蛋白质和氨基酸测定课件

主要内容主要内容第一节第一节第一节第一节 概述概述概述概述第二节第二节第二节第二节 凯氏定氮分析法凯氏定氮分析法凯氏定氮分析法凯氏定氮分析法第三节第三节第三节第三节 蛋白质的快速分析方法蛋白质的快速分析方法蛋白质的快速分析方法蛋白质的快速分析方法第四节第四节第四节第四节 氨基酸总量的测定那个氨基酸总量的测定那个氨基酸总量的测定那个氨基酸总量的测定那个第五节第五节第五节第五节 个别氨基酸的定量测定个别氨基酸的定量测定个别氨基酸的定量测定个别氨基酸的定量测定第六节第六节第六节第六节 氨基酸的分离分析氨基酸的分离分析氨基酸的分离分析氨基酸的分离分析第第1页页/共共72页页第一节第一节 概概 述述一、蛋白质的元素组成一、蛋白质的元素组成 C：50-55%N：15-18%O：20-25%H：5-7%S：0.2-0.3%微量元素：微量元素：P、Fe、Zn、Cu二、基本结构单位：氨基酸二、基本结构单位：氨基酸第第2页页/共共72页页 不不同同的的蛋蛋白白质质其其氨氨基基酸酸构构成成比比例例及及方方式式不不同同，故故各各种种不不同同的的蛋蛋白白质质其其含含氮氮量量也也不不同同，一一般般蛋蛋白白质质含含氮氮量量为为16%，即即一一 份份氮氮素素相相当当于于6.25份份蛋蛋白白质质，此此数数值值（6.25）称为蛋白质系数）称为蛋白质系数。不不同同种种类类食食品品的的蛋蛋白白质质系系数数有有所所不不同同，如如玉玉米米，荞荞麦麦，青青豆豆，鸡鸡蛋蛋等等为为6.25，花花生生为为5.46，大大米米为为5.95，大大豆豆及及其其制制品品为为5.71，小小麦麦粉粉为为5.70，牛牛乳乳及及其其制制品品为为6.38。三、蛋白质系数三、蛋白质系数第第3页页/共共72页页四、蛋白质分析的重要性四、蛋白质分析的重要性评价食品的营养价值评价食品的营养价值优化食品配方优化食品配方指导经济核算及生产过程控制指导经济核算及生产过程控制营养标签营养标签 总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值第第4页页/共共72页页五、蛋白质的测定方法五、蛋白质的测定方法利用蛋白质共性的方法利用蛋白质共性的方法利用特定氨基酸残基法利用特定氨基酸残基法福林酚法福林酚法染色法染色法凯氏定氮法凯氏定氮法杜马斯法杜马斯法第第5页页/共共72页页第二节第二节 凯氏定氮分析法凯氏定氮分析法蛋白质测定方法蛋白质测定方法 凯氏定氮法凯氏定氮法 双缩脲法双缩脲法 紫外吸收法紫外吸收法 福林福林-酚试剂法酚试剂法 水杨酸比色法水杨酸比色法 近红外光谱法近红外光谱法 折光法折光法 旋光法旋光法目前蛋白质测定最常用的方法是目前蛋白质测定最常用的方法是凯氏定氮法凯氏定氮法第第6页页/共共72页页一、一、凯氏定氮法凯氏定氮法是是通通过过测测出出样样品品中中的的总总含含氮氮量量再再乘乘以以相相应应的的蛋蛋白白质质系数而求出蛋白质的含量系数而求出蛋白质的含量此此法法的的结结果果称称为为粗粗蛋蛋白白质质含含量量：由由于于样样品品中中含含有有少少量量非非蛋蛋白白质质含含氮氮化化合合物物，如如核核酸酸、生生物物碱碱、含含氮氮类类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物第第7页页/共共72页页（一）常量凯氏定氮法（一）常量凯氏定氮法1 1、原理、原理 样样品品与与浓浓硫硫酸酸和和催催化化剂剂一一同同加加热热消消化化，使使蛋蛋白白质质分分解解，其其中中碳碳和和氢氢被被氧氧化化为为二二氧氧化化碳碳和和水水逸逸出出，而而样样品品中中的的有有机机氮氮转转化化为为氨氨与与硫硫酸酸结结合合成成硫硫酸酸铵铵。然然后后加加碱碱蒸蒸馏馏，使使氨氨蒸蒸出出，用用硼硼酸酸吸吸收收后后再再以以标标准准盐盐酸酸或或硫硫酸酸溶溶液液滴滴定定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。包括包括消化、蒸馏、吸收、滴定消化、蒸馏、吸收、滴定四个步骤四个步骤。第第8页页/共共72页页 样品消化样品消化 2NH2NH2 2-(CH-(CH2 2)2 2-COOH+13H-COOH+13H2 2SOSO4 4(NH(NH4 4)2 2 SOSO4 4+6CO+6CO2 2+12SO+12SO2 2+16H+16H2 2O O 浓硫酸的作用：浓硫酸的作用：脱水作用脱水作用使有机物脱水并碳化为使有机物脱水并碳化为C C、H H、N N 氧氧化化作作用用将将有有机机物物炭炭化化后后的的碳碳氧氧化化为为二二氧氧化化碳碳，硫硫酸酸则被还原成二氧化硫则被还原成二氧化硫 2H2H2 2SOSO4 4 C C 2SO2SO2 2 2H2H2 2O O COCO2 2 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。氨与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。第第9页页/共共72页页v加入硫酸钾的作用是：加入硫酸钾的作用是：提高溶液沸点提高溶液沸点而加而加快快有有机物的分解机物的分解（3383380 0C C 4004000 0C C）K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3 但但硫硫酸酸钾钾加加入入量量不不能能太太大大，否否则则消消化化体体系系温温度度过过高高，又又会会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失：引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失：（NHNH4 4）2 2SOSO4 4=NH=NH3 3+(NH+(NH4 4)HSO)HSO4 4 2(NH 2(NH4 4)HSO)HSO4 4=2NH=2NH3 3+2SO+2SO3 3+2H+2H2 2O O 除除硫硫酸酸钾钾外外也也可可加加入入硫硫酸酸钠钠，氯氯化化钾钾等等盐盐类类来来提提高高沸沸点点，但效果不如硫酸钾。但效果不如硫酸钾。第第10页页/共共72页页v加入硫酸铜的作用加入硫酸铜的作用 催化作用：加速有机物的氧化分解催化作用：加速有机物的氧化分解 C C 2CuSO 2CuSO4 4 Cu Cu2 2SOSO4 4 SO SO2 2 CO CO2 2 Cu Cu2 2SOSO4 4 2H 2H2 2SOSO4 4 2CuSO 2CuSO4 4 2H 2H2 2O O SO SO2 2 此此反反应应不不断断进进行行，待待有有机机物物被被消消化化完完后后，不不再再有有硫硫酸亚铜酸亚铜（褐色）（褐色）生成，溶液呈现清澈生成，溶液呈现清澈的蓝的蓝绿色。绿色。消化完全指示：蓝绿色；消化完全指示：蓝绿色；第第11页页/共共72页页 蒸馏蒸馏 在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气加热蒸馏，即可释放出氨气 (NH (NH4 4)2 2 SOSO4 4+2NaOH 2NH+2NaOH 2NH3 3+Na+Na2 2SOSO4 4+2H+2H2 2O O 蒸馏时碱性反应完全指示蒸馏时碱性反应完全指示：变深蓝色或产生黑色沉淀变深蓝色或产生黑色沉淀第第12页页/共共72页页 吸收吸收 用硼酸溶液，并加入混合指示剂，硼酸呈微用硼酸溶液，并加入混合指示剂，硼酸呈微弱酸性（弱酸性（K Ka1a1=5.8X 10=5.8X 10-10-10），与氨形成强碱弱），与氨形成强碱弱酸盐酸盐 2NH2NH3 3+4H4H3 3BOBO3 3=(NH=(NH4 4)2 2B B4 4O O7 7+5H+5H2 2O O第第13页页/共共72页页 滴定滴定 待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定 蓝绿色蓝绿色灰红色灰红色 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3第第14页页/共共72页页2、操作方法（1）样品消化）样品消化消化终点样品样品+0.+0.5 5g g硫硫酸铜酸铜+1010g g硫酸硫酸钾钾+20m+20mL L浓硫浓硫酸酸+玻珠数粒玻珠数粒先小火炭化，无泡沫先小火炭化，无泡沫后，加大火力，液体后，加大火力，液体变蓝绿透明，继续加变蓝绿透明，继续加热微沸热微沸3030分钟分钟4545度角度角瓶口不能对着人瓶口不能对着人盖上小漏斗盖上小漏斗第第15页页/共共72页页消化炉消化炉第第16页页/共共72页页70-80mL，400g/L氢氧化氢氧化钠溶液钠溶液装有消化液；装有消化液；加入氢氧化钠加入氢氧化钠后要求颜色变后要求颜色变为深蓝色或产为深蓝色或产生黑色沉淀生黑色沉淀50mL，40g/L的硼砂以及混的硼砂以及混合指示剂合指示剂氨全部蒸出后，提氨全部蒸出后，提离页面，蒸馏水冲离页面，蒸馏水冲洗，继续蒸馏洗，继续蒸馏1min1min。奈氏试剂检验。奈氏试剂检验第第17页页/共共72页页奈氏试剂奈氏试剂NesslerNessler试剂，试剂，K K2 2（HgIHgI4 4）检验检验NH4+离子，遇铵根，离子析出黄色或红棕色离子，遇铵根，离子析出黄色或红棕色沉淀。沉淀。配制方法配制方法1：3.5 g KI+1.3 g HgCl2 溶于溶于70 毫升水。毫升水。加加30毫升毫升4 mol/L氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，必氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。配制方法配制方法2：溶解：溶解11.5 g HgI2+KI 10 g于适量少许于适量少许水，后加水稀释至水，后加水稀释至50 ml,静置后，取其澄清液，弃去静置后，取其澄清液，弃去沉淀，储存于棕色瓶中。沉淀，储存于棕色瓶中。第第18页页/共共72页页（3 3）滴定滴定 用用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红剂用混合指示剂（甲基红-溴甲基酚绿混合指示剂）溴甲基酚绿混合指示剂）国标用亚甲基兰国标用亚甲基兰+甲基红。甲基红。用过量的用过量的 H2SO4 或或 HCl 标准溶液吸收，再用标准溶液吸收，再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。第第19页页/共共72页页滴定前滴定前滴定终点滴定终点同时做一试剂空白实验，记录空白滴定消耗盐酸的体积。同时做一试剂空白实验，记录空白滴定消耗盐酸的体积。第第20页页/共共72页页改良式定氮蒸馏器改良式定氮蒸馏器半微量定氮蒸馏器半微量定氮蒸馏器第第21页页/共共72页页注意问题：注意问题：加入样品不要沾附在凯氏烧瓶瓶颈；加入样品不要沾附在凯氏烧瓶瓶颈；消消化化开开始始时时不不要要用用强强火火，要要控控制制好好热热源源，并并注注意意不不时时转转动动凯凯氏氏烧烧瓶瓶，以以便便利利用用冷冷凝凝酸酸液液将将附附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全；在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全；样样品品中中若若含含脂脂肪肪或或糖糖较较多多，在在消消化化前前应应加加入入少少量量辛辛醇醇或或液液体体石石蜡蜡或或硅硅油油作作消消泡泡剂剂，以以防防消消化化过程中产生大量泡沫；过程中产生大量泡沫；第第22页页/共共72页页 消化完全后要冷至室温才能稀释或定容。所用试消化完全后要冷至室温才能稀释或定容。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。剂溶液应用无氨蒸馏水配制。当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入却，加入3030过氧化氢过氧化氢 23 m1 23 m1 后再继续加热后再继续加热消化。消化。般消化至呈透明后，继续消化般消化至呈透明后，继续消化3030分钟即可。有分钟即可。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。含铁量多时，呈较深绿色。第第23页页/共共72页页 蒸馏装置不能漏气。蒸馏装置不能漏气。若取样量较大，如干试样超过若取样量较大，如干试样超过5 g 5 g 可按每克试样可按每克试样5 5 mLmL的比例增加硫酸用量。如硫酸缺少，过多的硫的比例增加硫酸用量。如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这时会形成硫酸氢钾，而酸钾会引起氨的损失，这时会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸被过多底物消耗掉或样不与氨作用，因此当硫酸被过多底物消耗掉或样品中脂肪含量过高时，要添加硫酸。品中脂肪含量过高时，要添加硫酸。第第24页页/共共72页页 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。氢氧化化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。氢氧化铜在铜在70709090时发黑。时发黑。蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸口，再蒸1 1分钟后关掉热源否则可能造成吸收液分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒吸。倒吸。第第25页页/共共72页页X =X为样品中蛋白质的含量为样品中蛋白质的含量 g/100gV1为样品消耗盐酸标准液的体积为样品消耗盐酸标准液的体积V2为试剂空白消耗盐酸标准液的体积为试剂空白消耗盐酸标准液的体积C为盐酸标准液的浓度为盐酸标准液的浓度M为为1/2N2的摩尔质量的摩尔质量,14.01g/molm为样品的质量为样品的质量F为氮换算为蛋白质的系数为氮换算为蛋白质的系数结果计算结果计算第第26页页/共共72页页(二二)微量凯氏定氮法微量凯氏定氮法 1、原理及适用范围、原理及适用范围:同常量凯氏定氮同常量凯氏定氮 2、与常量法不同点：、与常量法不同点：加入硼酸量由50 mL 10mL 盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L 蒸馏装置不同3、蒸馏装置见 123 页图 8-2。第第27页页/共共72页页A A 蒸气发生器蒸气发生器B B 汽水分离器汽水分离器C C 反应管反应管D D 进样口进样口E E 冷凝管冷凝管F F 吸收瓶吸收瓶G G 玻璃珠玻璃珠H H 导管导管第第28页页/共共72页页第第29页页/共共72页页第第30页页/共共72页页将消化液全部转移将消化液全部转移到到100mL容量瓶中容量瓶中加加10ml硼酸溶液和硼酸溶液和混合指示剂混合指示剂23d加入加入NaOHNaOH溶液后颜色溶液后颜色为深蓝色或褐色为深蓝色或褐色通入蒸汽开始蒸馏通入蒸汽开始蒸馏冷凝管下口浸入冷凝管下口浸入硼酸溶液中硼酸溶液中取取10m10mL L消化稀释液沿小玻璃杯移入反消化稀释液沿小玻璃杯移入反应室，少量蒸馏水冲洗，塞紧棒状玻应室，少量蒸馏水冲洗，塞紧棒状玻璃塞，向小玻璃杯内加入璃塞，向小玻璃杯内加入10m10mL L40%NaOH,40%NaOH,提起玻璃塞，使提起玻璃塞，使NaOHNaOH缓缓慢流入反应室，立即塞紧玻璃塞，并慢流入反应室，立即塞紧玻璃塞，并在小玻璃杯中加水使之密封。在小玻璃杯中加水使之密封。加水至加水至2/3体积处，加数体积处，加数滴甲基橙指示剂和硫酸滴甲基橙指示剂和硫酸几毫升，使水呈酸性几毫升，使水呈酸性第第31页页/共共72页页吸吸收收液液变变蓝蓝色色后后继继续续蒸蒸馏馏5 5分分钟钟，将将冷冷凝凝管管尖尖端端提提离离液液面面再再蒸蒸馏馏1min1min，用用蒸蒸馏馏水水冲冲洗洗冷冷凝凝管管尖尖端端，取取下下接接收收瓶瓶，关闭电源关闭电源第第32页页/共共72页页注意问题：注意问题：（1 1）整整套套装装置置不不能能漏漏气气，要要注注意意各各蒸蒸汽汽控控制制夹夹子子的的操操作作，以以防蒸汽受阻爆炸或吸收液倒吸。防蒸汽受阻爆炸或吸收液倒吸。（2 2）在在蒸蒸汽汽发发生生瓶瓶中中要要加加入入硫硫酸酸和和甲甲基基橙橙使使呈呈酸酸性性以以防防水水中中的氨蒸出。的氨蒸出。（3 3）蒸蒸馏馏完完毕毕后后，应应先先将将冷冷凝凝管管下下端端提提离离液液面面，再再蒸蒸1 1分分钟钟，将将附附着着在在尖尖端端的的吸吸收收液液完完全全洗洗入入吸吸收收瓶瓶内内，再再将将吸吸收收瓶瓶移移开开，最最后后关关闭闭电电源源，绝绝不不能能先先关关闭闭电电源源，否否则则吸吸收收液液将将发发生倒吸。生倒吸。第第33页页/共共72页页（4 4）在在每每次次测测定定前前及及两两次次测测定定之之间间，均均要要洗洗涤涤反反应应管管(倒倒吸吸法法，在在吸吸收收瓶瓶中中加加入入蒸蒸馏馏水水，其其余余同同测测定定时时的的做做法法，在在蒸蒸汽汽发发生生器器中中水水剧剧烈烈沸沸腾腾后后，立立即即移移开开电电炉炉，水水即即从从吸吸收收瓶瓶中中倒倒吸吸入入反反应应管管，再再倒倒吸吸入入汽汽水水分分离离管管或或蒸蒸汽汽发发生生器器中，打开夹子，即可放出废水。中，打开夹子，即可放出废水。第第34页页/共共72页页(三三)自动凯氏定氮法自动凯氏定氮法第第35页页/共共72页页NH2CONHCONH2 +NH3NH2CONH2+NH2CONH2 150160双缩脲双缩脲双缩脲双缩脲双缩脲双缩脲能和硫酸铜的碱性能和硫酸铜的碱性溶液生成溶液生成紫红色络和物紫红色络和物，此反应称为双缩脲反应。此反应称为双缩脲反应。一、双缩脲法第三节第三节 蛋白质的快速分析方法蛋白质的快速分析方法第第36页页/共共72页页 蛋蛋白白质质分分子子中中含含有有肽肽键键 CONH 与与双双缩缩脲脲结结构构相相似似。在在同同样样条条件件下下也也有有呈呈色色反反应应，在在一一定定条条件件下下，其其颜颜色色深深浅浅与与蛋蛋白白质质含含量量成成正正比比，可可用用分分光光光光度度计计来来测测其其吸吸光光度度，确定含量。（确定含量。（540nm）特点：特点：受蛋白质特异性影响小，操作受蛋白质特异性影响小，操作简单快速，灵敏度低，所需样品量大，简单快速，灵敏度低，所需样品量大，常用于生物化学领域。常用于生物化学领域。第第37页页/共共72页页操作方法 1 1、制作标准曲线、制作标准曲线 以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质样，配制不同浓度标准样，为标准蛋白质样，配制不同浓度标准样，A A560560为为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。2 2、样品测定、样品测定第第38页页/共共72页页注意事项1 1.配制试剂加入硫酸铜溶液时需剧烈搅拌。配制试剂加入硫酸铜溶液时需剧烈搅拌。2.2.脂肪含量高的样品应预先提取脂肪；脂肪含量高的样品应预先提取脂肪；3.3.样品有不溶性成分存在，可先提取蛋白质在测定样品有不溶性成分存在，可先提取蛋白质在测定4.4.计算结果需注明干基还是湿基计算结果需注明干基还是湿基5.5.本法已被用于谷类、肉类、大豆及动物饲料等样本法已被用于谷类、肉类、大豆及动物饲料等样品的蛋白质测定。品的蛋白质测定。第第39页页/共共72页页二、紫外吸收法（一）（一）A A280nm280nm光吸收法光吸收法 蛋白质及其降解产物的芳香环残基具有吸蛋白质及其降解产物的芳香环残基具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在收紫外光的性质，最大吸收峰在280nm280nm波长处。波长处。在此波长下，蛋白质溶液的吸光度与其浓度在此波长下，蛋白质溶液的吸光度与其浓度（3-8ug/mL3-8ug/mL）呈正比关系，可作定量测定。）呈正比关系，可作定量测定。第第40页页/共共72页页（二）肽键紫外光测定法（二）肽键紫外光测定法第第41页页/共共72页页两步反应：两步反应：(1)(1)在碱性条件下，蛋白质在碱性条件下，蛋白质(肽键）与铜离子作用生成蛋肽键）与铜离子作用生成蛋白质白质-铜络合物。铜络合物。(2)(2)此络合物将试剂磷钼酸此络合物将试剂磷钼酸-磷钨酸磷钨酸(olinolin试剂试剂)还原，还原，混合物深蓝色混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物磷钼蓝和磷钨蓝混合物)（A A750750)。四、福林四、福林-酚法（双缩脲法的发展）酚法（双缩脲法的发展）第第42页页/共共72页页五、考马斯亮蓝染料比色法五、考马斯亮蓝染料比色法 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250G-250是一种蛋白质染料，与是一种蛋白质染料，与蛋白质通过范德华力结合，是蛋白质染色，蛋白质通过范德华力结合，是蛋白质染色，在在620nm620nm处有最大吸收值，可用于蛋白质的测处有最大吸收值，可用于蛋白质的测定，适合大量样品的测定。定，适合大量样品的测定。第第43页页/共共72页页六、水杨酸比色法六、水杨酸比色法 原理：原理：样品中的蛋白质经硫酸消化而转化成样品中的蛋白质经硫酸消化而转化成铵盐溶液后，在一定的酸度和温度条件下可与铵盐溶液后，在一定的酸度和温度条件下可与水杨酸和次氯酸钠作用生成蓝色化合物，在水杨酸和次氯酸钠作用生成蓝色化合物，在660nm660nm处比色测定，求出样品的含氮量，进而处比色测定，求出样品的含氮量，进而计算出蛋白质的含量。计算出蛋白质的含量。第第44页页/共共72页页七、比浊法 低浓度的三氯乙酸、磺基水杨酸和乙酸中的铁低浓度的三氯乙酸、磺基水杨酸和乙酸中的铁氰化钾能使提取的蛋白质沉淀，形成蛋白质颗粒氰化钾能使提取的蛋白质沉淀，形成蛋白质颗粒的悬浊液，其浊度可通过辐射光传送过程中的衰的悬浊液，其浊度可通过辐射光传送过程中的衰减而确定，其衰减程度与溶液中蛋白质的浓度呈减而确定，其衰减程度与溶液中蛋白质的浓度呈正比。正比。主要用于小麦面粉和玉米蛋白质含量测定主要用于小麦面粉和玉米蛋白质含量测定。第第45页页/共共72页页八、杜马斯法（燃烧法）样品在高温下（样品在高温下（700-800700-800）燃烧，释放的氮）燃烧，释放的氮气由带热导检测器（气由带热导检测器（TCD)TCD)的气相色谱仪测定。测得的气相色谱仪测定。测得的含氮量转换成样品中的蛋白质含量。的含氮量转换成样品中的蛋白质含量。第第46页页/共共72页页 氨基酸的含量一直是某些发酵产品如调味品氨基酸的含量一直是某些发酵产品如调味品的质量指标，也是目前许多保健食品的质量指标的质量指标，也是目前许多保健食品的质量指标之一，其中的含氮量可直接测定，不同于蛋白质之一，其中的含氮量可直接测定，不同于蛋白质的氮，故称为氨基酸态氮。的氮，故称为氨基酸态氮。氨基酸态氮反映的是氨基酸态氮反映的是样品中游离氨基酸的总量。样品中游离氨基酸的总量。第六节 氨基酸的定量测定第第47页页/共共72页页氨基酸态氮氨基酸态氮的测定的测定双指示剂甲醛滴定法双指示剂甲醛滴定法电位滴定法电位滴定法一、氨基酸的一般定量测定方法一、氨基酸的一般定量测定方法第第48页页/共共72页页（一）双指示剂甲醛滴定法（一）双指示剂甲醛滴定法原理：原理：氨基酸具有酸性的氨基酸具有酸性的-COOH-COOH基和碱性的基和碱性的-NH-NH2 2基。基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，甲醛溶液时，-NH2-NH2基与甲醛结合，从而使其碱性消基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH-COOH基，基，用间接的方法测定氨基酸的总量。用间接的方法测定氨基酸的总量。第第49页页/共共72页页操作方法操作方法预处理：预处理：移取含氨基酸约移取含氨基酸约202030mg30mg的样品溶液的样品溶液2 2份份中和游离酸（用中性红作指示剂，先测定其它游离酸的含量）中和游离酸（用中性红作指示剂，先测定其它游离酸的含量）：其中其中1 1份加入份加入3 3滴中性红指示剂，用滴中性红指示剂，用0.1mol/L0.1mol/L氢氧化钠标准氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为溶液滴定至由红变为 琥珀琥珀 色为终点，记录色为终点，记录V1V1滴定氨态氮（用百里酚酞作指示剂测定氨基酸和游离酸的总滴定氨态氮（用百里酚酞作指示剂测定氨基酸和游离酸的总含量）：含量）：另另1 1份加入份加入3 3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20mL20mL，摇匀，静置，摇匀，静置1 1分钟，用分钟，用0.1mol/L0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点，氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点，记录记录V2V2第第50页页/共共72页页式中式中 c c 氢氧化钠标准溶液的浓度，氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L;mol/L;V V1 1用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，标准溶液的体积，mL;mL;V V2 2用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，钠标准溶液的体积，mL;mL;m m测定用样品溶液相当于样品的质量，测定用样品溶液相当于样品的质量，g g 0.014 0.014氮的毫摩尔质量，氮的毫摩尔质量，g/mmolg/mmol 结果计算结果计算第第51页页/共共72页页说明及注意事项说明及注意事项1 1、此法适用于测定食品中游离的氨基酸、此法适用于测定食品中游离的氨基酸2 2、固体样品应先进行粉碎，准确称取后用水萃、固体样品应先进行粉碎，准确称取后用水萃 取，取，5050水浴中萃取水浴中萃取0.5h0.5h即可。液体样品可直接进行测定。即可。液体样品可直接进行测定。3 3、若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用、若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用电位滴定法进行测定。电位滴定法进行测定。4 4、与本法类似的还有单指示剂（百里酚酞）甲醛滴定法，、与本法类似的还有单指示剂（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用标准碱完全中和此法用标准碱完全中和-COOH-COOH 时的时的pHpH为为8.59.58.59.5，但分，但分析结果稍偏低，即双指示剂法的结果更准确。析结果稍偏低，即双指示剂法的结果更准确。第第52页页/共共72页页二、电位滴定法 根据氨基的两性作用，加入甲醛以固定氨基根据氨基的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱的碱性，使羧基显示酸性，将酸度计的玻璃电极和甘汞性，使羧基显示酸性，将酸度计的玻璃电极和甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用电极同时插入被测液中构成电池，用NaOH NaOH 标准溶标准溶液滴定，根据酸度计指示的液滴定，根据酸度计指示的pH pH 值判断和控制滴定的值判断和控制滴定的终点。终点。pH8.29.2第第53页页/共共72页页第第54页页/共共72页页酸度计的使用操作规程酸度计的使用操作规程调节开关调节开关用缓冲溶液校正用缓冲溶液校正pHpH计计第第55页页/共共72页页清洗电极清洗电极 吸干电极上面的水吸干电极上面的水 把电极插入被测溶液中把电极插入被测溶液中第第56页页/共共72页页测定测定 清洗并擦干电极清洗并擦干电极第第57页页/共共72页页式中式中 W-W-氨基酸态氮质量浓度，氨基酸态氮质量浓度，%;%;c-c-氢氧化钠浓度，氢氧化钠浓度，mol/Lmol/L；V V1 1-加入甲醛后耗加入甲醛后耗NaOHNaOH的量，的量，mLmL；V V2 2-空白试验加甲醛后耗空白试验加甲醛后耗NaOHNaOH量，量，mLmL；0.014-0.014-氮的毫摩尔质量，氮的毫摩尔质量，g/molg/mol；m-m-样品量，样品量，g g第第58页页/共共72页页说明与注意事项说明与注意事项 本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定含量测定 对于混浊和色深样液可不经处理而直接测定。对于混浊和色深样液可不经处理而直接测定。结果要求精密度结果要求精密度10%10%，即在重复条件下两，即在重复条件下两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的10%10%。第第59页页/共共72页页（三）茚三酮比色法（三）茚三酮比色法 氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应）紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应）,该蓝紫色该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为吸收波长为570nm.570nm.第第60页页/共共72页页（七）乙酰丙酮和甲醛荧光法（七）乙酰丙酮和甲醛荧光法（六）三硝基苯磺酸法（六）三硝基苯磺酸法（四）非水溶液滴定法（四）非水溶液滴定法（五）邻苯二甲醛法（五）邻苯二甲醛法第第61页页/共共72页页二、个别氨基酸的定量测定方法二、个别氨基酸的定量测定方法（一）赖氨酸的测定（一）赖氨酸的测定 用铜离子阻碍游离氨基酸的用铜离子阻碍游离氨基酸的-氨基氨基,使赖使赖氨酸的氨酸的-氨基可以自由地与氨基可以自由地与1-1-氟氟-2,4-2,4 二硝基二硝基苯苯(FDNB)(FDNB)反应反应,生成生成-DNP-DNP-赖氨酸。经酸化和赖氨酸。经酸化和用二乙基醚提取用二乙基醚提取,在波长在波长390nm 390nm 处有吸收峰处有吸收峰,从从而求出样品中游离赖氨酸的含量而求出样品中游离赖氨酸的含量.第第62页页/共共72页页（二）色氨酸的测定（二）色氨酸的测定 样品中的蛋白质经碱水解后，游离的色氨酸与样品中的蛋白质经碱水解后，游离的色氨酸与甲醛和含铁离子的三氯乙酸溶液作用，生甲醛和含铁离子的三氯乙酸溶液作用，生成哈尔满化合物（成哈尔满化合物（norharmannorharman），具有特征荧光值，），具有特征荧光值，可以进行定量测定。可以进行定量测定。第第63页页/共共72页页（三）苯丙氨酸的测定（三）苯丙氨酸的测定 苯丙氨酸与茚三酮及铜盐反应生成荧光复合物，苯丙氨酸与茚三酮及铜盐反应生成荧光复合物，其荧光复合物在激发波长其荧光复合物在激发波长365nm365nm，发射波长，发射波长490nm 490nm 处可以产生最大荧光强度，与标准氨基酸对照，可处可以产生最大荧光强度，与标准氨基酸对照，可求出样品中苯丙氨酸的含量，检测时加入求出样品中苯丙氨酸的含量，检测时加入L-L-亮氨酸亮氨酸-L-L-丙氨酸二肽能增强这一反应。丙氨酸二肽能增强这一反应。第第64页页/共共72页页（四）酪氨酸的测定（四）酪氨酸的测定 酪氨酸和酪氨酸和1-1-亚硝酸亚硝酸-2-2-萘酚反应萘酚反应,生成有色化生成有色化合物合物,此化合物在硝酸和亚硝酸钠存在的条此化合物在硝酸和亚硝酸钠存在的条件下加热件下加热,产生稳定的荧光物质产生稳定的荧光物质,可用荧光法定量可用荧光法定量测定。测定。第第65页页/共共72页页（五）脯氨酸的测定（五）脯氨酸的测定 在丙酮溶剂中，脯氨酸与吲哚醌反应形成蓝色在丙酮溶剂中，脯氨酸与吲哚醌反应形成蓝色化合物，能用以测定蛋白质水解液中的脯氨酸含量，化合物，能用以测定蛋白质水解液中的脯氨酸含量，在一定条件下（包括在一定条件下（包括pHpH、缓冲液浓度和吲哚醌浓度）、缓冲液浓度和吲哚醌浓度），可以在其他氨基酸存在下直接进行测定，不受羟，可以在其他氨基酸存在下直接进行测定，不受羟脯氨酸的干扰。脯氨酸的干扰。第第66页页/共共72页页(六六)羟脯氨酸的测定羟脯氨酸的测定 羟脯氨酸在有过量丙氨酸（其作用是减少其他氨羟脯氨酸在有过量丙氨酸（其作用是减少其他氨基酸的干扰）的条件下，用氯胺基酸的干扰）的条件下，用氯胺 T T 氧化生成氧化生成，-吡吡咯啉咯啉-4-4-羟羟-2-2-羧酸和吡咯羧酸和吡咯-2-2-羧酸，它们不溶于甲苯，羧酸，它们不溶于甲苯，但将溶液加热处理后可溶于甲苯中。所以在加热前先但将溶液加热处理后可溶于甲苯中。所以在加热前先用甲苯除去其他物质，加热后再用甲苯把这些氧化产用甲苯除去其他物质，加热后再用甲苯把这些氧化产物抽提，最后用对物抽提，最后用对-二甲基苯甲醛试剂显色。在波长二甲基苯甲醛试剂显色。在波长560nm 560nm 处有最大的吸收值，可进行定量测定。处有最大的吸收值，可进行定量测定。第第67页页/共共72页页（七）胱氨酸的测定（七）胱氨酸的测定 用亚硫酸盐使胱氨酸还原为半胱氨酸和用亚硫酸盐使胱氨酸还原为半胱氨酸和S-S-半胱半胱氨酸磺酸，其他含二硫键的物质也被还原。通过巯基氨酸磺酸，其他含二硫键的物质也被还原。通过巯基被磷钨酸还原成钨蓝的反应测定半胱酸，从而定量出被磷钨酸还原成钨蓝的反应测定半胱酸，从而定量出胱氨酸。非胱氨酸的巯基可在加磷钨酸前先加氯化汞胱氨酸。非胱氨酸的巯基可在加磷钨酸前先加氯化汞与巯基结合。因反应与巯基结合。因反应pH pH 为为5 5，其他还原性物质如尿酸、，其他还原性物质如尿酸、抗坏血酸也使磷钨酸还原，通过空白对照加以去除。抗坏血酸也使磷钨酸还原，通过空白对照加以去除。第第68页页/共共72页页（八）谷氨酸的测定（八）谷氨酸的测定 L-L-谷氨酸在大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶作用谷氨酸在大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶作用下脱羧释放出二氧化碳，用华勃士呼吸仪由测下脱羧释放出二氧化碳，用华勃士呼吸仪由测压法测得二氧化碳放出量，计算出谷氨酸含量。压法测得二氧化碳放出量，计算出谷氨酸含量。第第69页页/共共72页页第七节第七节 氨基酸的分离及测定氨基酸的分离及测定 一薄层色谱法（薄层层析法（一薄层色谱法（薄层层析法（TLC TLC 法）法）第第70页页/共共72页页 二氨基酸自动分析仪法二氨基酸自动分析仪法第第71页页/共共72页页 三气相色谱法三气相色谱法四、液相色谱法液相色谱法第第72页页/共共72页页