蛋白质的构件氨基酸培训课件

蛋白蛋白质质的构件氨基酸的构件氨基酸一、蛋白质的化学组成和分类一、蛋白质的化学组成和分类二、蛋白质的水解二、蛋白质的水解三、三、-氨基酸的一般结构氨基酸的一般结构四、氨基酸的分类四、氨基酸的分类五、氨基酸的酸碱性质五、氨基酸的酸碱性质六、氨基酸的化学反应六、氨基酸的化学反应七、氨基酸的旋光性和光谱性质七、氨基酸的旋光性和光谱性质八、氨基酸混合物的分离和分析八、氨基酸混合物的分离和分析教学内容2蛋白质的构件氨基酸三、三、-氨基酸的一般结构氨基酸的一般结构-氨基酸：氨基酸：D、L-构型，旋光性构型，旋光性3蛋白质的构件氨基酸1.常见的蛋白质氨基酸2.不常见的蛋白质氨基酸3.非蛋白质氨基酸四、氨基酸的分类四、氨基酸的分类4蛋白质的构件氨基酸1.常见的蛋白质氨基酸5蛋白质的构件氨基酸n常见蛋白质氨基酸常见蛋白质氨基酸或称为或称为基本氨基酸基本氨基酸共共20种，可按种，可按R-基化基化学结构、学结构、R-基极性进行分类。基极性进行分类。1.1.1 按按R-基化学结构的分类：基化学结构的分类：脂肪族、芳香族和杂环族三类脂肪族、芳香族和杂环族三类,对研究氨对研究氨 基酸生物合成与基酸生物合成与分解有重要意义。分解有重要意义。1.1 常见蛋白质氨基酸的分类6蛋白质的构件氨基酸中性脂肪族氨基酸（中性脂肪族氨基酸（5 5）；）；含羟基或硫的氨基酸（含羟基或硫的氨基酸（4 4）；）；酸性氨基酸及其酰胺（酸性氨基酸及其酰胺（4 4）；）；碱性氨基酸（碱性氨基酸（2 2）.脂肪族脂肪族氨基酸氨基酸1.1.1.1 1.1.1.1 脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸7蛋白质的构件氨基酸中性脂肪族中性脂肪族氨基酸氨基酸8蛋白质的构件氨基酸含羟基或硫的氨基酸含羟基或硫的氨基酸9蛋白质的构件氨基酸酸性氨基酸及其酰胺酸性氨基酸及其酰胺10蛋白质的构件氨基酸碱性氨基酸碱性氨基酸11蛋白质的构件氨基酸1.1.1.2 芳香族氨基酸芳香族氨基酸12蛋白质的构件氨基酸1.1.1.3 杂环族氨基酸杂环族氨基酸13蛋白质的构件氨基酸1.1.2 按按R-基的极性的分类：基的极性的分类：对于研究氨基酸在蛋白质空间结构中的作用，氨基酸的分对于研究氨基酸在蛋白质空间结构中的作用，氨基酸的分离纯化均有重要意义。离纯化均有重要意义。非极性非极性R-基氨基酸基氨基酸不带电荷的极性不带电荷的极性R-基氨基酸基氨基酸带正电荷的极性带正电荷的极性R-基氨基酸基氨基酸带负电荷的极性带负电荷的极性R-基氨基酸基氨基酸14蛋白质的构件氨基酸(二)不常见的蛋白质氨基酸少数蛋白少数蛋白胶原蛋白成分胶原蛋白成分肌球蛋白成分肌球蛋白成分凝血酶原凝血酶原细胞调节蛋白细胞调节蛋白15蛋白质的构件氨基酸(三)非蛋白质氨基酸16蛋白质的构件氨基酸一、蛋白质的化学组成和分类二、蛋白质的水解三、-氨基酸的一般结构四、氨基酸的分类五、氨基酸的酸碱性质六、氨基酸的化学反应七、氨基酸的旋光性和光谱性质八、氨基酸混合物的分离和分析教学内容17蛋白质的构件氨基酸1.氨基酸的解离 2.氨基酸的等电点五、氨基酸的酸碱性质18蛋白质的构件氨基酸兼性离子兼性离子(偶极离子偶极离子)；两性电解质两性电解质1.氨基酸的解离根据 Henderson-Hasselbalch equation:在给定 pKa1、pKa2 等数据情况下，可以计算任意pH条件下一种氨基酸的各种离子比例。19蛋白质的构件氨基酸1.1 解离常数的实验求法:可从可从A0、A+或或 A-开始滴定。开始滴定。当当10 mmol Gly 溶于水时，溶于水时，溶液的溶液的pH约等于约等于6.0。用标准用标准 NaOH 溶液滴定，以溶液滴定，以加人的加人的NaOH摩尔数对摩尔数对pH作作图，则得滴定曲线图，则得滴定曲线B段，在段，在 pH 9.60 处有一个拐点，处有一个拐点，Gly0=Gly-。用标准用标准HCl滴定，则得滴定滴定，则得滴定曲线曲线A段，在段，在 pH 2.34 处有处有一个拐点，一个拐点，Gly+=Gly0。ABGly+=Gly0Gly0=Gly-20蛋白质的构件氨基酸21蛋白质的构件氨基酸酸性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸碱性氨基酸1.2 酸性、碱性氨基酸的解离酸性、碱性氨基酸的解离22蛋白质的构件氨基酸等电点的概念：等电点的概念：在适当的酸碱度时，氨基酸在适当的酸碱度时，氨基酸(两性离子两性离子)的氨基和羧基（酸的氨基和羧基（酸性和碱性基团）的解离度可能完全相等，性和碱性基团）的解离度可能完全相等，正离子正离子=负负离子离子，净电荷为零，在电场中既不向阳极移动，也不向，净电荷为零，在电场中既不向阳极移动，也不向阴极移动，成为两性离子。此时氨基酸所处的阴极移动，成为两性离子。此时氨基酸所处的 pH 值就称值就称为该氨基酸的为该氨基酸的等电点等电点，以，以 pI 符号代表。符号代表。在等电点时，氨基酸的溶解度最小，易沉淀析出。在等电点时，氨基酸的溶解度最小，易沉淀析出。等电点的计算：等电点的计算：pI=等电氨基酸两侧的等电氨基酸两侧的 pK 值相加被值相加被 2 除除2.氨基酸的等电点23蛋白质的构件氨基酸一、蛋白质的化学组成和分类二、蛋白质的水解三、-氨基酸的一般结构四、氨基酸的分类五、氨基酸的酸碱性质六、氨基酸的化学反应七、氨基酸的旋光性和光谱性质八、氨基酸混合物的分离和分析教学内容24蛋白质的构件氨基酸1.-羧基反应（自学）2.-氨基反应（自学）3.茚三酮反应4.侧链官能团的特异反应六、氨基酸的化学反应25蛋白质的构件氨基酸3.与茚三酮反应-氨基和氨基和-羧基共同参羧基共同参加的反应。加的反应。除除 Pro 外，外，20 种氨基酸种氨基酸均呈现紫色。均呈现紫色。氨基酸定量测定。氨基酸定量测定。26蛋白质的构件氨基酸微碱性 pH 下，-SH 解离 硫醇阴离子，巯基的反应形式。硫硝基苯甲酸在 pH8.0 时，412 nm处有强烈的光吸收，可利用分光光度法定量测定-SH基。4.侧链R基参加的特异反应27蛋白质的构件氨基酸-SH很容易受空气或其他氧化剂氧化。强氧化剂如过甲酸使-SH 和-S-S-键氧化成磺酸基(-SO3H)。蛋白质结构分析中胱氨酸残基的二硫键常用氧化剂或还原剂打开。磺基丙氨酸磺基丙氨酸巯基乙醇或巯基乙醇或二硫苏糖醇二硫苏糖醇还原剂打开二硫键后，要用碘乙酸或碘乙酰胺试剂保护28蛋白质的构件氨基酸一、蛋白质的化学组成和分类二、蛋白质的水解三、-氨基酸的一般结构四、氨基酸的分类五、氨基酸的酸碱性质六、氨基酸的化学反应七、氨基酸的旋光性和光谱性质八、氨基酸混合物的分离和分析教学内容29蛋白质的构件氨基酸1.氨基酸的旋光性和立体化学2.氨基酸的光谱性质七、氨基酸的旋光性和光谱性质30蛋白质的构件氨基酸1.氨基酸的光学活性和立体化学除除 Gly 外，外，19 种氨基酸的种氨基酸的-碳原子都是不对称碳原子都是不对称碳原子，有两种光学异构体，可用碳原子，有两种光学异构体，可用 D-或或 L-表示。表示。构成蛋白质的氨基酸均属构成蛋白质的氨基酸均属 L-型型(L-苏氨酸苏氨酸)，大，大部分游离氨基酸也是部分游离氨基酸也是 L-型。型。31蛋白质的构件氨基酸含有两个手性碳的情况：32蛋白质的构件氨基酸外消旋物的概念：D-型和型和 L-型的等摩尔混合物。型的等摩尔混合物。L-苏氨酸和苏氨酸和 D-苏氨酸、苏氨酸、L-别一苏氨酸和别一苏氨酸和 D-别别-苏氨酸分苏氨酸分别组成消旋物，而别组成消旋物，而 L-（D-）苏氨酸和）苏氨酸和 L-（D-）别一苏）别一苏氨酸则是非对映体。氨酸则是非对映体。旋光性物质在化学反应时经过对称的过度态时会发生消旋光性物质在化学反应时经过对称的过度态时会发生消旋现象。旋现象。蛋白质在与碱共热水解时或用一般的化学方法人工合成蛋白质在与碱共热水解时或用一般的化学方法人工合成氨基酸时也会得到无旋光性的氨基酸时也会得到无旋光性的 D-、L-消旋物。消旋物。33蛋白质的构件氨基酸2020种氨基酸光吸收情况：种氨基酸光吸收情况：在可见光区无光吸收，在远红外和紫外区均有光吸在可见光区无光吸收，在远红外和紫外区均有光吸收，在近紫外区只有芳香族氨基酸有光吸收收，在近紫外区只有芳香族氨基酸有光吸收,因其因其R R基基有苯环共轭有苯环共轭键系统键系统.（二）氨基酸的光谱性质X-射线射线微波区微波区100200400800 125350nmum近红外近红外远红外远红外远紫外远紫外近紫外近紫外可见光可见光部分光谱的分布：部分光谱的分布：35蛋白质的构件氨基酸 Tyr 的最大光吸收波长为 275nm，其摩尔吸光系数为:275=1.4103 mol-1Lcm-1,同理:Phr,257=2.0 102;Trp:280=5.6 103.芳香族氨基酸的光吸收芳香族氨基酸的光吸收蛋白质在280nm处有最大紫外吸收,用于蛋白质 的定量测定。Tyr对蛋白质在280nm处最大光吸收的贡献最大。单论氨基酸，Trp具有最大光吸收.36蛋白质的构件氨基酸A:吸光度:摩尔吸光系数;c:浓度(mol/L);l:吸收杯的内径或光程厚度;I0:入射光强度;I:透射光强度;T:透光率Lambert-beer 定律定律:分光光度法测定蛋白质含量分光光度法测定蛋白质含量37蛋白质的构件氨基酸氨基酸的氨基酸的核磁共振核磁共振(NMR)外加磁场作用下，原子核自旋方向达到一致，可以和一定频率外加磁场作用下，原子核自旋方向达到一致，可以和一定频率的外加磁场共振而形成吸收峰。的外加磁场共振而形成吸收峰。同一种原子核在分子中的位置不同，因其外围的电子云对核的同一种原子核在分子中的位置不同，因其外围的电子云对核的屏蔽作用引起的吸收峰位置移动（化学位移）也不同，由吸收屏蔽作用引起的吸收峰位置移动（化学位移）也不同，由吸收峰的位置可以推断原子处于哪一个基团。峰的位置可以推断原子处于哪一个基团。在在1H NMR谱中，当相邻基团上有谱中，当相邻基团上有n个质子时，该基团的质子个质子时，该基团的质子吸收峰将分裂成吸收峰将分裂成n+1个峰。个峰。氨基酸的1H NMR谱38蛋白质的构件氨基酸一、蛋白质的化学组成和分类二、蛋白质的水解三、-氨基酸的一般结构四、氨基酸的分类五、氨基酸的酸碱性质六、氨基酸的化学反应七、氨基酸的旋光性和光谱性质八、氨基酸混合物的分离和分析教学内容39蛋白质的构件氨基酸(一)分配层析(二)离子交换层析八、氨基酸混合物的分离和分析40蛋白质的构件氨基酸层析层析也称色谱。也称色谱。1903，俄植物学家提出（附层析）。，俄植物学家提出（附层析）。1941，英，英 Martin 与与 Synge 提出提出分配（分配（partition）层析）层析。组成：组成：固定相（固定相（B）和流动相（）和流动相（A）。）。混合物在层析系统中的分离决定于该混合物组分在这两相混合物在层析系统中的分离决定于该混合物组分在这两相中的分配系数。中的分配系数。分配系数：分配系数：一种溶质在两个给定的互不相溶的溶剂中分配时，一种溶质在两个给定的互不相溶的溶剂中分配时，一定温度下达到平衡，溶质在两相中的浓度比为一常数，一定温度下达到平衡，溶质在两相中的浓度比为一常数，分配系数（分配系数（Kd）：）：(一)分配层析41蛋白质的构件氨基酸分配可在互不相溶的液相分配可在互不相溶的液相-液相系统、固相液相系统、固相-液相间或气液相间或气相相-液相间发生。液相间发生。固定相可以是固相、液相或固固定相可以是固相、液相或固-液混合相液混合相(半液体半液体)；流动；流动相可以是液相或气相相可以是液相或气相,它充满于固定相的空隙中它充满于固定相的空隙中,并能流并能流过固定相。过固定相。层析法分离氨基酸混合物层析法分离氨基酸混合物,其先决条件是各种氨基酸成其先决条件是各种氨基酸成分的分配系数要有差别分的分配系数要有差别,一般差别越大，越容易分开。一般差别越大，越容易分开。逆流分布逆流分布(分离柱中两相反向流动并相互接触，分离柱中两相反向流动并相互接触，countercurrent distribution)的方法作为分配层析原理：的方法作为分配层析原理：(一)分配层析42蛋白质的构件氨基酸逆流分布方法的基本原理43蛋白质的构件氨基酸(一一)分配层析法的一般原理分配层析法的一般原理填充物或支持剂填充物或支持剂:一些具有亲水性的不溶物质一些具有亲水性的不溶物质,如纤维素、淀如纤维素、淀粉、硅胶等。粉、硅胶等。支持剂吸附着一层不会流动的结合水支持剂吸附着一层不会流动的结合水,可以看作固定相可以看作固定相,沿固沿固定相流过的与它不互溶的溶剂定相流过的与它不互溶的溶剂(如苯酚、正丁醇等如苯酚、正丁醇等)是流动相是流动相分布曲线44蛋白质的构件氨基酸离子交换层析，离子交换层析，基于氨基酸电荷行为的层析方法，填充购物基于氨基酸电荷行为的层析方法，填充购物为离子交换树脂。为离子交换树脂。离子交换树脂：离子交换树脂：有酸性或碱性基团的人工合成聚苯乙烯有酸性或碱性基团的人工合成聚苯乙烯-苯二乙烯等不苯二乙烯等不溶性高分子化合物，一般都制成球形颗粒。溶性高分子化合物，一般都制成球形颗粒。阳离子交换树脂含酸性基团，如阳离子交换树脂含酸性基团，如-SO3H(强酸型强酸型)或或-COOH(弱酸型弱酸型)可解离出可解离出H+，当酸性溶液含氨基酸阳离子时，它们，当酸性溶液含氨基酸阳离子时，它们可以和可以和H+发生交换发生交换“结合结合”在树脂上；阴离子交换树脂含有在树脂上；阴离子交换树脂含有的碱性基团，如的碱性基团，如-N(CH3)3OH(强碱型强碱型)或或-NH3OH(弱碱型弱碱型)可可解离出解离出OH-离子，能和溶液里的阴离子发生交换而结合在树离子，能和溶液里的阴离子发生交换而结合在树脂上。脂上。(二)离子交换层析45蛋白质的构件氨基酸Cation Exchange Media Structure Anion Exchange Media StructureStrongly acidic,polystyrene resin(Dowex50)Weakly acidic,carboxymethyl(CM)celluloseWeakly acidic,chelating,polystyrene resin(Chelex100)Strongly basic,polystyrene resin(Dowex1)Weakly basic,diethylaminoethyl(DEAE)cellulose几种离子交换树脂46蛋白质的构件氨基酸Operation of a cation exchange column,separating a mixture of Asp,Ser,and Lys.(a)The cation exchange resin in the beginning,Na form.(b)A mixture of Asp,Ser,and Lys is added to the column containing the resin.(c)A gradient of the eluting salt(e.g.,NaCl)is added to the column.Asp,the least positively charged amino acid,is eluted first.(d)As the salt concentration increases,Ser is eluted.(e)As the salt concentration is increased further,Lys,the most positively charged of the three amino acids,is eluted last离子交换树脂分离氨基酸的一般过程以Asp、Ser和Lys为例：47蛋白质的构件氨基酸48蛋白质的构件氨基酸1.掌握氨基酸的一般结构和氨基酸的分类；2.掌握氨基酸的酸碱性质和等电点的计算方法；3.熟悉氨基酸的常见化学反应的应用价值；4.熟悉分离和分析氨基酸的常用方法。机会总是给准备最充分的人留着的！机会总是给准备最充分的人留着的！基本要求：作业：第作业：第1 1、5 5、1010题题49蛋白质的构件氨基酸