，用谷胱甘肽亲和层析分离和已知蛋白质结合的新蛋白质。GST tag。BiotinAvidin结合：Biotin标记已知蛋白质，通过Avidin结合biotin标记的蛋白质，从而得到与biotin 标记蛋白结合的新蛋白质。优点是biotinavidin的结合是最牢靠的；缺点是细胞内结合biotin的蛋白质很多。各种不同的tag。许多GST pull downGST Fusion Protein PurificationbindingwashelutionGST pull downGST fusion protein 不够纯，用作bait会产生太多的非特异性蛋白质污染。GST pull downGST PulldownbindingwashelutionBiotinAvidin结合：生物界最稳定的结合之一蛋白质-蛋白质直接相互作用Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗体结合）Affinity interaction（亲和作用）Yeast two-hybrid and phage display（酵母双杂交和噬菌体展示）Surface Plasmon ResonanceFRETProteomic analysis（蛋白质组学技术）Yeast two-hybrid（酵母双杂交）发现新的相互作用蛋白质 鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用 确定蛋白质间相互作用的功能基团lacZUASDBADlacZUASADDBlacZlacZUASADYDBXlacZ发现新的相互作用蛋白质BDB-PrMarker1AD基因基因库Marker2lacZUASADYlacZDBB-prBDB-PrMarker1AD基因基因库Marker2lacZUASADlacZDBB-prBDB-PrMarker1YAD基因基因库Marker2确定蛋白质间相互作用的功能基团Protein A1234BDB-PrMarker1AD1Marker2AD2Marker2AD3AD3白白 兰 白白 白白鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用BDB-PrMarker1ADA-PrMarker2兰：相互作用：相互作用白：不相互作用白：不相互作用Two-Hybrid的优点：是酵母细胞内的in vivo相互作用。只需要cDNA，简单。弱的相互作用也能检测到。Two-Hybrid的缺点：都是融合蛋白，万一融合出新的相互作用。酵母的翻译后修饰不尽相同。尤其是蛋白质的调控性修饰。自身激活报告基因。都基因库的要求比较高，单向1/3是in frame蛋白质毒性。第三者Z插足介导的相互作用。假阳性。lacZUASDBXlacZDBXAuto activationBDXMarker1ADYlacZUASADYlacZADYMarker2Phage display（噬菌体展示）Phage display（噬菌体展示）Phage display的最大优点是数量大细胞：108109细菌：1010Phage：1012寻找受体的配体7肽：8x1016蛋白质-蛋白质直接相互作用Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗体结合）Affinity interaction（亲和作用）Yeast two-hybrid and phage display（酵母双杂交和噬菌体展示）Surface Plasmon ResonanceFRETProteomic analysis（蛋白质组学技术）SPR is used to monitor interactions occurring in a biospecific surface on a metal layer by measuring changes in the solute concentration at this surface as a result of the interactions.Surface Plasmon ResonanceSPR 优点：无标记、实时Label-free detectionSRP does not require any labels or reporter groups to detect biomolecular interactions.It follows every step in a multi-step analysis procedure,in contrast to label-based methods that often only report the final step.Real time measurementThe progress of interactions is displayed directly,as a plot of response(which is directly related to concentration changes at the surface)against time.Immediate feedback on the status of an interaction speeds up assay development and analysis.The results can be processed further after the run,for example to extract kinetic constants for the interaction.蛋白质-蛋白质直接相互作用Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗体结合）Affinity interaction（亲和作用）Yeast two-hybrid and phage display（酵母双杂交和噬菌体展示）Surface Plasmon ResonanceFRETProteomic analysis（蛋白质组学技术）DonorAcceptor(2-10nm)Excitation frequencyEmission frequency=Excitation frequency Emission frequencyFluorescence Resonance Energy Transfer(FRET)Donor is excited at the maximum absorbance wavelength(380 nanometers)of the donorAcceptor signal is increased at the acceptor emission maximum(510 nanometers)Color defining GFP mutation(source)Blue(BFP)Y66HGreen(GFP)Y66WCyan(CFP)S65TYellowish(YFP)S65G,T203YRed(D.s.RFP)D.striataExcitation(max)382 nm434 nm488 nm514 nm558 nmEmission(max)446 nm476 nm509 nm527 nm583 nmSensitivity to photobleachingHighLowLowModerateLowWavelength of the Fluorescent Proteins Measure interactions between two proteins in vivo Very sensitive Excellent resolution Helpful in characterizing major conformational changes in macromolecules Determine the interaction qualitatively and quantitativelyAdvantages of FRET Limitations of FRET FRET only occurs when the two fluorophores are within 2-10nm of each other,which means that the fluorophores must be brought together via very close protein-protein interactions.Require expensive equipment.Require labeling of proteins using fluorophore or GFP fusionProteomic analysis（蛋白质组学技术）有有专门的的课题加以介加以介绍研究蛋白质相互作用的单分子技术：原子力相互作用遗传功能分析利用功能缺陷和互补来分析不同蛋白质间的相互关系。不是蛋白质直接相互作用的证据，但可以提供进一步研究的目标。蛋白质遗传相互作用（genetic interaction）是功能性相互作用有A：小量表达；有B：无表达；有C：无表达ABCABC有A和B：表达增加；有A和C：小量表达；有B和C：无表达ABCABC有A、B和C：高表达在A、B和C的蛋白质复合体中，A是和基因调控区结合并有小的转录活性；B可以和A结合促进A的转录活性；C本身不能直接促进A的活性，所以不大可能和A有直接相互作用，但能通过B的介导进一步促进转录。ABC蛋白质直接相互作用：从蛋白质物理的相互作用到功能上的相互作用。蛋白质遗传相互作用：从功能上的相互作用到蛋白质物理的相互作用。蛋白质相互作用是物理相互作用和功能相互作用的统一蛋白质直接相互作用：从蛋白质物理的相互作用到功能上的相互作用。蛋白质遗传相互作用：从功能上的相互作用到蛋白质物理的相互作用。蛋白质相互作用是物理相互作用和功能相互作用的统一发现相互作用的蛋白质相互作用的验证生物学功能生物学功能的研究：相互作用的生物学功能研究基本上可以归为两类：获得功能或失去功能。生物学问题技术手段对问题的认识相互作用与功能获得功能：转基因表达，使得原本不表达该蛋白质的细胞表达了蛋白质，从而和已有的蛋白质发生相互作用，细胞有了新的功能。常用的方法有细胞内转基因过表达蛋白质、转基因老鼠。失去功能：抑制蛋白质的表达或用dominant negative突变体，使原有的蛋白质缺失或失活，细胞功能的丧失。常用的方法有：RNA干扰使蛋白质不表达、蛋白质部分功能片断的影响、基因敲除的细胞、基因敲除的老鼠。从生物学功能的改变到相互作用蛋白质的发现。功能性筛选：RNAi，基因敲除小鼠一些常规生化技术方法：方法和原理蛋白质等电点计算：对于实验buffer体系pH值有重要作用。蛋白质浓度的测定：定量分析的基础。荧光：ECL和细胞免疫荧光。层析：离子交换、分子筛、亲和层析、反相层析、等。离心：超速离心。电泳：SDS-PAGE、非变性电泳、等点聚焦、等。Kit方便了我们的实验，但不能方便我们对原理的认识。谢 谢谢谢观赏谢谢观赏