蛋白质工程培训课件

本课内容本课内容(nirng)(nirng)蛋白质的产率问题蛋白质的产率问题(wnt)(wnt)蛋白质工程概要蛋白质工程概要蛋白质工程的应用实例蛋白质工程的应用实例第一页，共三十九页。在基因工程菌株中，影响外源蛋白质产率的因素包括在基因工程菌株中，影响外源蛋白质产率的因素包括载体相关因素和宿主相关的因素。载体相关因素和宿主相关的因素。与载体有关的因素主要有：与载体有关的因素主要有：表达载体拷贝数的调控表达载体拷贝数的调控启动子的强弱与转录调控启动子的强弱与转录调控转录终止子的效应转录终止子的效应(xioyng)(xioyng)密码子的使用频率密码子的使用频率信号肽的特征与分泌调控信号肽的特征与分泌调控影响产率的宿主因素主要有二：影响产率的宿主因素主要有二：mRNAmRNA的稳定性；的稳定性；宿宿主的蛋白质降解系统。主的蛋白质降解系统。第二页，共三十九页。通过调控通过调控(dio kn)(dio kn)基因拷贝数来提高外基因拷贝数来提高外源基因表达产量被称作源基因表达产量被称作基因的剂量基因的剂量效应效应，是一个对生产过程产生较大，是一个对生产过程产生较大影响的因素。影响的因素。在多数情况下可以理解为质粒拷贝在多数情况下可以理解为质粒拷贝数的多少，与数的多少，与oriori有关。在克隆实验有关。在克隆实验中常使用拷贝数中常使用拷贝数100100的多拷贝质粒。的多拷贝质粒。在以在以E.coliE.coli为宿主的生产中，常使用为宿主的生产中，常使用可以根据培养温度调整拷贝数的可以根据培养温度调整拷贝数的runawayrunaway质粒如质粒如pCP3pCP3，42 42 时拷贝时拷贝数最高可达几千个。数最高可达几千个。lacZampr复制起点复制起点ori第三页，共三十九页。启动子的强度是指一个启动子能够多启动子的强度是指一个启动子能够多大程度地结合大程度地结合RNARNA聚合酶并引发转录聚合酶并引发转录过程。过程。原核基因的启动子主要包括原核基因的启动子主要包括-35-35和和-10-10区，真核基因启动子那么区，真核基因启动子那么主要是主要是TATATATA盒与一些上游转录活盒与一些上游转录活化序列化序列UASUAS。这些序列被称作顺。这些序列被称作顺式作用元件式作用元件ciscis序列。序列。一般认为启动子的强度与一般认为启动子的强度与ciscis序列的序列的最正确配置相关，在人工构建强启动最正确配置相关，在人工构建强启动子时主要是尝试子时主要是尝试(chngsh)(chngsh)把不同基因的把不同基因的启动子的启动子的ciscis序列进行重组。序列进行重组。-35-10RNA 聚合酶原核基因启动子原核基因启动子UASTATARNA聚合酶真核基因启动子真核基因启动子第四页，共三十九页。根据根据(gnj)(gnj)表达的方式可以把启动子分为两类：表达的方式可以把启动子分为两类：构成性表达启动子：持续表达构成性表达启动子：持续表达诱导性表达启动子：只在诱导条件下表达。诱导性表达启动子：只在诱导条件下表达。宿主宿主启动子启动子构成性表达构成性表达诱导表达诱导表达大肠杆菌大肠杆菌E.coliE.colilac,tac,ara pBAD,lac,tac,ara pBAD,P PL L,T7 T7枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌蛋白酶、淀粉酶基因蛋白酶、淀粉酶基因的启动子的启动子酿酒酵母酿酒酵母S.S.cerevisiaecerevisiaeADH1ADH1，TDH3TDH3GAL1GAL1，PHO5PHO5毕赤酵母毕赤酵母P.pastorisP.pastorisGAPGAPAOXAOX第五页，共三十九页。强力启动子的优点是表达的蛋白质多，但是随着强力启动子的优点是表达的蛋白质多，但是随着mRNAmRNA和蛋和蛋白质的大量合成与积累，反而会阻碍细胞的生长白质的大量合成与积累，反而会阻碍细胞的生长(shngzhng)(shngzhng)，或激活宿主的蛋白质降解系统。，或激活宿主的蛋白质降解系统。这都会造成目的蛋白产量的下降。如果目的蛋白对宿主这都会造成目的蛋白产量的下降。如果目的蛋白对宿主细胞有毒性的话就更是如此。细胞有毒性的话就更是如此。因此在实际生产中，更多使用的是那些仅在需要时才因此在实际生产中，更多使用的是那些仅在需要时才进行强力表达的诱导性启动子。进行强力表达的诱导性启动子。E.coliE.coli的诱导表达系统几乎全部是利用的诱导表达系统几乎全部是利用E.coli E.coli 来源的各来源的各种操纵子中的启动子，如种操纵子中的启动子，如laclac启动子。启动子。第六页，共三十九页。E.coli E.coli 的乳糖的乳糖(r tn)(r tn)操纵子操纵子lac operonlac operon乳糖操纵子包含乳糖操纵子包含(bohn)(bohn)启动子启动子P Placlac、操纵、操纵基因基因O O和和3 3个结构基因个结构基因lacZlacZ：-半乳糖苷酶半乳糖苷酶lacYlacY：-半乳糖苷透性酶半乳糖苷透性酶lacAlacA：-半乳糖苷转乙酰酶半乳糖苷转乙酰酶操纵子上游的操纵子上游的lac I lac I 编码阻遏蛋白编码阻遏蛋白。lac Ylac Ylac Alac AO Olac Ilac Ilac Zlac ZP Placlac乳糖操纵子乳糖操纵子调节基因调节基因启动子启动子操纵操纵基因基因P P第七页，共三十九页。异乳糖异乳糖与阻遏蛋白结合，导致其构象变化，和与阻遏蛋白结合，导致其构象变化，和DNADNA的亲和性降低，不能与的亲和性降低，不能与操纵基因操纵基因O O结合，对结合，对P Placlac的阻遏的阻遏被解除，被解除，lac Zlac Z等基因等基因的转录得以进行的转录得以进行。IPTGIPTG：异乳糖的类似物，可作为：异乳糖的类似物，可作为laclac启动子的诱导启动子的诱导物，其好处是不会物，其好处是不会(b hu)(b hu)被降解，使启动子一直被降解，使启动子一直被诱导。被诱导。阻遏阻遏(z)(z)蛋白蛋白乳糖乳糖(r tn)(r tn),LactoseLactose转录转录lac Ylac Ylac Alac AO Olac Ilac Ilac Zlac ZP PlaclacP PIPTGIPTG异乳糖异乳糖第八页，共三十九页。从生产角度来说，不必要的长序列转录产物的生产会额外地从生产角度来说，不必要的长序列转录产物的生产会额外地消耗能量。消耗能量。当对特定基因进行强力表达时，转录可能会涉及该基当对特定基因进行强力表达时，转录可能会涉及该基因的下游区域，既会给宿主带来额外负担，也会使质因的下游区域，既会给宿主带来额外负担，也会使质粒的稳定性下降。粒的稳定性下降。因此因此(ync)(ync)为了提高生产性能，往往会在目的基因下游为了提高生产性能，往往会在目的基因下游添加终止子序列。如添加终止子序列。如E.coliE.coli中的中的rRNArRNA基因基因rrnBrrnB的终止的终止子、子、T7T7噬菌体的终止子等。噬菌体的终止子等。目的基因目的基因SDSD启动子启动子终止子终止子第九页，共三十九页。不同物种对各种密码子的使用频不同物种对各种密码子的使用频率不同，原因之一是细胞中各种率不同，原因之一是细胞中各种tRNAtRNA分子所占的比例不同。分子所占的比例不同。在工业水平的生产中，密码子的选择在工业水平的生产中，密码子的选择会明显地影响蛋白质的纯度和产量会明显地影响蛋白质的纯度和产量(chnling)(chnling)。基因中如果高频率出现对。基因中如果高频率出现对应于少量应于少量tRNAtRNA的密码子，蛋白产量的密码子，蛋白产量(chnling)(chnling)会明显降低。会明显降低。因此一条重要的基因设计原那么就是因此一条重要的基因设计原那么就是要选择最适密码子：对应于最多要选择最适密码子：对应于最多tRNAtRNA分子的密码子。分子的密码子。GCA GCA GCG GCG GCC GCC GCU GCU丙氨酸的同义密码子丙氨酸的同义密码子tRNAtRNA第十页，共三十九页。外源蛋白质在宿主菌中表达时外源蛋白质在宿主菌中表达时可能会遇到细胞毒性问题，另可能会遇到细胞毒性问题，另一些蛋白那么可能因过剩表达一些蛋白那么可能因过剩表达而形成不溶性的包涵体。而形成不溶性的包涵体。采用细胞外分泌的方法生产采用细胞外分泌的方法生产是防止上述情况发生的有效是防止上述情况发生的有效手段。手段。分泌至细胞外的目的蛋白不仅可分泌至细胞外的目的蛋白不仅可以以(ky)(ky)正确折叠，而且表达量较正确折叠，而且表达量较高，并有利于别离与精制。高，并有利于别离与精制。乳酸克鲁维酵母乳酸克鲁维酵母第十一页，共三十九页。信号肽位于分泌蛋白质的信号肽位于分泌蛋白质的N-N-末端，由末端，由1530aa1530aa组成，末端还组成，末端还存在一段可被信号肽酶切断的序列。如：酵母蔗糖酶信号肽：存在一段可被信号肽酶切断的序列。如：酵母蔗糖酶信号肽：信号肽的重要性就在于它是蛋白质向细胞外分泌的充信号肽的重要性就在于它是蛋白质向细胞外分泌的充分必要条件，因此研究人员开发了一系列利用分必要条件，因此研究人员开发了一系列利用(lyng)(lyng)信信号肽进行蛋白分泌表达的载体。号肽进行蛋白分泌表达的载体。细菌中细菌中B.subtilis B.subtilis 是理想的蛋白质分泌生产宿主，酵母是理想的蛋白质分泌生产宿主，酵母S.S.cerevisiaecerevisiae、P.pastorisP.pastoris和曲霉属的霉菌那么是比较适合和曲霉属的霉菌那么是比较适合作分泌蛋白生产的真核生物宿主。作分泌蛋白生产的真核生物宿主。MLLQAFLLAGFAAKISA SN N第十二页，共三十九页。影响蛋白质表达量的一个重要的宿主因素是宿主本身影响蛋白质表达量的一个重要的宿主因素是宿主本身的蛋白酶的作用，应对的策略之一是寻找相应蛋白酶的蛋白酶的作用，应对的策略之一是寻找相应蛋白酶缺陷的突变株。缺陷的突变株。如如E.coli BL21E.coli BL21DE3DE3是基因表达实验中最常与是基因表达实验中最常与pETpET系列质粒配合系列质粒配合(pih)(pih)使用的宿主菌，使用的宿主菌，B B株系天然缺失株系天然缺失lonlon蛋白酶蛋白酶K12K12有。研究人员又向其引入了蛋白酶有。研究人员又向其引入了蛋白酶OmpTOmpT的缺失突变，有利于提高蛋白产量。的缺失突变，有利于提高蛋白产量。另一种策略是将目的蛋白与其它蛋白如另一种策略是将目的蛋白与其它蛋白如GSTGST，谷胱甘肽硫，谷胱甘肽硫转移酶通过基因融合的方法进行融合表达，也能适度防止转移酶通过基因融合的方法进行融合表达，也能适度防止目的蛋白质的降解。目的蛋白质的降解。第十三页，共三十九页。蛋白质的在结构与功能上都蛋白质的在结构与功能上都具有模块化的特点，其结构具有模块化的特点，其结构域往往在结构和功能上都有域往往在结构和功能上都有相当的独立性。相当的独立性。这就使通过这就使通过DNADNA重组技术重组技术(jsh)(jsh)产生融合蛋白质成为可能。产生融合蛋白质成为可能。这种技术在实验室中也常被用于这种技术在实验室中也常被用于目的蛋白的亲和层析纯化例目的蛋白的亲和层析纯化例如：与如：与GSTGST、HisHis标签、标签、GFPGFP等蛋等蛋白融合。白融合。ORFORF基因融合基因融合基因基因A A基因基因B BORFORF转录转录mRNAmRNA翻译翻译融合蛋白融合蛋白第十四页，共三十九页。amproriGST目的目的(md)(md)蛋白蛋白SDpT7pT7T7T7终止子终止子placT7 RNAT7 RNA聚合酶聚合酶IPTGIPTG宿主宿主(szh)(szh)E.coli BL21(DE3)E.coli BL21(DE3)染色体染色体表达表达(biod)(biod)载体载体T7 RNAT7 RNA聚合酶聚合酶以融合蛋白形式进行表达的额外的以融合蛋白形式进行表达的额外的好处是可以对目标蛋白进行亲和层好处是可以对目标蛋白进行亲和层析纯化，能大大简化蛋白的纯化过析纯化，能大大简化蛋白的纯化过程。程。第十五页，共三十九页。融合融合(rngh)(rngh)蛋白的亲和层析蛋白的亲和层析法纯化法纯化树脂颗粒树脂颗粒GST谷胱甘肽，谷胱甘肽，GSHGSH谷胱甘肽硫转移酶谷胱甘肽硫转移酶GST目标蛋白目标蛋白GSTGST结合结合(jih)(jih)GST洗脱洗脱(x tu)(x tu)蛋白酶蛋白酶GST第十六页，共三十九页。随着科学家对蛋白质的结构与功能之间关系的认识更随着科学家对蛋白质的结构与功能之间关系的认识更加深刻，到加深刻，到19801980年前后科学家们已经可以根据不同的年前后科学家们已经可以根据不同的目的来设计和创造突变蛋白质分子。目的来设计和创造突变蛋白质分子。这种能够改变这种能够改变(gibin)(gibin)蛋白质的功能，或者设计和创造具蛋白质的功能，或者设计和创造具有某种功能的新蛋白的技术被称为有某种功能的新蛋白的技术被称为蛋白质工程蛋白质工程。蛋白质工程的终极目标：蛋白质工程的终极目标：根据氨基酸序列正确预测蛋白质的结构与功能根据氨基酸序列正确预测蛋白质的结构与功能;使用天然或非天然氨基酸甚至化学合成的分子自由地创造具有使用天然或非天然氨基酸甚至化学合成的分子自由地创造具有期望结构和功能蛋白质。期望结构和功能蛋白质。第十七页，共三十九页。从实际应用来看，酶、抗体从实际应用来看，酶、抗体(kngt)(kngt)、受体、运输蛋白、受体、运输蛋白、信号转导蛋白、转录因子等均可以成为蛋白质工程的信号转导蛋白、转录因子等均可以成为蛋白质工程的改造对象。改造对象。在目前，从头设计具有全新的结构和生物功能的蛋白质在目前，从头设计具有全新的结构和生物功能的蛋白质分子相当困难，更多的工作是对现有蛋白质的改造。蛋分子相当困难，更多的工作是对现有蛋白质的改造。蛋白质改造的技术主要有：白质改造的技术主要有：随机突变法随机突变法定点突变法定点突变法DNA shufflingDNA shuffling非天然氨基酸导入非天然氨基酸导入基因融合基因融合第十八页，共三十九页。随机突变法是创造在基因水平上的多样性的重要技术，随机突变法是创造在基因水平上的多样性的重要技术，包括：包括：采用羟胺等化学试剂处理或采用羟胺等化学试剂处理或UVUV照射细胞进行人工诱变，照射细胞进行人工诱变，然后选择表现型；然后选择表现型；利用利用DNADNA修复酶缺陷修复酶缺陷(quxin)(quxin)株；株；利用利用DNADNA聚合酶反响的底物特异性下降现象；聚合酶反响的底物特异性下降现象；全基因水平的人工合成将突变导入目的基因。全基因水平的人工合成将突变导入目的基因。易错易错PCRPCRError-prone PCRError-prone PCR：PCRPCR中使用的中使用的Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶本来就是一种错误率较高的聚合酶，如果在体系中存在本来就是一种错误率较高的聚合酶，如果在体系中存在Mn2+Mn2+或或Mg2+Mg2+浓度异常，以及浓度异常，以及A A、G G、C C、T T中有一种的浓度仅为通常中有一种的浓度仅为通常的的1/101/10，反响就更容易出错。，反响就更容易出错。第十九页，共三十九页。定点突变法：针对编码某个蛋白质的基因定点突变法：针对编码某个蛋白质的基因(jyn)(jyn)，在特，在特定位点引入突变的方法。操作过程如下：定位点引入突变的方法。操作过程如下：人工合成带有需引入的突变序列的寡核苷酸突变引物，如：人工合成带有需引入的突变序列的寡核苷酸突变引物，如：ValArgValArg制备目标基因的单链制备目标基因的单链DNADNA模板模板使突变引物与使突变引物与DNADNA模板退火模板退火使用使用DNADNA聚合酶、连接酶一起合成全长基因，引入突变聚合酶、连接酶一起合成全长基因，引入突变转化至转化至E.coliE.coli中，通过中，通过DNADNA测序确认突变是否成功。测序确认突变是否成功。第二十页，共三十九页。定点定点(dn din)(dn din)突变法突变法 site-directed site-directed mutagenesismutagenesis制作制作(zhzu)(zhzu)ssDNAssDNA质粒质粒人工合成人工合成(rn n h chn)(rn n h chn)突变引物突变引物DNADNA聚合酶合聚合酶合成互补链成互补链转化转化E.coliE.coli，挑选克隆，挑选克隆提取质粒提取质粒DNADNA，测序，测序第二十一页，共三十九页。PCRPCR定点定点(dn din)(dn din)突突变法变法第一轮第一轮PCRPCR混合混合(hnh)(hnh)两个两个PCRPCR产产物，变性，退火物，变性，退火聚合酶合成聚合酶合成(hchng)(hchng)连接到克隆载体中，转化连接到克隆载体中，转化E.coliE.coli，挑选克隆，提取质粒，测序，挑选克隆，提取质粒，测序第一轮第一轮PCRPCRPCRPCR进一步扩增进一步扩增第二十二页，共三十九页。DNA shufflingDNA shuffling：由：由StemmerStemmer等人所建立，作为一种基等人所建立，作为一种基因重排的方法，主要步骤：因重排的方法，主要步骤：针对某个蛋白质构建数个经过功能改进的突变基因针对某个蛋白质构建数个经过功能改进的突变基因用用DNase IDNase I将这些将这些DNADNA随机切断，获得长度在随机切断，获得长度在2050bp2050bp的的片段片段将这些片段混合，进行无引物将这些片段混合，进行无引物PCRPCR参加参加DNADNA连接酶，使连接酶，使DNADNA小片段重新连接，可能获得有小片段重新连接，可能获得有价值的新组合价值的新组合通过适宜的表型筛选系统进行选择通过适宜的表型筛选系统进行选择这种方法甚至能够这种方法甚至能够(nnggu)(nnggu)改变酶分子的底物特异性，改变酶分子的底物特异性，还可以实现酶的稳定性及催化活性的改进。还可以实现酶的稳定性及催化活性的改进。第二十三页，共三十九页。DNase I DNase I 随机随机(su j)(su j)切割切割混合这些片段，热变性混合这些片段，热变性(binxng)(binxng)，退火，退火shuffleshuffle嵌合体文库嵌合体文库(wnk)(wnk)DNADNA聚合酶，连接酶聚合酶，连接酶表型筛选表型筛选一组相关的基因一组相关的基因ReshuffleReshuffleDNA shufflingDNA shuffling第二十四页，共三十九页。非天然氨基酸导入：将非天然氨基酸导入：将2020种氨基酸之外的氨基酸如种氨基酸之外的氨基酸如硝基苯丙氨酸导入蛋白质分子中，可以赋予蛋白质硝基苯丙氨酸导入蛋白质分子中，可以赋予蛋白质全新的功能。全新的功能。首先必须使一些遗传密码子对应于非天然氨基酸，通首先必须使一些遗传密码子对应于非天然氨基酸，通常需要对常规的三联体密码子进行扩展，产生常需要对常规的三联体密码子进行扩展，产生四联四联体密码子体密码子，如，如CGGGCGGG。先将该序列导入目标基因中想要导入该氨基酸的位置，先将该序列导入目标基因中想要导入该氨基酸的位置，同时用同时用化学酰胺化化学酰胺化的方法得到该氨基酸的氨酰的方法得到该氨基酸的氨酰tRNAtRNA，使携带识别，使携带识别(shbi)(shbi)CGGGCGGG的反密码子的的反密码子的tRNAtRNA与非天与非天然氨基酸结合。然氨基酸结合。第二十五页，共三十九页。UCGUCGAGC AGC ACC AGC AGC ACC SerSermRNAmRNAtRNAtRNAAGC CGGG ACC AGC CGGG ACC mRNAmRNAGCCCGCCC硝基苯丙氨酸硝基苯丙氨酸(化学酰胺化法）化学酰胺化法）在体外无细胞在体外无细胞(xbo)(xbo)翻译翻译体系中进行蛋白质合成体系中进行蛋白质合成第二十六页，共三十九页。将上述氨酰将上述氨酰tRNAtRNA与目标基因的与目标基因的mRNAmRNA分子共同添加到无细分子共同添加到无细胞翻译体系中，就可以获得想要的蛋白质。胞翻译体系中，就可以获得想要的蛋白质。使用多种四联体密码子，可将使用多种四联体密码子，可将2 2种以上的非天然氨基酸种以上的非天然氨基酸分别导入蛋白质分子中特定分别导入蛋白质分子中特定(tdng)(tdng)的位点。的位点。这种技术存在的问题主要有：这种技术存在的问题主要有：因为使用无细胞翻译系统，所以蛋白产量低因为使用无细胞翻译系统，所以蛋白产量低氨酰基氨酰基tRNAtRNA的制备过程复杂的制备过程复杂导入非天然氨基酸后的蛋白质发生变性、失活等导入非天然氨基酸后的蛋白质发生变性、失活等第二十七页，共三十九页。洗涤剂用酶是洗涤剂中不可或缺的成洗涤剂用酶是洗涤剂中不可或缺的成分，常添加的酶包括分，常添加的酶包括(boku)(boku)蛋白酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。其市场需求量在淀粉酶、脂肪酶等。其市场需求量在不断增加。不断增加。在各种酶制剂联合使用以提高洗涤在各种酶制剂联合使用以提高洗涤效果的同时，科研人员也致力于通效果的同时，科研人员也致力于通过蛋白质工程手段改善每种酶的功过蛋白质工程手段改善每种酶的功能。能。蛋白酶蛋白酶：蛋白酶是洗涤剂中最重要、：蛋白酶是洗涤剂中最重要、使用量最大的酶制剂。使用量最大的酶制剂。第二十八页，共三十九页。在长期保存的过程中，洗涤剂中的漂白成分会引起在长期保存的过程中，洗涤剂中的漂白成分会引起(ynq)(ynq)酶的失活，可能是由于位于活性中心附近的酶的失活，可能是由于位于活性中心附近的MetMet被氧化所引起被氧化所引起(ynq)(ynq)。如果把该如果把该MetMet替换为其他氨基酸，可以提高酶分子的抗替换为其他氨基酸，可以提高酶分子的抗氧化性能。氧化性能。例如：来源于芽孢杆菌的一种碱性蛋白酶，将其例如：来源于芽孢杆菌的一种碱性蛋白酶，将其Met222Met222替换替换为为AlaAla后，经后，经100mM H2O2100mM H2O2处理处理15min15min后剩余活力由野生型的后剩余活力由野生型的30%30%提高到提高到70%70%。诺维信。诺维信NovozymesNovozymes的产品的产品EsperaseEsperase。第二十九页，共三十九页。低温蛋白酶的开发：对低温蛋白酶的开发：对B.clausii B.clausii 来源的蛋白酶来源的蛋白酶savinasesavinase的基因进行定点或随机的基因进行定点或随机(su j)(su j)突变，构建在芽孢突变，构建在芽孢杆菌中的基因表达文库。杆菌中的基因表达文库。筛选：将菌体溶液移入筛选：将菌体溶液移入9696孔板，进行低温条件下的酶孔板，进行低温条件下的酶促反响。获得的突变型酶在促反响。获得的突变型酶在1515时的洗涤效果有显著时的洗涤效果有显著提高提高KannaseKannase，NovozymesNovozymes，19971997。淀粉酶：大量用于餐具的自动化清洗。来源于淀粉酶：大量用于餐具的自动化清洗。来源于B.B.licheniformis licheniformis 的的-淀粉酶性能优良，但是不抗氧化剂。淀粉酶性能优良，但是不抗氧化剂。突变突变Met197AlaMet197Ala使其抗氧化性能显著增强，在加漂白剂的使其抗氧化性能显著增强，在加漂白剂的洗涤剂中五星期后仍保持洗涤剂中五星期后仍保持90%90%以上的活力。以上的活力。PurastarPurastar，Genencor IncGenencor Inc第三十页，共三十九页。诺维信是一家丹麦的生物技术公司，主要进行酶制剂、诺维信是一家丹麦的生物技术公司，主要进行酶制剂、微生物制剂和生物医药成分的研发微生物制剂和生物医药成分的研发(yn f)(yn f)与生产。与生产。20212021年占据全球酶制剂市场的年占据全球酶制剂市场的48%48%，是最大的工业用酶制，是最大的工业用酶制剂的生产商。目前有剂的生产商。目前有700700多种产品，普及全球多种产品，普及全球130130个国家。个国家。诺维信诺维信19921992年开始进入中国，目前投资总额超过年开始进入中国，目前投资总额超过5 5亿美元。亿美元。机构包括机构包括4 4 家工厂，家工厂，2 2 家分公司，家分公司，1 1 家创新与开展中心，员家创新与开展中心，员工总数超过工总数超过10001000名。名。第三十一页，共三十九页。核酸类化合物核酸类化合物5-IMP5-IMP和和5-GMP5-GMP是制作鲜是制作鲜味调味品的原料，工业规模化生产这些核味调味品的原料，工业规模化生产这些核苷酸的方法之一就是用酶法对发酵产生的苷酸的方法之一就是用酶法对发酵产生的核苷进行磷酸化。核苷进行磷酸化。许多微生物可以利用无机磷酸对核苷进许多微生物可以利用无机磷酸对核苷进行磷酸化，化学反响如下：行磷酸化，化学反响如下：具有调味具有调味(tio wi)(tio wi)作用的只有作用的只有5-5-核苷酸，核苷酸，所以先筛选能以焦磷酸为磷酸供体，特所以先筛选能以焦磷酸为磷酸供体，特异性地对核苷的异性地对核苷的5OH5OH进行磷酸化的菌株，进行磷酸化的菌株，成功找到了数个属于肠细菌科的菌株。成功找到了数个属于肠细菌科的菌株。核苷核苷 +PPi 5+PPi 5-核苷酸核苷酸+Pi+Pi第三十二页，共三十九页。然后选择然后选择5 5-核苷酸产量最高的菌株核苷酸产量最高的菌株Morganella Morganella morgniimorgnii，克隆了其核苷磷酸化酶基因，并进行了酶学研究，克隆了其核苷磷酸化酶基因，并进行了酶学研究(ynji)(ynji)，发现其有两种活性：，发现其有两种活性：核苷磷酸化酶活性：核苷磷酸化酶活性：磷酸酶活性：磷酸酶活性：要想使其适于核苷酸的工业生产，必须提高其磷酸化酶活性，要想使其适于核苷酸的工业生产，必须提高其磷酸化酶活性，同时抑制其磷酸酶活性。同时抑制其磷酸酶活性。改造步骤：改造步骤：PCRPCR法引入随机突变，从表达突变酶的重组菌中筛选法引入随机突变，从表达突变酶的重组菌中筛选5 5-核核苷酸合成能力高的菌株苷酸合成能力高的菌株次黄苷次黄苷 +PPi 5+PPi 5-IMP+Pi-IMP+Pi5 5-IMP+H-IMP+H2 2O O 次黄苷次黄苷 +Pi+Pi第三十三页，共三十九页。在两轮随机突变后科研人员获得了生产性能有大幅提高的菌株，在两轮随机突变后科研人员获得了生产性能有大幅提高的菌株，其中的酶发生了其中的酶发生了Gly92AspGly92Asp和和Ile171ThrIle171Thr的突变；的突变；突变型酶与野生型相比，与次黄嘌呤核苷的亲和性明显加强，突变型酶与野生型相比，与次黄嘌呤核苷的亲和性明显加强，5 5-IMP-IMP的生产性能大幅提高，而且的生产性能大幅提高，而且IMPIMP的水解也受到抑制的水解也受到抑制(yzh)(yzh)。生成的核苷酸只有生成的核苷酸只有5 5-核苷酸，没有核苷酸，没有2 2-、3 3-核苷酸副产物。核苷酸副产物。此外，该酶的底物特异性广泛，适用于各种此外，该酶的底物特异性广泛，适用于各种5 5-核苷酸的生产。核苷酸的生产。第三十四页，共三十九页。进一步，研究人员对进一步，研究人员对Escherichia Escherichia blattae blattae 来源的这种酶进行了结晶和来源的这种酶进行了结晶和结构解析。结构解析。根据结构信息，对一些位点进行了定根据结构信息，对一些位点进行了定点突变，如点突变，如Ser90PheSer90Phe的突变，使酶对的突变，使酶对次黄苷的次黄苷的KmKm下降下降60%60%，大幅提高了酶的，大幅提高了酶的反响能力。反响能力。经过一系列的研究之后，最终确立了经过一系列的研究之后，最终确立了新型的酶法核酸鲜味新型的酶法核酸鲜味(xin wi)(xin wi)调味品的调味品的工业生产技术，并于工业生产技术，并于20032003年开始投入年开始投入生产味之素株式会社。生产味之素株式会社。1D2T1D2T第三十五页，共三十九页。日本味之素公司是拥有百年历史的全球十大食品企业日本味之素公司是拥有百年历史的全球十大食品企业之一，是世界上最大的氨基酸供给商之一。产品涉及之一，是世界上最大的氨基酸供给商之一。产品涉及食品、药品等多个领域。食品、药品等多个领域。味之素不但生产味之素不但生产(shngchn)(shngchn)赖氨酸，而且苏氨酸、色氨酸的赖氨酸，而且苏氨酸、色氨酸的生产生产(shngchn)(shngchn)量在世界上都是最大的。在氨基酸领域处于量在世界上都是最大的。在氨基酸领域处于领导者地位的味之素集团，运用最先进的独创技术，广领导者地位的味之素集团，运用最先进的独创技术，广泛地开发了氨基酸的用途。泛地开发了氨基酸的用途。味之素已在中国建立味之素已在中国建立1818家公司，业务涉及调味品、加工家公司，业务涉及调味品、加工食品、医药食品、医药/工业用工业用/饲料氨基酸等。当前味之素在中国饲料氨基酸等。当前味之素在中国的核心业务围绕调味品及加工食品展开。的核心业务围绕调味品及加工食品展开。第三十六页，共三十九页。在现代医学中，医生要作出准确的诊断，往往需要检测在现代医学中，医生要作出准确的诊断，往往需要检测病人的各种代谢物在体液中的水平血液、尿液。病人的各种代谢物在体液中的水平血液、尿液。酶是一种酶是一种(y zhn)(y zhn)十分理想的诊断试剂，利用酶试剂构建的十分理想的诊断试剂，利用酶试剂构建的检测系统能充分发挥酶促反响特异性强、反响时间短的优势，检测系统能充分发挥酶促反响特异性强、反响时间短的优势，简便、快速、准确。简便、快速、准确。现在的诊断试剂从便捷角度出发多以液体试剂盒为主，现在的诊断试剂从便捷角度出发多以液体试剂盒为主，这对酶的性能要求甚为严格。酶的高纯度精制是必须这对酶的性能要求甚为严格。酶的高纯度精制是必须的，并且在液体试剂中长期保存的稳定性也十分重要。的，并且在液体试剂中长期保存的稳定性也十分重要。第三十七页，共三十九页。胆固醇氧化酶胆固醇氧化酶ChoAChoA：链霉菌：链霉菌StreptomycesStreptomyces来源的来源的ChoAChoA的底物亲和性优异的底物亲和性优异Km=13MKm=13M，非常适合于胆固醇，非常适合于胆固醇的检测。的检测。但是该酶的稳定性不高，且在弱碱环境下活性较低。但是该酶的稳定性不高，且在弱碱环境下活性较低。科学家通过对其立体结构的模拟，有目的地构建科学家通过对其立体结构的模拟，有目的地构建(u(u jin)jin)了其突变体文库，并筛选热稳定性提高的突变体。了其突变体文库，并筛选热稳定性提高的突变体。最终选定了一种双突变体：最终选定了一种双突变体：V145EV145E，S103TS103T，其热稳定性和在，其热稳定性和在弱碱性环境中的活性都有明显改善。其工业生产已经获得成弱碱性环境中的活性都有明显改善。其工业生产已经获得成功，被广泛用于各种胆固醇诊断试剂。功，被广泛用于各种胆固醇诊断试剂。第三十八页，共三十九页。内容(nirng)总结本课内容。启动子的强度是指一个启动子能够多大程度地结合RNA聚合酶并引发转录过程。这些序列被称作顺式作用(zuyng)元件cis序列。外源蛋白质在宿主菌中表达时可能会遇到细胞毒性问题，另一些蛋白那么可能因过剩表达而形成不溶性的包涵体。使用天然或非天然氨基酸甚至化学合成的分子自由地创造具有期望结构和功能蛋白质。全基因水平的人工合成将突变导入目的基因。蛋白酶：蛋白酶是洗涤剂中最重要、使用量最大的酶制剂第三十九页，共三十九页。