蛋白质的分离纯化2课件

邱邱 晓晓 挺挺高级生物化学高级生物化学蛋白质的分离纯化（蛋白质的分离纯化（IIII）4.2 4.2 凝胶过滤层析凝胶过滤层析（Gel filtration；GF）GF is a simple and reliable chromatographic method for separating molecules according to size 分子筛分子筛Scanning electron micrograph of an agarose gel.Magnification x 50,000Anders S.Medin,PhD Thesis,Uppsala University 1995.凝胶过滤色谱介质是由直径大小为凝胶过滤色谱介质是由直径大小为0.1mm0.1mm的不溶于水的不溶于水的的,亲水的亲水的,惰性的颗粒惰性的颗粒(Beads)(Beads)组成组成.The beads are composed of dextran polymers(sephadex),agarose(Sepharose瑞典，瑞典，Bio-gelA美国，美国，segavac英国英国)polyacrylamide (Sephacryl or BioGel P)etc.基于大小不同的蛋白从限定大小颗粒内径的层析柱中基于大小不同的蛋白从限定大小颗粒内径的层析柱中进行进行洗脱体积洗脱体积(或流速一定时的或流速一定时的洗脱时间洗脱时间)的的差别差别。分分离也与蛋白的形状有关离也与蛋白的形状有关。蛋白越小蛋白越小,在柱中的保留时间越长在柱中的保留时间越长,洗脱体积越大洗脱体积越大,洗脱时间越长洗脱时间越长。对于对于蛋白的聚集蛋白的聚集敏感敏感.。凝胶过滤色谱的原理凝胶过滤色谱的原理凝胶过滤色谱的基本术语Vt=总体积总体积Vo=外体积外体积,孔隙体积孔隙体积,外水体积外水体积Vi=内体积内体积,内水体积内水体积Vg=凝胶本身的体积凝胶本身的体积Vt=Vi+Vg+VoVe=洗脱体积洗脱体积(elution volume)，指某一成分从柱顶部到底部的指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值洗脱液中出现浓度达到最大值时的流动相体积时的流动相体积.Kav=分配系数分配系数(Partition Coefficient)一组分在固定相与流动相中含量的比值一组分在固定相与流动相中含量的比值分离化合物在内水和外水体积中的比例关系，分离化合物在内水和外水体积中的比例关系，表示排阻程度表示排阻程度Kav(Ve-Vo)/ViKav=0,VeVo，全排阻。Kav=1,Ve=Vo+Vi,全进入。0 Kav 1,吸附作用。Vt=总体积总体积Vo=外水体积外水体积Vi=内水体积内水体积The three categories of accessible volumes are used for different purposes.Molecules with partial access to the pores will be retarded in relation to their respective degree of access to the poresMolecules with full access to the pores will all move down the column at the same speed and remain unseparated from each other.1.Equilibration.The column is equilibrated with the buffer intended for the separation.Procedure:2.Sample application.The sample is added as a sharp narrow zone at the top of the column.For good resolution the sample volume should be restricted to 0.5-5%of the column volume 3.Elution.Elution buffer(normally the same type buffer as that used for equilibration)is pumped through the column to make the sample components separate by continuous re-partitioning.Characterization of gel filtration mediaThe selectivity of a gel filtration medium depends on its pore size distribution a selectivity curve is used Fractionation ranges for Superdex and Sephacryl gel filtration media.The steeper the curve,the higher the resolution KavMr凝胶过滤层析操作中的注意点凝胶过滤层析操作中的注意点上样体积要足够的小（一般为整个柱体积的0.55）。控制流速，防止过压。样品中可含一定的盐分。洗脱一般为无梯度的洗脱。4.3 4.3 亲和色谱亲和色谱Affinity chromatography(AC)AC enabling purification of a biomolecule with respect to biological function or individual chemical structure.亲和层析是以蛋白质与结合在介质上的配基间的特亲和层析是以蛋白质与结合在介质上的配基间的特异亲和力为工作基础。异亲和力为工作基础。配基可以是生物学特异的，如底物、抗体、抑制剂、配基可以是生物学特异的，如底物、抗体、抑制剂、辅酶及蛋白质（如抗原、抗体）、核酸。也可以是辅酶及蛋白质（如抗原、抗体）、核酸。也可以是具有相对特异相互作用的凝集素（糖结合蛋白）、具有相对特异相互作用的凝集素（糖结合蛋白）、染料和疏水分子染料和疏水分子(亦可归属疏水相互作用色谱亦可归属疏水相互作用色谱)。亲和层析是应用了亲和层析是应用了特定蛋白的生物学特异性特定蛋白的生物学特异性而不是而不是物化特性。具有亲和选择性强，纯化效率高，可以物化特性。具有亲和选择性强，纯化效率高，可以一步纯化。一步纯化。AC relies upon a reversible highly specific binding reaction L+T LT直接亲和层析直接亲和层析亲和色谱需要一个特定的配亲和色谱需要一个特定的配基基,此配基能共价结合于支持此配基能共价结合于支持物而不改变其结合力物而不改变其结合力.最有效的配基是具有解离最有效的配基是具有解离常数为常数为 M-mM 范围内结范围内结合蛋白的那类合蛋白的那类.此外必需有一个可溶性此外必需有一个可溶性的配体形式的配体形式,其能有效的其能有效的竞争结合竞争结合.最好结合能被调节最好结合能被调节.连接配基到支持物上连接配基到支持物上挑选的支持物必须有挑选的支持物必须有适于偶联适于偶联,不能单独与蛋白反应不能单独与蛋白反应.伴刀豆球蛋白A spacer is sometimes used to ensure full accessibility of the affinity ligand 连接者连接者-手臂手臂(Arms)连接者手臂可以延伸配基使其远离介质表面连接者手臂可以延伸配基使其远离介质表面,从而消除配基从而消除配基结合蛋白表面的立体限制结合蛋白表面的立体限制.经常优选相对短经常优选相对短(up to C6-C8)的连接者手臂的连接者手臂,因为较长的碳链其因为较长的碳链其本身也会产生立体干扰本身也会产生立体干扰,且会提供疏水表面从而会发生非特异性且会提供疏水表面从而会发生非特异性的结合的结合.Suitable conditions for binding/elution find a ligand specific enough,but with a binding strength that allows safe elution No leakage during sample application and wash.Target molecule elutes as a narrow peak与基因工程技术相结合的亲和层析与基因工程技术相结合的亲和层析Affinity chromatography applied to Affinity chromatography applied to recombinant proteinsrecombinant proteins是基因工程技术，蛋白质化学技术与色谱技术的是基因工程技术，蛋白质化学技术与色谱技术的结合（也可直接用于纯化特定的金属蛋白结合）结合（也可直接用于纯化特定的金属蛋白结合）.理论上其可以纯化所有的蛋白，故广泛应用于高理论上其可以纯化所有的蛋白，故广泛应用于高通量蛋白质的纯化通量蛋白质的纯化。重组技术拓宽了亲和色谱的选择重组技术拓宽了亲和色谱的选择蛋白有能力附上特异的序列片断蛋白有能力附上特异的序列片断,以及特异金属螯合以及特异金属螯合的支持物的发展已经提供了一个新的途径的支持物的发展已经提供了一个新的途径.His6(HHHHHH)为最普遍应用的为最普遍应用的 tag,从而使蛋白从而使蛋白的纯化在固定金属亲和柱上进行的纯化在固定金属亲和柱上进行.His6 tag 既可置于既可置于 N-端也可置于端也可置于 C-端以助于纯化端以助于纯化HisHisHisHisHisthrombinthrombinproteinproteinproteinproteinproteinTEVTEVSXa表达构建选择表达构建选择表达构建选择表达构建选择XapET15bpET30LICMCSG3pRroEX(ENLYFQ G)MCSG7(ENLYFQ S)Tag cleavage efficiencyproteasetime hrt Csuccess rate,%specificitythrombin16-24 25-37 90-/+factor Xa16-60 25-37 60+/-rTEV1-3 4-30 95+Affinity tag small easy to remove (protease)Protease specificity fast cheap taggedtobacco etch virus(TEV)protease Production and purification of fusion proteins 重组技术拓宽了亲和色谱的选择重组技术拓宽了亲和色谱的选择金属亲和色谱使得从细胞裂解液中得到的金属亲和色谱使得从细胞裂解液中得到的His6-tag蛋白的快速分离称为可能蛋白的快速分离称为可能.一般的一般的,固定化金属离子亲合色谱固定化金属离子亲合色谱柱既能在天然柱既能在天然状态下也能在变性状态下也能在变性(6M 盐酸胍盐酸胍)条件下操作条件下操作.interaction A is weak-no binding of the 6xHis-tagged proteins.interaction A is strong,but interaction B weak,protein is lost as proteinmetal complexesduring wash steps.When NTA ligand and nickel are used to bind 6xHis-tagged molecules,both interactions are stronger.蛋白洗脱蛋白洗脱结合的重组蛋白结合的重组蛋白可以用改变可以用改变pHpH值的方法值的方法可以用提高咪唑浓度的方法来洗脱可以用提高咪唑浓度的方法来洗脱.SDS-PAGE analysis(Coomassie stain)of the indicated fractions.CL:cleared lysate(5l);FT:flow through(5 l);W:wash(5 l);E1E6:elution fractions(1 l).M:marker(sizes as indicated on the left kDa).Schematic overview of(His)6 fusion protein purification using HiTrap Chelating HP 其它用基因工程技术所采用的其它用基因工程技术所采用的亲和层析技术亲和层析技术谷胱甘肽谷胱甘肽S-S-转移酶（转移酶（Glutathione S-Glutathione S-transferasetransferase，GSTGST）亲和层析法）亲和层析法硫氧还蛋白硫氧还蛋白(TRX)(TRX)亲和层析法亲和层析法麦芽糖结合蛋白麦芽糖结合蛋白(MBP)(MBP)亲和层析法亲和层析法谷胱甘肽柱谷胱甘肽柱目的目的:纯化纯化 GST or GST 融合蛋白融合蛋白谷胱甘肽谷胱甘肽 3a.a.肽肽(Glu-Cys-Gly)GST 对对 其有亲和力其有亲和力GSH GSSGSchematic overview of GST fusion protein purification using GSTrap His-tags His-tags 融合蛋白往往溶解性差，蛋白折叠不正融合蛋白往往溶解性差，蛋白折叠不正确，易形成包涵体。但较为稳定确，易形成包涵体。但较为稳定GST-GST-融合蛋白往往溶解性较好，可能对蛋白的正融合蛋白往往溶解性较好，可能对蛋白的正确折叠有一定的贡献。但是易降解。确折叠有一定的贡献。但是易降解。不同的表达标签会对蛋白产生不同的效应4.4 4.4 反相色谱反相色谱(Reversed-Phase(Reversed-Phase ChromatographyChromatography；HPCHPC）purification and separation of biomolecules based on differences in their surface hydrophobicity.REVERSED PHASE SEPARATIONPRINCIPLENonpolar(nonspecific)interactions of analyte with hydrophobic adsorbent surface 烷基硅烷烷基硅烷(-C18,C8,C4)Different sorption affinities（吸附力）（吸附力）between analytes results in their separationMore polar analytes retained lessAnalytes with larger hydrophobic part are retained longerAlmost no separation of structural isomersReversed phase chromatographymolecules of interest can be bound while contaminants pass through or contaminants can be bound while the molecule of interest passes through.Based on the hydrophobic interactions between solute molecules immobilized matrix-bound ligandsRPC:RPC:随着非极性溶剂梯度的增加而洗脱出疏水性越来越强随着非极性溶剂梯度的增加而洗脱出疏水性越来越强的分子。一般采用梯度递增为乙腈（含的分子。一般采用梯度递增为乙腈（含0.10.10.050.05TFA)TFA)溶溶剂洗脱剂洗脱.常用来分离肽片断，或者用于纯化不需要活性的蛋白分子常用来分离肽片断，或者用于纯化不需要活性的蛋白分子（如包涵体的预纯化）。（如包涵体的预纯化）。0.10.10.050.05TFATFA的溶液增加了蛋白分子的溶解性及屏蔽碱的溶液增加了蛋白分子的溶解性及屏蔽碱性残基的电荷利于相互疏水作用。碱性较强的蛋白在性残基的电荷利于相互疏水作用。碱性较强的蛋白在RPCRPC中中较先洗脱。较先洗脱。C18C18柱常用来分离肽混合物，柱常用来分离肽混合物，C4C4及及C8C8柱常用来分离蛋白质。柱常用来分离蛋白质。Many biomolecules generally considered to be hydrophilic also have sufficient numbers of hydrophobic groups allowing interaction with hydrophobic ligands coupled to the chromatographic matrix.Hydrophobic and hydrophilic parts on the surface of lysozymeProcedure4.5 4.5 疏水相互作用色谱疏水相互作用色谱Hydrophobic Interaction Hydrophobic Interaction Chromatography(HIC)Chromatography(HIC)疏水相互作用色谱是利用了蛋白的疏水相互作用色谱是利用了蛋白的疏水补丁与疏水性疏水补丁与疏水性介质的相互作用介质的相互作用decreasing salt concentrationUV absorbanceproteinsurface-+-nonpolarnonpolar蛋白在高盐条件下被结合蛋白在高盐条件下被结合,降低盐浓度以洗脱蛋白降低盐浓度以洗脱蛋白盐离子可暴露蛋白表面的疏水氨基酸残基盐离子可暴露蛋白表面的疏水氨基酸残基.改变条件可以增强或破坏疏水相互作用改变条件可以增强或破坏疏水相互作用不同的离子对于蛋白的疏水相互作用的影响不同不同的离子对于蛋白的疏水相互作用的影响不同.阴离子阴离子:PO43-SO42-CH3COO-Cl-Br-NO3-SCN-.阳离子阳离子:NH4+Rb+K+Na+Mg2+Ca2+Ba2+.(NH4)2SO4 作为一种最常用的增加蛋白疏水相互作用的盐类作为一种最常用的增加蛋白疏水相互作用的盐类.样品在高盐条件下上样样品在高盐条件下上样 e.g.,1.8 M A.S,然后在低盐条件下洗脱然后在低盐条件下洗脱 0.1 M A.S.盐溶效应增加盐溶效应增加 Procedure阶段洗脱梯度的陡度对分离度的影响梯度的陡度对分离度的影响疏水相互作用色谱的特点疏水相互作用色谱的特点.可以方便用于盐析样品的纯化。可以方便用于盐析样品的纯化。防止上样样品沉淀。防止上样样品沉淀。可以用于蛋白的制备（可维持空间结构可以用于蛋白的制备（可维持空间结构及生物活性）及生物活性）。疏水相互作用色谱与反相色谱疏水相互作用色谱与反相色谱两者均基于疏水介质与蛋白疏水局域的相互作用两者均基于疏水介质与蛋白疏水局域的相互作用.在在HICHIC中蛋白在高盐下加样中蛋白在高盐下加样,蛋白利用较温和的疏水表面来蛋白利用较温和的疏水表面来进行与介质的相互作用进行与介质的相互作用,常用降低盐梯度来洗脱蛋白常用降低盐梯度来洗脱蛋白在在RPCRPC中蛋白在水环境下加样中蛋白在水环境下加样,蛋白与疏水性介质进行相蛋白与疏水性介质进行相互作用互作用,常用增加的有机溶剂浓度来洗脱蛋白常用增加的有机溶剂浓度来洗脱蛋白两者的分辨率都较高两者的分辨率都较高,RP-HPLCRP-HPLC最常用来在蛋白纯化的最最常用来在蛋白纯化的最后一步后一步.HIC and RPCPurification development-summaryBefore you start Develop assay methods Set the aims(purity and quantity)Characterize the target protein Determine the sample stability windowProtocol development checklist Select techniques and conditions compatible with sample stability.Remove proteases at an early stage.Reduce volume in early steps.Use combinations of different separation principles.Start with high selectivity increase efficiency.Use few steps.Limit sample handling between purification steps.The capture(C)step aims at concentrating the sample and removing the bulk of the contaminants.speed and load capacityThe intermediate purification(iP)step(s)aims at separating the components of the now concentrated partially purified sample maximum resolution The polishing(P)step(s)serves to achieve the final purity and to eliminate contaminants such as polymers etc.and is also often used to condition the final product,e.g.to remove salts.Start conditions and end conditions for commonly used chromatography techniques Suitability ranking of chromatography techniques with respect to the three-phase strategy