蛋白质的修饰和表达03课件

第三章第三章 蛋白质的修饰和表达蛋白质的修饰和表达7/21/20247/21/20241 1主要内容主要内容第一节第一节 蛋白质修饰的化学途径蛋白质修饰的化学途径(P88-94(P88-94 自学自学)第二节第二节 蛋白质改造的分子生物学途径蛋白质改造的分子生物学途径第三节第三节 重组蛋白质的表达重组蛋白质的表达7/21/20247/21/20242 2 第二节第二节 蛋白质改造的分子生物学途径蛋白质改造的分子生物学途径基因突变技术基因突变技术是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造，在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。改造，在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。分类：分类：位点特异性突变位点特异性突变基因突变技术基因突变技术（按特点划分）（按特点划分）随机突变随机突变 7/21/20247/21/20243 3 1)1)通过寡核苷酸介导的基因突变通过寡核苷酸介导的基因突变位点特异性突变位点特异性突变 2)2)盒式突变或片段取代突变盒式突变或片段取代突变 3)3)以双链以双链DNADNA为模板，利用为模板，利用PCRPCR 技术进行的基因突变技术进行的基因突变可以这样说，可以这样说，PCRPCR技术的出现为基因的突变，技术的出现为基因的突变，基因的剪接开辟了一条极其有效、极其快捷基因的剪接开辟了一条极其有效、极其快捷的道路的道路。当然无论哪种方法都可以在为蛋白。当然无论哪种方法都可以在为蛋白质编码的基因序列上产生质编码的基因序列上产生插入、缺失、取代插入、缺失、取代等突变。等突变。7/21/20247/21/20244 4 1 1编码基因的专一性位点突变编码基因的专一性位点突变 定义定义：专一性位点突变又称特异性位点突变。这：专一性位点突变又称特异性位点突变。这类突变都是在含有突变序列的寡核苷引物介导下类突变都是在含有突变序列的寡核苷引物介导下进行的，因此又称为进行的，因此又称为寡核苷酸介导的位点特异性寡核苷酸介导的位点特异性突变突变。这种突变的方法从问世至今不断更新，特。这种突变的方法从问世至今不断更新，特别是别是PCRPCR技术出现后变得更高效。技术出现后变得更高效。(1)(1)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素 (2)(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法几种寡核苷酸介导的基因突变方法 7/21/20247/21/20245 5(1)(1)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素DNADNA模板的制备模板的制备 对于单链对于单链对于单链对于单链DNADNADNADNA模板一定要高纯度，即使少量模板一定要高纯度，即使少量模板一定要高纯度，即使少量模板一定要高纯度，即使少量的的的的RNARNARNARNA分子都会影响突变的特异性分子都会影响突变的特异性分子都会影响突变的特异性分子都会影响突变的特异性。双链双链DNADNA：一般制备一般制备DNADNA质粒质粒 的方法均可的方法均可单链单链DNADNA：通过通过M13M13噬菌体噬菌体或或 噬菌粒来制备噬菌粒来制备7/21/20247/21/20246 6 核甘酸突变引物的设计和选择核甘酸突变引物的设计和选择a.a.必须与模板链上的目标必须与模板链上的目标DNADNA序列有必要的序列有必要的互补区互补区b.b.足够长，以便与目标足够长，以便与目标DNADNA序列退火序列退火c.c.突变引物应尽可能避免形成稳定的二级结突变引物应尽可能避免形成稳定的二级结构的回文序列、重复序列或自身互补序列构的回文序列、重复序列或自身互补序列d.d.突变引物要特异，不能与目标突变引物要特异，不能与目标DNADNA中突变中突变位置以外的位置以外的DNADNA形成非特异性的杂交混合形成非特异性的杂交混合体体7/21/20247/21/20247 7例子例子：将：将NCBINCBI数据库中的数据库中的MADSMADS基因编码蛋白质基因编码蛋白质的的“KKACSDSSA”KKACSDSSA”中的中的C C（CysCys）定点突变为）定点突变为A A（ArgArg）。）。7/21/20247/21/20248 87/21/20247/21/20249 97/21/20247/21/202410107/21/20247/21/202411117/21/20247/21/20241212核甘酸突变引物与模板核甘酸突变引物与模板核甘酸突变引物与模板核甘酸突变引物与模板DNADNADNADNA的退火和引物延伸条件的退火和引物延伸条件的退火和引物延伸条件的退火和引物延伸条件对于突变引物与模板对于突变引物与模板对于突变引物与模板对于突变引物与模板DNADNADNADNA的比率的比率的比率的比率 一般是双引物与模板之间的摩尔比在一般是双引物与模板之间的摩尔比在一般是双引物与模板之间的摩尔比在一般是双引物与模板之间的摩尔比在1010101050505050：1 1 1 1之之之之间。间。间。间。退火保证引物与模板形成稳定的杂交体。退火保证引物与模板形成稳定的杂交体。退火保证引物与模板形成稳定的杂交体。退火保证引物与模板形成稳定的杂交体。原则：退火温度为理论预测的原则：退火温度为理论预测的原则：退火温度为理论预测的原则：退火温度为理论预测的TmTmTmTm值以上值以上值以上值以上20202020，然，然，然，然后再慢慢冷却至较低温度，形成双链。后再慢慢冷却至较低温度，形成双链。后再慢慢冷却至较低温度，形成双链。后再慢慢冷却至较低温度，形成双链。引物延伸引物延伸引物延伸引物延伸 加入延伸所需的加入延伸所需的加入延伸所需的加入延伸所需的dNTPdNTPdNTPdNTP、ATPATPATPATP、DNADNADNADNA聚合酶、聚合酶、聚合酶、聚合酶、DNADNADNADNA连接连接连接连接酶等。在适当温度下进行酶等。在适当温度下进行酶等。在适当温度下进行酶等。在适当温度下进行215h215h215h215h的连接。的连接。的连接。的连接。7/21/20247/21/20241313DNADNA聚合酶的选择聚合酶的选择T4DNA聚合酶聚合酶T7DNA聚合酶聚合酶Klenow酶酶 在单引物的延伸反应中，避免使用不当在单引物的延伸反应中，避免使用不当的酶引起引物置换，导致突变效率降低。的酶引起引物置换，导致突变效率降低。7/21/20247/21/20241414dNTPdNTPdNTPdNTP（脱氧核苷三磷酸）对立体（脱氧核苷三磷酸）对立体（脱氧核苷三磷酸）对立体（脱氧核苷三磷酸）对立体DNADNADNADNA合成的影响合成的影响合成的影响合成的影响dNTP纯度要高纯度要高 dCTPdCTP氧化脱氨可以产生微量氧化脱氨可以产生微量氧化脱氨可以产生微量氧化脱氨可以产生微量dUTPdUTP，当多核，当多核，当多核，当多核苷酸中搀入苷酸中搀入苷酸中搀入苷酸中搀入UMPUMP时，受体菌中的尿嘧啶时，受体菌中的尿嘧啶时，受体菌中的尿嘧啶时，受体菌中的尿嘧啶-N-N-糖基糖基糖基糖基化酶可在化酶可在化酶可在化酶可在U U的位置切断的位置切断的位置切断的位置切断DNADNA链，而细胞内的链，而细胞内的链，而细胞内的链，而细胞内的DNADNA聚合酶能够产生切口平移，从而降低突变体的产聚合酶能够产生切口平移，从而降低突变体的产聚合酶能够产生切口平移，从而降低突变体的产聚合酶能够产生切口平移，从而降低突变体的产率。率。率。率。7/21/20247/21/20241515受体细胞对突变体产率的影响受体细胞对突变体产率的影响大肠杆菌细胞内的几个错配修复系统大肠杆菌细胞内的几个错配修复系统 解决方案：采用错配修复系统缺失的系解决方案：采用错配修复系统缺失的系统菌株作为受体菌。统菌株作为受体菌。当用当用M13作为克隆载体时，作为克隆载体时，M13可能会出现可能会出现不对称复制，如果突变链复制率较低就影不对称复制，如果突变链复制率较低就影响试验结果响试验结果7/21/20247/21/20241616 (2)(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法几种寡核苷酸介导的基因突变方法 Kunkel Kunkel 突变法突变法 基于抗生素抗性基于抗生素抗性“回复回复”的突变方法的突变方法 基于去除特定限制酶切位点的突变基于去除特定限制酶切位点的突变 利用聚合酶链反应利用聚合酶链反应(PCR)(PCR)产生定点突变产生定点突变7/21/20247/21/20241717 Kunkel Kunkel 突变法突变法1.1.KunkelKunkel 1985 1985年建立的方法：年建立的方法：年建立的方法：年建立的方法：7/21/20247/21/20241818具体步骤：具体步骤：具体步骤：具体步骤：将待突变的基因克隆入将待突变的基因克隆入将待突变的基因克隆入将待突变的基因克隆入M13 DNAM13 DNA载载载载体上，导入具有体上，导入具有体上，导入具有体上，导入具有dUTPdUTP酶（酶（酶（酶（dutdut）和）和）和）和N-N-尿嘧啶脱糖苷酶（尿嘧啶脱糖苷酶（尿嘧啶脱糖苷酶（尿嘧啶脱糖苷酶（ungung）双缺陷的）双缺陷的）双缺陷的）双缺陷的大肠杆菌（大肠杆菌（大肠杆菌（大肠杆菌（dutdut-，ungung-）菌株）菌株）菌株）菌株中。中。中。中。DutDut缺陷缺陷缺陷缺陷导致细胞内导致细胞内导致细胞内导致细胞内dUTPdUTP水平上升水平上升水平上升水平上升，并在并在并在并在DNADNA复制时，部分取代复制时，部分取代复制时，部分取代复制时，部分取代dTTPdTTP进进进进入入入入DNADNA新生链中。又由于新生链中。又由于新生链中。又由于新生链中。又由于ungung缺陷缺陷缺陷缺陷使掺入使掺入使掺入使掺入DNADNA的的的的dUTPdUTP残基不能除去残基不能除去残基不能除去残基不能除去。由这种大肠杆菌菌株产生的由这种大肠杆菌菌株产生的由这种大肠杆菌菌株产生的由这种大肠杆菌菌株产生的M13M13单单单单链链链链DNADNA大约有大约有大约有大约有1%1%的的的的T T被被被被U U所取代所取代所取代所取代，然后进行然后进行然后进行然后进行DNADNA定点突变。定点突变。定点突变。定点突变。双链双链双链双链DNADNA导入正常的大肠杆菌中，导入正常的大肠杆菌中，导入正常的大肠杆菌中，导入正常的大肠杆菌中，其尿嘧啶其尿嘧啶其尿嘧啶其尿嘧啶N-N-糖基化酶除去糖基化酶除去糖基化酶除去糖基化酶除去DNADNA链上链上链上链上的尿嘧啶碱基。的尿嘧啶碱基。的尿嘧啶碱基。的尿嘧啶碱基。结果原来的结果原来的结果原来的结果原来的M13M13模板链被降解，只模板链被降解，只模板链被降解，只模板链被降解，只有突变链因不含有突变链因不含有突变链因不含有突变链因不含U U，被保留下来。，被保留下来。，被保留下来。，被保留下来。这种方法产生的这种方法产生的这种方法产生的这种方法产生的M13M13噬菌体中含有噬菌体中含有噬菌体中含有噬菌体中含有突变突变突变突变DNADNA的比例大大增加。的比例大大增加。的比例大大增加。的比例大大增加。7/21/20247/21/20241919 基于抗生素抗性基于抗生素抗性“回复回复”的突变方法的突变方法7/21/20247/21/20242020 基于去除特定限制酶切位点的突变基于去除特定限制酶切位点的突变7/21/20247/21/202421217/21/20247/21/20242222 利用聚合酶链反应利用聚合酶链反应(PCR)(PCR)产生产生定点突变定点突变 5端或端或3端区产生突变端区产生突变直接直接PCR 中心区突变中心区突变重叠延伸（重叠延伸（overlap extension）新概念新概念：Gene SOEing:即通过重叠延伸进行剪接即通过重叠延伸进行剪接（splicing by overlap extension）,也就是说通过重组也就是说通过重组延伸方法将不同的基因进行剪接和组合在一起延伸方法将不同的基因进行剪接和组合在一起。7/21/20247/21/20242323DNADNA片片段段的的剪剪切切7/21/20247/21/20242424取代突变取代突变7/21/20247/21/20242525插入突变插入突变7/21/20247/21/20242626缺失突变缺失突变7/21/20247/21/20242727 2 2区域性定向突变区域性定向突变 基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变，也基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变，也可以产生区域性的突变。可以产生区域性的突变。常用的方法如盒式突变法常用的方法如盒式突变法(cassette mutagenesis)(cassette mutagenesis)，又称又称片段取代法片段取代法(DNA fragment replacement)(DNA fragment replacement)。这一方法的要点是利用目标基因中所具有的适当的限制性这一方法的要点是利用目标基因中所具有的适当的限制性内切酶位点，用具有任何长度、任何序列内切酶位点，用具有任何长度、任何序列(或任何混合序或任何混合序列列)的的DNADNA片段来置换或取代目标基因上的一段片段来置换或取代目标基因上的一段DNADNA序列。序列。7/21/20247/21/20242828研究目的研究目的 通过改变几个氨基酸序列来研究蛋白质的结构通过改变几个氨基酸序列来研究蛋白质的结构-功能功能之间的关系，也可以通过盒式突变法产生嵌合蛋白质。在之间的关系，也可以通过盒式突变法产生嵌合蛋白质。在这个嵌合蛋白质中，蛋白质分子中的整个结构域都可以用这个嵌合蛋白质中，蛋白质分子中的整个结构域都可以用完全不同的氨基酸序列来置换。完全不同的氨基酸序列来置换。盒式突变盒式突变最主要的用途是产生各种特异性的突变或突最主要的用途是产生各种特异性的突变或突变家族，在这些突变体中各种不同的序列被集中在目标基变家族，在这些突变体中各种不同的序列被集中在目标基因的一个特定区域，从而为研究蛋白质特定结构区段或特因的一个特定区域，从而为研究蛋白质特定结构区段或特定结构域的结构和功能提供了一个切实可行的方法。定结构域的结构和功能提供了一个切实可行的方法。7/21/20247/21/20242929二、基因融合和基因剪接二、基因融合和基因剪接1 1利用基因融合技术表达外源基因的缘由利用基因融合技术表达外源基因的缘由2 2基因融合的策略与蛋白质分子嵌合体基因融合的策略与蛋白质分子嵌合体3 3蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接7/21/20247/21/202430301 1利用基因融合技术表达外源基因利用基因融合技术表达外源基因的缘由的缘由外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解通过与特异蛋白质或特异的结构域形成融合蛋白，利于快通过与特异蛋白质或特异的结构域形成融合蛋白，利于快通过与特异蛋白质或特异的结构域形成融合蛋白，利于快通过与特异蛋白质或特异的结构域形成融合蛋白，利于快速回收、纯化速回收、纯化速回收、纯化速回收、纯化融合蛋白可以体外切割去除融合部分，可以获得天然蛋白融合蛋白可以体外切割去除融合部分，可以获得天然蛋白融合蛋白可以体外切割去除融合部分，可以获得天然蛋白融合蛋白可以体外切割去除融合部分，可以获得天然蛋白通过与特定的蛋白质形成融合蛋白，可以避免外源蛋白在通过与特定的蛋白质形成融合蛋白，可以避免外源蛋白在通过与特定的蛋白质形成融合蛋白，可以避免外源蛋白在通过与特定的蛋白质形成融合蛋白，可以避免外源蛋白在细胞内形成包涵体细胞内形成包涵体细胞内形成包涵体细胞内形成包涵体基因融合是对基因进行改造的手段，广泛用于蛋白质结构基因融合是对基因进行改造的手段，广泛用于蛋白质结构基因融合是对基因进行改造的手段，广泛用于蛋白质结构基因融合是对基因进行改造的手段，广泛用于蛋白质结构功能的研究功能的研究功能的研究功能的研究7/21/20247/21/202431312 21 1 基因融合的策略基因融合的策略将重组基因直接剪接于适当的信号肽之后将重组基因直接剪接于适当的信号肽之后将外源基因本身按阅读框架自我融合。对将外源基因本身按阅读框架自我融合。对一些小肽的稳定表达、表达产物的活性非一些小肽的稳定表达、表达产物的活性非常重要常重要目标蛋白在与其融合的蛋白伙伴序列的目标蛋白在与其融合的蛋白伙伴序列的C C端或端或N N端融合端融合7/21/20247/21/20243232分泌亲和融合。即：信号肽融合蛋白目标基因分泌亲和融合。即：信号肽融合蛋白目标基因分泌亲和融合。即：信号肽融合蛋白目标基因分泌亲和融合。即：信号肽融合蛋白目标基因双亲和融合法。即将目标基因与两个不同配基有特异亲双亲和融合法。即将目标基因与两个不同配基有特异亲双亲和融合法。即将目标基因与两个不同配基有特异亲双亲和融合法。即将目标基因与两个不同配基有特异亲和的异源或载体蛋白融合和的异源或载体蛋白融合和的异源或载体蛋白融合和的异源或载体蛋白融合分泌插入融合法。此法是将目标基因插入到信号肽序分泌插入融合法。此法是将目标基因插入到信号肽序分泌插入融合法。此法是将目标基因插入到信号肽序分泌插入融合法。此法是将目标基因插入到信号肽序列和一插入序列之间，此插入序列是一种插入到细胞膜列和一插入序列之间，此插入序列是一种插入到细胞膜列和一插入序列之间，此插入序列是一种插入到细胞膜列和一插入序列之间，此插入序列是一种插入到细胞膜或细胞壁的蛋白编码或细胞壁的蛋白编码或细胞壁的蛋白编码或细胞壁的蛋白编码 设计目的：用以将受体或抗原定位于细胞的外表面设计目的：用以将受体或抗原定位于细胞的外表面设计目的：用以将受体或抗原定位于细胞的外表面设计目的：用以将受体或抗原定位于细胞的外表面或装配成融合蛋白进入类病毒颗粒，利于开发疫苗，或或装配成融合蛋白进入类病毒颗粒，利于开发疫苗，或或装配成融合蛋白进入类病毒颗粒，利于开发疫苗，或或装配成融合蛋白进入类病毒颗粒，利于开发疫苗，或产生具有免疫原的复合物产生具有免疫原的复合物产生具有免疫原的复合物产生具有免疫原的复合物21 基因融合的策略基因融合的策略7/21/20247/21/202433332.2 产生蛋白质分子嵌合体的策略产生蛋白质分子嵌合体的策略通过限制性内切酶位点连接通过限制性内切酶位点连接通过限制性内切酶位点连接通过限制性内切酶位点连接 条件：两个蛋白质之间有相同的限制性内切酶位条件：两个蛋白质之间有相同的限制性内切酶位条件：两个蛋白质之间有相同的限制性内切酶位条件：两个蛋白质之间有相同的限制性内切酶位点点点点通过缺失突变的方法连接通过缺失突变的方法连接通过缺失突变的方法连接通过缺失突变的方法连接 条件：两个蛋白质之间有相同的额外的碱基序列条件：两个蛋白质之间有相同的额外的碱基序列条件：两个蛋白质之间有相同的额外的碱基序列条件：两个蛋白质之间有相同的额外的碱基序列通过通过通过通过PCRPCR双侧重叠延伸法双侧重叠延伸法双侧重叠延伸法双侧重叠延伸法 该法可以在不需要分子间具有相容的限制性内切该法可以在不需要分子间具有相容的限制性内切该法可以在不需要分子间具有相容的限制性内切该法可以在不需要分子间具有相容的限制性内切酶位点，将两个编码不同蛋白质的酶位点，将两个编码不同蛋白质的酶位点，将两个编码不同蛋白质的酶位点，将两个编码不同蛋白质的DNADNA分子重组，分子重组，分子重组，分子重组，形成形成形成形成DNADNA分子嵌合体分子嵌合体分子嵌合体分子嵌合体7/21/20247/21/202434347/21/20247/21/202435353 3蛋白质内含子介导的蛋白质分子蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接间的连接n1990年年Saccharomydes cerevisiae发现在腺苷三磷酸核发现在腺苷三磷酸核苷酸酶中蛋白质会发生自我剪苷酸酶中蛋白质会发生自我剪接（接（protein splicing），从而），从而首次发现第一个蛋白质内含子首次发现第一个蛋白质内含子Sce VMA n蛋白质内含子蛋白质内含子(intein)是蛋是蛋白质中的一段多肽链白质中的一段多肽链,它靠自它靠自我剪切的方式从前体蛋白中分我剪切的方式从前体蛋白中分离出来离出来,而两端的外显子以肽而两端的外显子以肽键的方式相连键的方式相连 7/21/20247/21/20243636基因融合的用途基因融合的用途上述这些基因融合策略，主要是有利于：上述这些基因融合策略，主要是有利于：外源基因的表达外源基因的表达表达产物的分离表达产物的分离纯化以及细胞定位纯化以及细胞定位 作为蛋白质分子改造可以借用这些策略对蛋白作为蛋白质分子改造可以借用这些策略对蛋白质分子中的特定序列、结构元件乃至结构域通过基质分子中的特定序列、结构元件乃至结构域通过基因剪接来进行操作。因剪接来进行操作。7/21/20247/21/20243737 第三节第三节 重组蛋白质的表达重组蛋白质的表达重组蛋白质在大肠杆菌中的表达重组蛋白质在大肠杆菌中的表达重组蛋白质在酵母细胞中的表达重组蛋白质在酵母细胞中的表达重组蛋白质在哺乳类动物细胞中的表达重组蛋白质在哺乳类动物细胞中的表达7/21/20247/21/20243838 一、大肠杆菌中表达体系的优点一、大肠杆菌中表达体系的优点大肠杆菌大肠杆菌(E.coli)表达体系是目前应用最广的表达体系是目前应用最广的一个外源基因表达体系，是外源基因表达的首一个外源基因表达体系，是外源基因表达的首选体系。选体系。利用大肠杆菌作为表达体系的优点：利用大肠杆菌作为表达体系的优点：1）遗传学和生理学背景清楚遗传学和生理学背景清楚；2）容易培养，特别是高密度发酵容易培养，特别是高密度发酵；3）外源基因经常可以达到高效表达外源基因经常可以达到高效表达。7/21/20247/21/20243939大肠杆菌表达体系的缺点大肠杆菌表达体系的缺点大肠杆菌系统最大的不足之处是：大肠杆菌系统最大的不足之处是：（1）不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰，如糖基化、，如糖基化、烷基化、磷酸化、特异性的蛋白水解加工等；烷基化、磷酸化、特异性的蛋白水解加工等；（2）广泛二硫键的形成以及外源蛋白质组装成多亚基复合体的能力广泛二硫键的形成以及外源蛋白质组装成多亚基复合体的能力也受到限制也受到限制。（3）外源基因产物在大肠杆菌细胞内易形成不溶性的包涵体外源基因产物在大肠杆菌细胞内易形成不溶性的包涵体；（4）而当真核基因在大肠杆菌中表达时，作为起始氨基酸，甲硫氨而当真核基因在大肠杆菌中表达时，作为起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋白质的酸常依然保留在蛋白质的N末端末端。最后，由于真核最后，由于真核mRNA的结构特性以及密码子使用频率与大肠杆菌本的结构特性以及密码子使用频率与大肠杆菌本身的差异，当用真核身的差异，当用真核mRNA的序列直接在大肠杆菌细胞中表达时，的序列直接在大肠杆菌细胞中表达时，（5）有时不能得到足够的产物有时不能得到足够的产物。7/21/20247/21/20244040大肠杆菌表达体系的应用大肠杆菌表达体系的应用 当外源蛋白质的当外源蛋白质的分子量小于分子量小于70kD,不存在半胱不存在半胱氨酸氨酸或或分子内的二硫键少于分子内的二硫键少于34个个，以及，以及不需要不需要翻译后修饰翻译后修饰而能保持其生物活性的蛋白质，大多而能保持其生物活性的蛋白质，大多可以利用大肠杆菌系统得到满意的结果。可以利用大肠杆菌系统得到满意的结果。7/21/20247/21/202441411表达载体的一般特点表达载体的一般特点(1)复制起始点复制起始点(2)选择性基因选择性基因(3)强的、可诱导的启动子强的、可诱导的启动子(4)强的转录终止序列强的转录终止序列(5)核糖体结合位点核糖体结合位点(6)合适的多克隆位点合适的多克隆位点7/21/20247/21/20244242(1)复制起始点复制起始点绝大多数载体利用绝大多数载体利用pBR322pBR322或或pUCpUC质粒来源的质粒来源的复制起始点（如，复制起始点（如，pET28pET28系列）系列）复制起始点决定了细胞内质粒的拷贝数复制起始点决定了细胞内质粒的拷贝数pBR322pBR322或或pUCpUC质粒来源的质粒可保持质粒来源的质粒可保持20205050个拷贝数和个拷贝数和150150200200个拷贝数个拷贝数7/21/20247/21/20244343(2)选择性基因选择性基因 载体上要含有至少一个选择性基因载体上要含有至少一个选择性基因作用：作用：1）保证对转化体的筛选）保证对转化体的筛选 2）保证在培养过程中受体细胞质粒）保证在培养过程中受体细胞质粒不丢失不丢失种类：种类：7/21/20247/21/20244444(3)(3)强的、可诱导的启动子强的、可诱导的启动子原核细胞的启动子包括了原核细胞的启动子包括了RNARNA聚合酶的识别聚合酶的识别位点和结合位点位点和结合位点启动子序列通常包含了启动子序列通常包含了1010区（区（TATAATTATAAT）和和3535区（区（TTGACATTGACA）常用的种类：常用的种类：LacUV5LacUV5、trptrp、tactac、trctrc以及以及T7T7启动子启动子RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点RNARNA聚合酶识别位点聚合酶识别位点7/21/20247/21/20244545(4)强的转录终止序列强的转录终止序列 为使目标基因有效的转录，需要满足两个为使目标基因有效的转录，需要满足两个条件：条件：转录终止序列转录终止序列抗转录终止序列抗转录终止序列 减少不必需的转录通减少不必需的转录通过复制起始位点，其作用过复制起始位点，其作用可以帮助稳定可以帮助稳定mRNA，增，增加加mRNA的半衰期的半衰期 保证目保证目标基因完标基因完全被转录全被转录7/21/20247/21/20244646(5)核糖体结合位点核糖体结合位点位置：位于启动子下游，翻译起始密码位置：位于启动子下游，翻译起始密码ATGATG的上游的上游核糖体结合位点核糖体结合位点SDSD序列，对原核细胞序列，对原核细胞mRNAmRNA翻译起始非常关键翻译起始非常关键7/21/20247/21/20244747(6)合适的多克隆位点合适的多克隆位点将目标基因插入到表达载体上将目标基因插入到表达载体上将目标基因插入到表达载体上将目标基因插入到表达载体上用于构建或改造载体用于构建或改造载体用于构建或改造载体用于构建或改造载体7/21/20247/21/202448482与外源基因有效表达的相关因素与外源基因有效表达的相关因素(1)有效的转录起始有效的转录起始(2)有效的翻译有效的翻译(3)蛋白质水解作用蛋白质水解作用(4)蛋白质的外泌蛋白质的外泌 7/21/20247/21/20244949(1)有效的转录起始有效的转录起始转录起始的速率是基转录起始的速率是基转录起始的速率是基转录起始的速率是基因表达的主要限速步因表达的主要限速步因表达的主要限速步因表达的主要限速步骤骤骤骤高效表达的载体包含：高效表达的载体包含：高效表达的载体包含：高效表达的载体包含：1 1 1 1）启动子的强弱）启动子的强弱）启动子的强弱）启动子的强弱 2 2 2 2）调控序列）调控序列）调控序列）调控序列7/21/20247/21/20245050(2)有效的翻译有效的翻译mRNAmRNA的稳定性的稳定性翻译起始的频率翻译起始的频率肽链延伸肽链延伸 和终止的速率和终止的速率翻译的忠实性翻译的忠实性mRNAmRNA转录速率越高转录速率越高mRNAmRNA降解速率越低降解速率越低高高核糖体结合位点（核糖体结合位点（SDSD序列）序列）SDSD序列与起始密码之间的距离序列与起始密码之间的距离起始密码上游区的序列起始密码上游区的序列SDSD序列与可翻译序列序列与可翻译序列55端形成的二级结构端形成的二级结构遗传密码的使用（高频或低遗传密码的使用（高频或低频）等频）等多加入终止密码子（串联终多加入终止密码子（串联终止子）止子）错误氨基酸的搀入错误氨基酸的搀入7/21/20247/21/20245151(3)蛋白质水解作用蛋白质水解作用合成后的蛋白质在各种蛋白酶和肽酶作用下加工合成后的蛋白质在各种蛋白酶和肽酶作用下加工合成后的蛋白质在各种蛋白酶和肽酶作用下加工合成后的蛋白质在各种蛋白酶和肽酶作用下加工特异蛋白水解加工：主要有两种类型，一类是特异蛋白水解加工：主要有两种类型，一类是特异蛋白水解加工：主要有两种类型，一类是特异蛋白水解加工：主要有两种类型，一类是信信信信号肽酶号肽酶号肽酶号肽酶I I I I（LepLepLepLep）或）或）或）或信号肽酶信号肽酶信号肽酶信号肽酶IIIIIIII（LspLspLspLsp）将分泌（或）将分泌（或）将分泌（或）将分泌（或外运）蛋白质上的信号肽切除；一类是对存在于外运）蛋白质上的信号肽切除；一类是对存在于外运）蛋白质上的信号肽切除；一类是对存在于外运）蛋白质上的信号肽切除；一类是对存在于N N N N末端的末端的末端的末端的甲硫氨酸进行加工甲硫氨酸进行加工甲硫氨酸进行加工甲硫氨酸进行加工蛋白质的降解蛋白质的降解蛋白质的降解蛋白质的降解 大肠杆菌内不同的蛋白水解酶和大肠杆菌内不同的蛋白水解酶和大肠杆菌内不同的蛋白水解酶和大肠杆菌内不同的蛋白水解酶和肽酶肽酶肽酶肽酶7/21/20247/21/20245252(4)蛋白质的外泌蛋白质的外泌外源蛋白质与细菌细胞的外泌系统相容，可以穿过细胞质外源蛋白质与细菌细胞的外泌系统相容，可以穿过细胞质外源蛋白质与细菌细胞的外泌系统相容，可以穿过细胞质外源蛋白质与细菌细胞的外泌系统相容，可以穿过细胞质膜进入周质，这一过程称为外泌（膜进入周质，这一过程称为外泌（膜进入周质，这一过程称为外泌（膜进入周质，这一过程称为外泌（exportexport）分泌（分泌（分泌（分泌（secretionsecretion）是指蛋白产物被外运到细胞之外）是指蛋白产物被外运到细胞之外）是指蛋白产物被外运到细胞之外）是指蛋白产物被外运到细胞之外蛋白质外泌的优点：蛋白质外泌的优点：蛋白质外泌的优点：蛋白质外泌的优点：格兰氏阴性菌的格兰氏阴性菌的格兰氏阴性菌的格兰氏阴性菌的周质中周质中周质中周质中的内环境比细胞周质内的内环境比细胞周质内的内环境比细胞周质内的内环境比细胞周质内氧化性要强氧化性要强氧化性要强氧化性要强，利于含二硫键蛋白质的正确折叠利于含二硫键蛋白质的正确折叠利于含二硫键蛋白质的正确折叠利于含二硫键蛋白质的正确折叠从细胞质中外运到周质中从细胞质中外运到周质中从细胞质中外运到周质中从细胞质中外运到周质中克服了毒性蛋白质对细胞的损害克服了毒性蛋白质对细胞的损害克服了毒性蛋白质对细胞的损害克服了毒性蛋白质对细胞的损害，如水解酶和如水解酶和如水解酶和如水解酶和DNADNA结合蛋白结合蛋白结合蛋白结合蛋白通过信号肽酶加工，使外源蛋白有正确的通过信号肽酶加工，使外源蛋白有正确的通过信号肽酶加工，使外源蛋白有正确的通过信号肽酶加工，使外源蛋白有正确的N N端端端端蛋白的外泌，特别是分泌到培养基中，便于纯化蛋白的外泌，特别是分泌到培养基中，便于纯化蛋白的外泌，特别是分泌到培养基中，便于纯化蛋白的外泌，特别是分泌到培养基中，便于纯化7/21/20247/21/20245353 3改善表达水平的方法改善表达水平的方法 诱导条件诱导条件外源基因的编码序列外源基因的编码序列用蛋白酶缺失的宿主菌用蛋白酶缺失的宿主菌7/21/20247/21/20245454诱导条件诱导条件诱导时间（常用）诱导时间（常用）诱导时间（常用）诱导时间（常用）诱导温度（常用）诱导温度（常用）诱导温度（常用）诱导温度（常用）培养基组成培养基组成培养基组成培养基组成7/21/20247/21/20245555外源基因的编码序列外源基因的编码序列1.1.利用密码简并原理，改变编码区的核甘酸序列而利用密码简并原理，改变编码区的核甘酸序列而利用密码简并原理，改变编码区的核甘酸序列而利用密码简并原理，改变编码区的核甘酸序列而不改变氨基酸序列，使目标基因的前几个密码子不改变氨基酸序列，使目标基因的前几个密码子不改变氨基酸序列，使目标基因的前几个密码子不改变氨基酸序列，使目标基因的前几个密码子中的中的中的中的G/CG/C变为变为变为变为A/TA/T2.2.用优先使用的密码子代替罕用密码子用优先使用的密码子代替罕用密码子用优先使用的密码子代替罕用密码子用优先使用的密码子代替罕用密码子3.3.通过改变核甘酸序列减少翻译起始区通过改变核甘酸序列减少翻译起始区通过改变核甘酸序列减少翻译起始区通过改变核甘酸序列减少翻译起始区mRNAmRNA的二的二的二的二级结构级结构级结构级结构4.4.利用高表达识别罕用密码的利用高表达识别罕用密码的利用高表达识别罕用密码的利用高表达识别罕用密码的tRNAtRNA质粒质粒质粒质粒5.5.尽量避免使用那些可能引起翻译问题的密码子尽量避免使用那些可能引起翻译问题的密码子尽量避免使用那些可能引起翻译问题的密码子尽量避免使用那些可能引起翻译问题的密码子7/21/20247/21/20245656用蛋白酶缺失的宿主菌用蛋白酶缺失的宿主菌避免细胞内的蛋白酶分解产生的蛋白质避免细胞内的蛋白酶分解产生的蛋白质7/21/20247/21/202457574.改善外源蛋白溶解性的方法改善外源蛋白溶解性的方法 外源蛋白的分泌表达外源蛋白的分泌表达 细菌生长温度细菌生长温度 外源蛋白与分子伴侣和折叠酶共表达外源蛋白与分子伴侣和折叠酶共表达 外源蛋白与相关蛋白或蛋白标签融合外源蛋白与相关蛋白或蛋白标签融合7/21/20247/21/20245858 三、重组蛋白质在哺乳动物细胞中的表达三、重组蛋白质在哺乳动物细胞中的表达 1选择哺乳动物细胞表达体系的优点选择哺乳动物细胞表达体系的优点2两个主要的哺乳动物细胞表达系统两个主要的哺乳动物细胞表达系统7/21/20247/21/202459591哺乳动物细胞表达体系的优点哺乳动物细胞表达体系的优点哺乳动物细胞表达体系的种类和数目已经发展很快。哺乳动物细胞表达体系的种类和数目已经发展很快。哺乳动物细胞表达体系有很多其他体系不能与之相比的优哺乳动物细胞表达体系有很多其他体系不能与之相比的优势。它具有势。它具有复杂的翻译后加工系统复杂的翻译后加工系统，糖基化糖基化以及以及二硫键在二硫键在合成和分泌过程中自然而然的正确形成合成和分泌过程中自然而然的正确形成。哺乳动物细胞具哺乳动物细胞具有产生正确折叠和完全生物活性的蛋白质有产生正确折叠和完全生物活性的蛋白质。实例：组织血纤维蛋白溶酶原激活因子实例：组织血纤维蛋白溶酶原激活因子(tPA)、红细胞生红细胞生成素成素(EPO)、人、人DNA酶。在大肠杆菌中表达酶。在大肠杆菌中表达tPA时，产生错时，产生错折叠和非糖基化，而在酵母中表达折叠和非糖基化，而在酵母中表达tPA产生过糖基化，二产生过糖基化，二者的产物都没有生物活性。者的产物都没有生物活性。7/21/20247/21/20246060分泌型哺乳动物细胞表达系统分泌型哺乳动物细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统可以通过设计，使外源重组蛋白直哺乳动物细胞表达系统可以通过设计，使外源重组蛋白直接分泌到培养基中。接分泌到培养基中。这个重组表达单位包括这个重组表达单位包括N末端的信号肽，其作用使起始新末端的信号肽，其作用使起始新生肽链插入到内织网中，此信号肽在分泌过程中被切除，生肽链插入到内织网中，此信号肽在分泌过程中被切除，从而产生具正确从而产生具正确N端的重组蛋白质。端的重组蛋白质。从内织网到高尔基体再到细胞外空间的分泌过程产生糖基从内织网到高尔基体再到细胞外空间的分泌过程产生糖基化和防止蛋白被胞内蛋白酶水解。化和防止蛋白被胞内蛋白酶水解。分泌过程也使蛋白质二硫键正确配对和正确折叠。分泌过程也使蛋白质二硫键正确配对和正确折叠。7/21/20247/21/20246161哺乳类动物细胞表达体系的另一个用处哺乳类动物细胞表达体系的另一个用处 是在天然环境条件下，研究工程化基因产物的性质是在天然环境条件下，研究工程化基因产物的性质。如将胰岛素受体基因经突变后，再导入到特定细胞中表达如将胰岛素受体基因经突变后，再导入到特定细胞中表达发现，在受体蛋白质上单一氨基酸的突变可导致其对胰岛发现，在受体蛋白质上单一氨基酸的突变可导致其对胰岛素结合活性的丧失，并导致激活自磷酸化和酪氨酸激酶。素结合活性的丧失，并导致激活自磷酸化和酪氨酸激酶。7/21/20247/21/20246262 2两个主要的哺乳动物细胞表达系统两个主要的哺乳动物细胞表达系统在哺乳动物细胞中有两个基因表达系统可供选择，一是在哺乳动物细胞中有两个基因表达系统可供选择，一是瞬瞬时表达系统时表达系统，一是，一是稳定表达系统稳定表达系统。瞬时基因表达系统瞬时基因表达系统是一个简单、有效的外源蛋白表达手段，是一个简单、有效的外源蛋白表达手段，其表达水平最高可以达到稳定细胞表达水平。蛋白质是由其表达水平最高可以达到稳定细胞表达水平。蛋白质是由未整合的、不复制的质粒未整合的、不复制的质粒DNA产生的，这样使得蛋白质表产生的，这样使得蛋白质表达的时间相对短，只有达的时间相对短，只有48h到到7天。天。稳定表达系统稳定表达系统需要得到稳定转化的细胞株，需要需要得到稳定转化的细胞株，需要12个月个月的时间，在稳定转化的细胞中，的时间，在稳定转化的细胞中，DNA被整合到染色体中，被整合到染色体中，这使得重组蛋白质产物可以一代接一代地产生。这使得重组蛋白质产物可以一代接一代地产生。7/21/20247/21/20246363其他表达系统其他表达系统原核表达系统原核表达系统酵母表达系统酵母表达系统哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统还有昆虫表达系统还有昆虫表达系统卵母细胞表达系统卵母细胞表达系统转录一翻译偶联的无细胞表达系统转录一翻译偶联的无细胞表达系统这些系统可根据具体需要来选择使用。这些系统可根据具体需要来选择使用。7/21/20247/21/20246464 M13M13噬菌体是一种单链噬菌体是一种单链DNADNA噬菌体，但它在感染宿主（大噬菌体，但它在感染宿主（大肠杆菌）后，在菌体细胞内复肠杆菌）后，在菌体细胞内复制成为双链并繁殖，又以单链制成为双链并繁殖，又以单链形式透出菌体，再度感染新的形式透出菌体，再度感染新的宿主菌。宿主菌。返回返回7/21/20247/21/20246565