蛋白质一级结构的测定方法培训课件

蛋白蛋白质一一级结构的构的测定方法定方法一、蛋白质一级结构定义一、蛋白质一级结构定义(primary structure)(primary structure)在每种蛋白质中氨基酸按照一定的数目和组成进在每种蛋白质中氨基酸按照一定的数目和组成进行排列，并进一步折叠成特定的空间结构前者我们行排列，并进一步折叠成特定的空间结构前者我们称为蛋白质的一级结构，也叫初级结构或基本结构。称为蛋白质的一级结构，也叫初级结构或基本结构。核心：蛋白质中共价连接的核心：蛋白质中共价连接的氨基酸氨基酸残基的排列顺序残基的排列顺序,包包括二硫键的位置。括二硫键的位置。意义：是理解蛋白质结构、作用机制以及与其同源蛋意义：是理解蛋白质结构、作用机制以及与其同源蛋白质生理功能的必要基础白质生理功能的必要基础。2蛋白质一级结构的测定方法蛋白质序列测定的基本战略和步骤蛋白质序列测定的基本战略和步骤l l一一一一 蛋白质序列测序的基本战略蛋白质序列测序的基本战略蛋白质序列测序的基本战略蛋白质序列测序的基本战略l l11、直接法（测蛋白质的序列）、直接法（测蛋白质的序列）、直接法（测蛋白质的序列）、直接法（测蛋白质的序列）l对于一个纯蛋白质，理想方法是从对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至端直接测至C端，端，但目前只能测但目前只能测60个个N端氨基酸。端氨基酸。l2 2、间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）、间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）、间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）、间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）l蛋白质化学家收集的一个蛋白质资料库（蛋白质化学家收集的一个蛋白质资料库（databaseordatabank）可以在）可以在AltasofProteinSequenceandStructure(Dayhoff,M.O.ed.1972-1978,Vols1-5,Washington,DC:NationalBiomedicalResearshFoundation)中找到。然而现在大多数蛋白质序列中找到。然而现在大多数蛋白质序列信息都信息都是从基因核苷酸序列（经过密码子）翻译成氨基酸序列的。是从基因核苷酸序列（经过密码子）翻译成氨基酸序列的。3蛋白质一级结构的测定方法l由于克隆核苷酸序列比测定核苷酸序列更快、由于克隆核苷酸序列比测定核苷酸序列更快、更有效、信息更多，因此有不少电子数据库问世，更有效、信息更多，因此有不少电子数据库问世，储存的序列资料以惊人的速度不断扩充，并且个储存的序列资料以惊人的速度不断扩充，并且个人电脑可以方便利用。如果现在需要确定一个新人电脑可以方便利用。如果现在需要确定一个新蛋白质的序列，研究者所做的第一件事就是将新蛋白质的序列，研究者所做的第一件事就是将新蛋白质的序列与数据库中的其它已知序列进行比蛋白质的序列与数据库中的其它已知序列进行比较，确定其中是否存在同源性。这些数据库中比较，确定其中是否存在同源性。这些数据库中比较有名的就是美国较有名的就是美国NationalBiomedicalResearshFoundation（国家生物医学研究基金（国家生物医学研究基金会）主持的会）主持的PIR（ProteinInformationResource，蛋白质信息库或，蛋白质信息库或ProteinIdentificationResouece蛋白质鉴定库）蛋白质鉴定库）,美国美国政府支持的政府支持的GeneBankGeneSequenceDataBank（基因序列数据库）（基因序列数据库），还有欧洲的，还有欧洲的EMBL（EuropeanMolecularBiologyLaboratory,欧洲分子生物学实验室数据库）。欧洲分子生物学实验室数据库）。l4蛋白质一级结构的测定方法lPDB(ProteinDataBank):蛋白质结构数据库蛋白质结构数据库lPDB原来有由美国原来有由美国Brookhaven国家实验室负国家实验室负责维护和管理，为适应结构基因组和生物信息学责维护和管理，为适应结构基因组和生物信息学研究的需要，研究的需要，1998年由美国国家科学基金委员会、年由美国国家科学基金委员会、能源部和卫生研究院资助，成立结构生物学合作能源部和卫生研究院资助，成立结构生物学合作研究协会（研究协会（ResearchCollaboratoryforStructureBioinformatics,RCSB）PDB由由RCSB管理。管理。lPDB是目前最主要的蛋白质分子结构数据库是目前最主要的蛋白质分子结构数据库5蛋白质一级结构的测定方法二、蛋白质一级结构的测定方法二、蛋白质一级结构的测定方法l研究蛋白质的一级结构从确定组成蛋白质的单元研究蛋白质的一级结构从确定组成蛋白质的单元结构从结构从氨基酸氨基酸算起，已有算起，已有150150年的悠久历史，直到年的悠久历史，直到19551955年，年，SangerSanger首次阐明胰岛素的氨基酸排列顺首次阐明胰岛素的氨基酸排列顺序，为研究蛋白质的一级结构开辟了道路。这在序，为研究蛋白质的一级结构开辟了道路。这在分子生物学的发展进程中是一个重要突破。分子生物学的发展进程中是一个重要突破。l目前关于核酸的一级结构研究，由于目前关于核酸的一级结构研究，由于SangerSanger等发等发明了加减法，可以得到了突飞猛进的发展。对比明了加减法，可以得到了突飞猛进的发展。对比之下，关于蛋白质的一级结构研究进展不如核酸之下，关于蛋白质的一级结构研究进展不如核酸迅速。迅速。6蛋白质一级结构的测定方法l但随着但随着EdmanEdman液相自动顺序分析仪和固相顺序分析仪液相自动顺序分析仪和固相顺序分析仪以及气相色谱、质谱以及气相色谱、质谱(GC(GCMS)MS)等方法的相继出现。等方法的相继出现。使结构分析的速度也显著加快。至今已完成近千种使结构分析的速度也显著加快。至今已完成近千种蛋白质的一级结构分析。目前不仅样品用量减少，蛋白质的一级结构分析。目前不仅样品用量减少，而且工作人员也大大减少。而且工作人员也大大减少。l当年当年SangerSanger分析胰岛素用了整整十年的时间，今天分析胰岛素用了整整十年的时间，今天运用自动化仪器，分析一个分子量在运用自动化仪器，分析一个分子量在1010万左右的蛋万左右的蛋白质只需要几天，可见新技术的应用和发展对科学白质只需要几天，可见新技术的应用和发展对科学发展起的促进作用，蛋白质一级结构测定方法的综发展起的促进作用，蛋白质一级结构测定方法的综述及专著文献较多。述及专著文献较多。7蛋白质一级结构的测定方法三三 测定前的准备工作测定前的准备工作测序前的准备工作测序前的准备工作测序前的准备工作测序前的准备工作：蛋白质的纯度鉴定蛋白质的纯度鉴定蛋白质的纯度鉴定蛋白质的纯度鉴定要求：要求：纯度纯度纯度纯度97%97%97%97%以上，均一。以上，均一。以上，均一。以上，均一。鉴定方法：鉴定方法：聚聚聚聚丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺凝凝凝凝胶胶胶胶电电电电泳泳泳泳(PAGE)(PAGE)(PAGE)(PAGE)要求一条带，双向电泳。要求一条带，双向电泳。要求一条带，双向电泳。要求一条带，双向电泳。DNSClDNSClDNSClDNSCl（二二二二甲甲甲甲氨氨氨氨基基基基萘萘萘萘磺酰氯）法测磺酰氯）法测磺酰氯）法测磺酰氯）法测N N N N端氨基酸。端氨基酸。端氨基酸。端氨基酸。(3)(3)(3)(3)亲和层析亲和层析亲和层析亲和层析 (4)western (4)western (4)western (4)western 印迹法等印迹法等印迹法等印迹法等测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量估算氨基酸残基数，确定肽估算氨基酸残基数，确定肽链数链数 方法：方法：SDS-PAGE SDS-PAGE，凝胶过，凝胶过滤法，沉降系数法滤法，沉降系数法8蛋白质一级结构的测定方法及测定的一般步骤及测定的一般步骤蛋白质分子的一级结构测定，概括起来包含多蛋白质分子的一级结构测定，概括起来包含多肽链的分离、降解、肽段的分离和顺序分析以肽链的分离、降解、肽段的分离和顺序分析以及及SS定位等。定位等。9蛋白质一级结构的测定方法l l蛋白质测序的一般步骤蛋白质测序的一般步骤蛋白质测序的一般步骤蛋白质测序的一般步骤l（1）测定蛋白质分子中多肽链的数目。测定蛋白质分子中多肽链的数目。l（2）拆分蛋白质分子中的多肽链。拆分蛋白质分子中的多肽链。l（3）断裂链内二硫键。断裂链内二硫键。l（4）分析多肽链的分析多肽链的N末端和末端和C末端。末端。l（5）测定多肽链的氨基酸组成。测定多肽链的氨基酸组成。l（6）多肽链部分裂解成肽段。多肽链部分裂解成肽段。l（7）测定各个肽段的氨基酸顺序测定各个肽段的氨基酸顺序l（8）确定肽段在多肽链中的顺序。确定肽段在多肽链中的顺序。l（9）确定多肽链中二硫键的位置。确定多肽链中二硫键的位置。10蛋白质一级结构的测定方法一级结构的测定方法一级结构的测定方法1.多肽链的分离多肽链的分离1）肽链的拆开）肽链的拆开蛋白质分子多肽链的连接有共价结合和非共蛋白质分子多肽链的连接有共价结合和非共价结合两种。要拆开以共价结合的价结合两种。要拆开以共价结合的-S-S-连接的多连接的多肽链，采用的化学处理方法有：肽链，采用的化学处理方法有：11蛋白质一级结构的测定方法过甲酸氧化过甲酸氧化 12蛋白质一级结构的测定方法巯基乙醇还原巯基乙醇还原 13蛋白质一级结构的测定方法Clelands试剂的还原作用试剂的还原作用 14蛋白质一级结构的测定方法稳定稳定SH基的方法：基的方法：（A）烷基化试剂使烷基化试剂使SH基转变为稳定的硫醚衍生物基转变为稳定的硫醚衍生物15蛋白质一级结构的测定方法稳定稳定SH基的方法：基的方法：（B）氨乙基化）氨乙基化16蛋白质一级结构的测定方法l非共价结合非共价结合l尿素，尿素，SDS-PAGE，盐酸胍，盐酸胍，高高浓度的盐浓度的盐17蛋白质一级结构的测定方法2）末端分析）末端分析（1）N-末端测定末端测定A.二硝基氟苯法二硝基氟苯法(FDNB，DNFB)18蛋白质一级结构的测定方法19蛋白质一级结构的测定方法（1）N-末端测定末端测定 B.氰酸盐法氰酸盐法异硫氰酸苯酯（异硫氰酸苯酯（PTC或或PITC）与）与N末端的末端的氨基发生的反应，生成氨基发生的反应，生成PTC钛钛,在弱酸在弱酸中自发环化转变成中自发环化转变成PTH衍生物。该试剂衍生物。该试剂称为称为Edman试剂。试剂。由于由于PTH衍生物从多肽链上脱落下来衍生物从多肽链上脱落下来对其余部分没有影响，所以常用来测定蛋对其余部分没有影响，所以常用来测定蛋白质的一级结构。白质的一级结构。20蛋白质一级结构的测定方法21蛋白质一级结构的测定方法（1）N-末端测定末端测定 C.二甲基氨基萘磺酰氯法二甲基氨基萘磺酰氯法 在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯氯DNS-Cl）可以与）可以与N-端氨基酸的游离氨基端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰作用，得到丹磺酰-肽。肽。此法的优点是丹磺酰此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到性质，检测灵敏度可以达到1 10-9mol。22蛋白质一级结构的测定方法23蛋白质一级结构的测定方法氨肽酶法氨肽酶法l氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的的N-端逐个的向里水解。根据不同的反应端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残末端残基顺序。基顺序。l最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。末端的肽键速度最大。24蛋白质一级结构的测定方法2）末端分析）末端分析（2）C-末端分析末端分析A.肼解法肼解法 无水肼无水肼NHNH2 2NHNH2 2 100 5-10h 100 5-10h。苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C C端游离氨基酸端游离氨基酸留在上清中。留在上清中。GlnGln（谷氨酰胺）、（谷氨酰胺）、AsnAsn（天冬酰胺）、（天冬酰胺）、CysCys（半胱氨酸）、（半胱氨酸）、ArgArg（精氨酸）不能产（精氨酸）不能产生游离的羧基末端生游离的羧基末端aaaa。25蛋白质一级结构的测定方法26蛋白质一级结构的测定方法（2）C-末端分析末端分析B.羧肽酶水解法羧肽酶水解法 羧肽酶可以专一性地水解羧基末端氨基酸。根羧肽酶可以专一性地水解羧基末端氨基酸。根据酶解的专一性不同，可区分为羧肽酶据酶解的专一性不同，可区分为羧肽酶A、B和和C。应用羧肽酶测定末端时，需要事先进行酶的动力学应用羧肽酶测定末端时，需要事先进行酶的动力学实验，以便选择合适的酶浓度及反应时间，使释放实验，以便选择合适的酶浓度及反应时间，使释放出的氨基酸主要是出的氨基酸主要是C末端氨基酸。末端氨基酸。27蛋白质一级结构的测定方法羧肽酶羧肽酶法测法测C C 末端末端羧肽酶法羧肽酶法羧肽酶法羧肽酶法羧肽酶羧肽酶A A：除除ProPro、ArgArg（精氨酸）、（精氨酸）、LysLys（赖氨酸）外的所有（赖氨酸）外的所有C C端氨基端氨基酸酸羧肽酶羧肽酶B B：只水解：只水解ArgArg、LysLys28蛋白质一级结构的测定方法C-C-末端分析末端分析C.C-C.C-端氨基酸选择性氚标记法：端氨基酸选择性氚标记法：使用氚标记是测定使用氚标记是测定C-C-端氨基酸最好的办法，专端氨基酸最好的办法，专一性强，灵敏度高，但是这种方法不能用于一性强，灵敏度高，但是这种方法不能用于C-C-端端脯氨酸（脯氨酸（ProPro）和天冬氨酸（）和天冬氨酸（AspAsp）还原法：利用硼氢化锂将还原法：利用硼氢化锂将C-C-端氨基酸还原成端氨基酸还原成氨基醇。然后碱多肽水解，用色谱法鉴定氨基醇。然后碱多肽水解，用色谱法鉴定氨基醇的类别。氨基醇的类别。29蛋白质一级结构的测定方法酸水解酸水解酸水解酸水解 常用常用6 mol/L6 mol/L的盐酸或的盐酸或4 mol/L4 mol/L的硫酸（磺酸）在的硫酸（磺酸）在105-110105-110条件下进行水解，反应时间约条件下进行水解，反应时间约2020小时。近年来小时。近年来用用4 mol/L4 mol/L的甲基磺酸代替盐酸，效果比较好，被广泛应的甲基磺酸代替盐酸，效果比较好，被广泛应用。用。此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是缺点是色氨酸色氨酸被沸酸完全破坏，被沸酸完全破坏，含有羟基的氨基酸如丝氨含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；酸或苏氨酸有一小部分被分解；天门冬酰胺和谷氨酰胺天门冬酰胺和谷氨酰胺侧侧链的酰胺基被水解成了羧基。链的酰胺基被水解成了羧基。-COO+3）氨基酸组成分析）氨基酸组成分析30蛋白质一级结构的测定方法碱水解碱水解碱水解碱水解 一般用一般用5 mol/L5 mol/L氢氧化钠于真空或充氮条件氢氧化钠于真空或充氮条件下进行，下进行，1101100 0C C煮沸煮沸10-2010-20小时。小时。由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。部分的水解破坏，产率不高。部分的水解产物发生消旋化产物发生消旋化。该法的优点是该法的优点是色氨酸色氨酸在水解中不受破坏。在水解中不受破坏。31蛋白质一级结构的测定方法酶法裂解酶法裂解酶法裂解酶法裂解胰蛋白酶胰蛋白酶 （赖氨酸）（赖氨酸）LysX LysX （精氨酸）（精氨酸）Arg X(X Pro)Arg X(X Pro)胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶 （糜蛋白酶）（糜蛋白酶）（酪氨酸）（酪氨酸）TyrX TyrX（色氨酸）（色氨酸）TrpX TrpX （苯丙氨酸）（苯丙氨酸）PheX(X Pro)PheX(X Pro)嗜热菌蛋白酶嗜热菌蛋白酶 X-Leu X-Leu（亮氨酸）（亮氨酸）,Ile,Ile（异亮氨酸）（异亮氨酸）,Phe,Phe（苯丙氨酸）（苯丙氨酸）,TrpTrp（色氨酸），（色氨酸），ValVal（缬氨酸）（缬氨酸）,Tyr,Tyr（酪氨酸），（酪氨酸），MetMet（甲硫氨酸）（甲硫氨酸）胃蛋白酶胃蛋白酶 Phe Phe（苯丙氨酸）（苯丙氨酸），TrpTrp（色氨酸）（色氨酸）Tyr Tyr（酪氨酸），（酪氨酸），Leu Leu（亮氨酸）（亮氨酸）X X 不能水解不能水解ProPro羧基参与形成的肽键。羧基参与形成的肽键。GluGlu蛋白酶蛋白酶GluGlu（谷氨酸）（谷氨酸）XXArgArg蛋白酶蛋白酶 Arg Arg（精氨酸）（精氨酸）XXLysLys蛋白酶蛋白酶 XLys XLys（赖氨酸）（赖氨酸）ProPro蛋白酶蛋白酶 ProX ProX32蛋白质一级结构的测定方法 氨基酸的分离和含量测定氨基酸的分离和含量测定氨基酸的颜色反应：紫色在570nm比色茚三酮与Pro生成黄色产物，在440nm比色33蛋白质一级结构的测定方法层析层析l基于不同物质在流动相和固定相之间的分基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。当配系数不同而将混合组分分离的技术。当流动相流动相(液体或气体液体或气体)流经固定相流经固定相(多孔的固多孔的固体或覆盖在固体支持物上的液体体或覆盖在固体支持物上的液体)时，各组时，各组分沿固定相移动的速度不同而分离。能用分沿固定相移动的速度不同而分离。能用于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。34蛋白质一级结构的测定方法氨基酸的分离l色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。终达到分离的效果。l色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之间的分配会不同，这使其随流动相运动速度各不间的分配会不同，这使其随流动相运动速度各不相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。根据物质的分离机制，又在固定相上相互分离。根据物质的分离机制，又可以分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、可以分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等类别。凝胶色谱、亲和色谱等类别。l 35蛋白质一级结构的测定方法薄膜层析薄膜层析 将多肽链完全酸水解成游离氨基酸，然将多肽链完全酸水解成游离氨基酸，然后进行后进行Dansyl标记，聚酰胺薄膜层析，此标记，聚酰胺薄膜层析，此方法在蛋白质结构分析中是一种超微量的方法在蛋白质结构分析中是一种超微量的分析术，但此方法用于定量分析尚不够准分析术，但此方法用于定量分析尚不够准确。确。36蛋白质一级结构的测定方法氨基酸自动分析仪就是利用氨基酸自动分析仪就是利用离子交换离子交换的的方法方法l离子交换色谱法：利用离子交换原理和液离子交换色谱法：利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法，利用被分离阴离子的一种分离分析方法，利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱主要是用来异来实现分离。离子交换色谱主要是用来分离离子或可离解的化合物。它不仅广泛分离离子或可离解的化合物。它不仅广泛地应用于无机离子的分离，而且广泛地应地应用于无机离子的分离，而且广泛地应用于有机和生物物质，如氨基酸、核酸、用于有机和生物物质，如氨基酸、核酸、蛋白质等的分离。蛋白质等的分离。37蛋白质一级结构的测定方法 氨基酸自动分析仪就是利用氨基酸自动分析仪就是利用离子交换离子交换的方法的方法 若要测定某蛋白质样品的氨基酸组成，事先若要测定某蛋白质样品的氨基酸组成，事先把样品经酸水解，调节水解液的把样品经酸水解，调节水解液的pHpH为为3 3，使所有的，使所有的氨基酸都带负电荷，由于各种氨基酸侧链基团的氨基酸都带负电荷，由于各种氨基酸侧链基团的复杂性，各种复杂性，各种氨基酸所带的电荷强度差异比较大氨基酸所带的电荷强度差异比较大，pH3pH3时时,对于酸性氨基酸来说虽然也带正电荷，但对于酸性氨基酸来说虽然也带正电荷，但由于谷氨酸由于谷氨酸-羧基和天冬氨酸的羧基和天冬氨酸的-羧基，都有羧基，都有不同程度的离解，导致整个分子偏中性，对于碱不同程度的离解，导致整个分子偏中性，对于碱性氨基酸来说，本来结合质子的能力就很强，此性氨基酸来说，本来结合质子的能力就很强，此时，它所带的正点荷强度就更大。时，它所带的正点荷强度就更大。酸水解破坏了色氨酸、使谷酰胺和天冬酰胺酸水解破坏了色氨酸、使谷酰胺和天冬酰胺转变为相应的谷氨酸和天冬氨酸。为了分离效果转变为相应的谷氨酸和天冬氨酸。为了分离效果好，在洗脱过程中，使用不同好，在洗脱过程中，使用不同pHpH和离子强度的洗和离子强度的洗脱液。经氨基酸自动分析仪洗脱下来的氨基酸，脱液。经氨基酸自动分析仪洗脱下来的氨基酸，按顺序进行染色，由记录仪自动描绘出各种氨基按顺序进行染色，由记录仪自动描绘出各种氨基酸的光吸收图谱。酸的光吸收图谱。38蛋白质一级结构的测定方法3）氨基酸组成分析）氨基酸组成分析离子交换层析法离子交换层析法 39蛋白质一级结构的测定方法l离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。的运动而运动，最终实现分离。40蛋白质一级结构的测定方法41蛋白质一级结构的测定方法 各种氨基酸侧链基团的性质对于氨基酸与离子各种氨基酸侧链基团的性质对于氨基酸与离子交换树脂，结合的情况有相当复杂的影响。在氨基酸交换树脂，结合的情况有相当复杂的影响。在氨基酸自动分析仪的记录上可以看出：天冬氨酸（自动分析仪的记录上可以看出：天冬氨酸（pIpI为为2.982.98）最先随洗脱液下来，赖氨酸（）最先随洗脱液下来，赖氨酸（pIpI为为9.749.74）最后）最后下来，三个中性氨基酸如下来，三个中性氨基酸如:甘氨酸（甘氨酸（pIpI为为5.975.97）、苏）、苏氨酸（氨酸（pIpI为为6.536.53）和亮氨酸（）和亮氨酸（pIpI为为5.985.98）洗脱的顺序）洗脱的顺序又如何呢又如何呢?苏氨酸应当带有较多的正电荷，与树脂结苏氨酸应当带有较多的正电荷，与树脂结合比较紧，不易被洗脱下来，但是由于羟基具有极性，合比较紧，不易被洗脱下来，但是由于羟基具有极性，减弱了树脂对氨基酸的吸引力。所以反而比甘氨酸和减弱了树脂对氨基酸的吸引力。所以反而比甘氨酸和亮氨酸后被洗脱下来。甘氨酸和亮氨酸相比，亮氨酸亮氨酸后被洗脱下来。甘氨酸和亮氨酸相比，亮氨酸侧链疏水性强，与树脂结合紧，后甘氨酸被洗脱下来。侧链疏水性强，与树脂结合紧，后甘氨酸被洗脱下来。综上所述：影响离子交换树脂分离氨基酸的因综上所述：影响离子交换树脂分离氨基酸的因素：素：（1 1）氨基酸分子所带的电荷；）氨基酸分子所带的电荷；（2 2）氨基酸分子的极性；）氨基酸分子的极性；（3 3）氨基酸分子的形状和大小。）氨基酸分子的形状和大小。42蛋白质一级结构的测定方法3 3 特殊氨基酸的测定特殊氨基酸的测定 巯基：巯基：SH ,Cys SH ,Cys（半胱氨酸）（半胱氨酸）特性：弱酸性特性：弱酸性 pKa=10.28 pKa=10.28；具有极强的还原性，两个；具有极强的还原性，两个半胱氨酸的巯基靠近脱氢形成二硫键。半胱氨酸的巯基靠近脱氢形成二硫键。pKa(电离程度电离程度)反应：反应：与卤代烃，如：苄氧、碘乙酰胺，反应生成稳与卤代烃，如：苄氧、碘乙酰胺，反应生成稳定的烃基衍生物。该反应常用于对巯基的保护。定的烃基衍生物。该反应常用于对巯基的保护。与各种金属形成稳定性不同的络合物，该反应与各种金属形成稳定性不同的络合物，该反应在研究蛋白质结构，制备蛋白质晶体过程中具有重要作用。在研究蛋白质结构，制备蛋白质晶体过程中具有重要作用。与某些重金属生成不溶性的硫酸盐，导致蛋白与某些重金属生成不溶性的硫酸盐，导致蛋白质失活。质失活。与硝基苯甲酸二硫化合物（与硝基苯甲酸二硫化合物（DTNBDTNB）反应，生成）反应，生成的产物在的产物在412 nm412 nm处有强烈的光吸收，应用该反应可以用比色处有强烈的光吸收，应用该反应可以用比色法测定半胱氨酸的含量。法测定半胱氨酸的含量。在强氧化剂，如过氧甲酸的作用下，半胱氨酸在强氧化剂，如过氧甲酸的作用下，半胱氨酸的巯基和胱氨酸的二硫键都可被氧化生成磺基丙氨酸。的巯基和胱氨酸的二硫键都可被氧化生成磺基丙氨酸。43蛋白质一级结构的测定方法 羟基：羟基：SerSer（丝氨酸），（丝氨酸），ThrThr（苏氨酸），（苏氨酸），OHOH 特性：在一般条件下，丝氨酸和苏氨酸分子中的羟基特性：在一般条件下，丝氨酸和苏氨酸分子中的羟基都不解离。都不解离。反应：反应：与酸作用生成酯，如丝氨酸磷酯，蛋白质的与酸作用生成酯，如丝氨酸磷酯，蛋白质的磷酸化绝大多数都发生在丝氨酸残基上。磷酸化绝大多数都发生在丝氨酸残基上。许多种酰化剂能够与酶活性中心的丝氨酸羟许多种酰化剂能够与酶活性中心的丝氨酸羟基作用，导致酶失活。基作用，导致酶失活。酪氨酸的酚基可与酪氨酸的酚基可与FolinFolin反应的基础，可作反应的基础，可作为蛋白质定量。为为蛋白质定量。为MillonMillon反应的基础。反应的基础。44蛋白质一级结构的测定方法 咪唑基：咪唑基：HisHis（组氨酸）（组氨酸）,特性：在生理条件（特性：在生理条件（pH 7pH 7）下，组氨酸的咪唑基具有）下，组氨酸的咪唑基具有缓冲作用。这是因为咪唑基一侧的去质子化和另一侧的质子缓冲作用。这是因为咪唑基一侧的去质子化和另一侧的质子化作用同步进行。化作用同步进行。pH 6 pH 6 时，时，50 50质子化，质子化，pH 7 pH 7时，时，9090去去质子化。也就是说，在生理条件（质子化。也就是说，在生理条件（pH 7pH 7）下，组氨酸的咪唑）下，组氨酸的咪唑基既可以作为质子的受体，也可以作为质子的供体。因此组基既可以作为质子的受体，也可以作为质子的供体。因此组氨酸在酶催化作用中，起非常重要的作用。氨酸在酶催化作用中，起非常重要的作用。反应：反应：Pauly反应（反应（对氨基苯磺酸的重氮盐对氨基苯磺酸的重氮盐，红色产物）胍基：胍基：ArgArg（精氨酸）（精氨酸）特性特性:具有很强的碱性。具有很强的碱性。反应：与板口试剂（萘酚、次溴酸盐）反应生成红色，反应：与板口试剂（萘酚、次溴酸盐）反应生成红色，该反应是鉴定精氨酸存在的定性反应。也可用于定量测定该反应是鉴定精氨酸存在的定性反应。也可用于定量测定45蛋白质一级结构的测定方法甲硫基：甲硫基：Met Met（甲硫氨酸）（甲硫氨酸）,S SCHCH3 3 特性：甲硫氨基酸侧链上的甲硫基是一个强的亲核中心，特性：甲硫氨基酸侧链上的甲硫基是一个强的亲核中心，容易与卤代烷发生亲核反应，生成烷基化产物。该种产物容易与卤代烷发生亲核反应，生成烷基化产物。该种产物用巯基试剂处理可以除去烷基和原有的甲基，因此与带有用巯基试剂处理可以除去烷基和原有的甲基，因此与带有1414C C标记的碘甲烷反应，再用巯基试剂处理能够得到含有同标记的碘甲烷反应，再用巯基试剂处理能够得到含有同位素位素1414C C标记的甲硫氨酸。标记的甲硫氨酸。46蛋白质一级结构的测定方法2.多肽链的降解多肽链的降解1）化学法）化学法l溴化氢法 溴化氰溴化氰lMet（甲硫氨酸）（甲硫氨酸）X 47蛋白质一级结构的测定方法溴化氢化学降解法其优点：溴化氢化学降解法其优点：一般蛋白质含甲硫氨酸较少，由此可获得大片段一般蛋白质含甲硫氨酸较少，由此可获得大片段专一性强专一性强产率高达产率高达80%以上以上作用条件温和，在室温中用几到十几小时即可作用条件温和，在室温中用几到十几小时即可48蛋白质一级结构的测定方法1）化学法）化学法羟胺法 这种方法近十年来开始受人注意，羟胺能专一性地裂这种方法近十年来开始受人注意，羟胺能专一性地裂解解Asn（天冬酰胺）（天冬酰胺）-Glu（谷氨酸）的肽键，酸性条件下（谷氨酸）的肽键，酸性条件下裂解裂解Asn-Pro肽键。已用于某些蛋白质的分析。肽键。已用于某些蛋白质的分析。lAsn（天冬酰胺）（天冬酰胺）Leu（亮氨酸）（亮氨酸）Asn（天冬酰胺）（天冬酰胺）Ala（丙氨酸）（丙氨酸）N-溴代琥珀酰亚胺法溴代琥珀酰亚胺法主要裂解主要裂解Tyr（酪氨酸）处的肽键，五十年代研究较（酪氨酸）处的肽键，五十年代研究较多。但由于它也能断裂多。但由于它也能断裂Tyr（酪氨酸）（酪氨酸）His(组氨酸组氨酸)肽肽键，因此应用不广。键，因此应用不广。49蛋白质一级结构的测定方法lNTCB（2-硝基硝基-5-硫氰苯甲酸）硫氰苯甲酸）lXCys（半胱氨酸）（半胱氨酸）XCys（半胱氨酸）键的裂解：（半胱氨酸）键的裂解：l2硝基硝基5硫氰苯甲酸（硫氰苯甲酸（NTCB）和）和2甲基甲基N1苯磺酰苯磺酰N4（溴乙酰）（溴乙酰）醌二亚酰胺（也称醌二亚酰胺（也称Cyssor，专切半胱氨酸），专切半胱氨酸）l亚碘酰基苯甲酸亚碘酰基苯甲酸Trp（色氨酸）（色氨酸）X产率产率70-100%50蛋白质一级结构的测定方法1）化学法）化学法（2）部分酸水解法）部分酸水解法Sanger在分析胰岛素的一级结构中采用了此在分析胰岛素的一级结构中采用了此法，即用法，即用0.1N盐酸在盐酸在110或用或用6N盐酸在盐酸在37水水解。这种部分酸水解的方法特异性不强，因此对解。这种部分酸水解的方法特异性不强，因此对大片段的蛋白质和肽均不合适。大片段的蛋白质和肽均不合适。51蛋白质一级结构的测定方法优点：优点：专一性高，降解后的多肽容易纯化，产率高，副作用小专一性高，降解后的多肽容易纯化，产率高，副作用小。注意事项：注意事项：适合酶作用的温度和酸碱度（适合酶作用的温度和酸碱度（pHpH），反应时间。），反应时间。酶的用量，待裂解蛋白质的物理状态。缓冲溶液的离子酶的用量，待裂解蛋白质的物理状态。缓冲溶液的离子强度等强度等酶裂解前需要作预备实验，掌握好各种条件。酶裂解前需要作预备实验，掌握好各种条件。2.多肽链的降解多肽链的降解 2）酶解法）酶解法52蛋白质一级结构的测定方法胰胰蛋蛋白白酶酶Trypsin ：R1=R1=赖氨酸赖氨酸LysLys和精氨和精氨酸酸ArgArg侧链（专一性较强，水解侧链（专一性较强，水解速度快）。速度快）。53蛋白质一级结构的测定方法糜糜蛋蛋白白酶酶或或胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶Chymotrypsin：（：（糜蛋糜蛋白酶白酶）对疏水性氨基酸水解速对疏水性氨基酸水解速度比较快。度比较快。R R1 1=苯丙氨酸苯丙氨酸Phe,Phe,色氨色氨酸酸Trp,Trp,酪氨酸酪氨酸Tyr;Tyr;亮氨亮氨酸酸LeuLeu，蛋氨酸，蛋氨酸MetMet和组氨和组氨酸酸HisHis水解稍慢。水解稍慢。54蛋白质一级结构的测定方法胃胃蛋蛋白白酶酶 水解专一性比较广。水解专一性比较广。Pepsin：R R1 1和和/或或R R2 2=苯苯丙氨酸丙氨酸Phe,Phe,色氨酸色氨酸Trp,Trp,酪氨酸酪氨酸Tyr;Tyr;亮氨酸亮氨酸LeuLeu以及其它疏水性氨基酸以及其它疏水性氨基酸水解速度较快水解速度较快55蛋白质一级结构的测定方法嗜嗜热热菌菌蛋蛋白白酶酶 中性金属酶它的专一性取决于氨基参与形成的中性金属酶它的专一性取决于氨基参与形成的肽键。肽键。thermolysin：R R2 2=苯丙氨酸苯丙氨酸Phe,Phe,色氨酸色氨酸Trp,Trp,酪氨酪氨酸酸Tyr;Tyr;亮氨酸亮氨酸LeuLeu，异亮氨酸，异亮氨酸Ileu,Ileu,甲硫氨酸甲硫氨酸MetMet以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。56蛋白质一级结构的测定方法l金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌Glu蛋白酶蛋白酶lGluXl谷氨酸羧基端参与形成的肽键。谷氨酸羧基端参与形成的肽键。l梭菌梭菌Arg蛋白酶蛋白酶(clostripain)lArgXl精氨酸羧基端参与形成的肽键。精氨酸羧基端参与形成的肽键。lLys蛋白酶蛋白酶lXLysl赖氨酸氨基端参与形成的肽键。赖氨酸氨基端参与形成的肽键。l小羊肾小羊肾Pro蛋白酶蛋白酶ProX57蛋白质一级结构的测定方法胰蛋白酶胰蛋白酶（赖氨酸）（赖氨酸）LysX，（精氨酸），（精氨酸）ArgX(XPro)胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）（糜蛋白酶）（酪氨酸）（酪氨酸）TyrX，（色氨酸），（色氨酸）TrpX（苯丙氨酸）（苯丙氨酸）PheX(XPro)嗜热菌蛋白酶嗜热菌蛋白酶X-Leu（亮氨酸）（亮氨酸）,Ile（异亮氨酸）（异亮氨酸）,Phe（苯丙氨酸）（苯丙氨酸）,Trp（色氨酸），（色氨酸），Val（缬氨酸）（缬氨酸）,Tyr（酪氨酸），（酪氨酸），Met（甲硫氨酸）（甲硫氨酸）2）酶解法）酶解法58蛋白质一级结构的测定方法酶法裂解酶法裂解酶法裂解酶法裂解胃蛋白酶胃蛋白酶 Phe Phe（苯丙氨酸）（苯丙氨酸），TrpTrp（色氨酸）（色氨酸）Tyr Tyr（酪氨酸），（酪氨酸），Leu Leu（亮氨酸）（亮氨酸）X X 不能水不能水解解ProPro羧基参与形成的肽键。羧基参与形成的肽键。GluGlu蛋白酶蛋白酶GluGlu（谷氨酸）（谷氨酸）XXArgArg蛋白酶蛋白酶 Arg Arg（精氨酸）（精氨酸）XXLysLys蛋白酶蛋白酶 XLys XLys（赖氨酸）（赖氨酸）ProPro蛋白酶蛋白酶 ProX ProX59蛋白质一级结构的测定方法氨基酸的修饰与保护氨基酸的修饰与保护（1）赖氨酸的修饰）赖氨酸的修饰胰蛋白酶胰蛋白酶60蛋白质一级结构的测定方法2）酶解法）酶解法（1）赖氨酸的修饰）赖氨酸的修饰蛋白质中的赖氨酸，经顺丁烯酰化作用后，被胰蛋白质中的赖氨酸，经顺丁烯酰化作用后，被胰蛋白酶水解蛋白酶水解 61蛋白质一级结构的测定方法2）氨基酸的修饰与保护氨基酸的修饰与保护（2）精氨酸的修饰胰蛋白酶胰蛋白酶62蛋白质一级结构的测定方法2）酶解法）酶解法（3）半胱氨酸的修饰 63蛋白质一级结构的测定方法l肽链的裂解和重组大致有三种情况：一种肽链的裂解和重组大致有三种情况：一种是非特异性裂解，如酸水解。由于裂解的是非特异性裂解，如酸水解。由于裂解的片段较小，造成分离的困难。因此这种非片段较小，造成分离的困难。因此这种非特异性裂解对大分子肽链是不适用的。第特异性裂解对大分子肽链是不适用的。第二种是特异性裂解，采用两种以上的专一二种是特异性裂解，采用两种以上的专一裂解，然后进行组合，这种方法一般也适裂解，然后进行组合，这种方法一般也适用于分子量小于用于分子量小于5万的蛋白质。第三种是逐万的蛋白质。第三种是逐步的专一裂解，首先将某种氨基酸进行化步的专一裂解，首先将某种氨基酸进行化学修饰，使水解酶专一断裂某一种氨基酸，学修饰，使水解酶专一断裂某一种氨基酸，分成若干片段，然后解除化学封闭，再用分成若干片段，然后解除化学封闭，再用此酶裂解，使曾被封闭过的氨基酸断裂。此酶裂解，使曾被封闭过的氨基酸断裂。目前倾向于采用这种裂解方式。目前倾向于采用这种裂解方式。64蛋白质一级结构的测定方法大部分肽段的分离主要通过大部分肽段的分离主要通过凝胶过滤法凝胶过滤法，由于大分子，由于大分子肽溶解度小。往往采用甲酸、醋酸、丙酸等有机溶剂使之肽溶解度小。往往采用甲酸、醋酸、丙酸等有机溶剂使之溶解。单用凝胶过滤法分离肽段一般纯度不高，常需辅以溶解。单用凝胶过滤法分离肽段一般纯度不高，常需辅以离子交换层析法离子交换层析法，大片段肽可用离子交换葡聚糖作载体，大片段肽可用离子交换葡聚糖作载体，小肽则多用小肽则多用Dowex-50等树脂。等树脂。小肽分离还常采用高压电泳与层析相结合的指纹图谱法，得小肽分离还常采用高压电泳与层析相结合的指纹图谱法，得到纯净肽到纯净肽 3 3 肽段的分离和纯度鉴定肽段的分离和纯度鉴定65蛋白质一级结构的测定方法凝胶过滤法凝胶过滤法l凝胶过滤法又称分子排阻法，凝胶过滤法又称分子排阻法，这是一种高效分离这是一种高效分离纯化蛋白质的方法。原理是不同的蛋白质分子对纯化蛋白质的方法。原理是不同的蛋白质分子对固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力。选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合能力。选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载合作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价链接。将这种有配基的载体装入层析柱中，体共价链接。将这种有配基的载体装入层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其他蛋白质则流出柱外。被特异性结合在上，而其他蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗脱脱66蛋白质一级结构的测定方法离子交换层析离子交换层析l固定相是离子交换剂的层析分离技术。样固定相是离子交换剂的层析分离技术。样品中待分离的溶质离子，与固定相上所结品中待分离的溶质离子，与固定相上所结合的离子交换，不同的溶质离子与离子交合的离子交换，不同的溶质离子与离子交换剂上离子化的基团的亲和力和结合条件换剂上离子化的基团的亲和力和结合条件不同，洗脱液流过时，样品中的离子按结不同，洗脱液流过时，样品中的离子按结合力的弱强先后洗脱。在生物化学和分子合力的弱强先后洗脱。在生物化学和分子生物学领域此法常用于分离蛋白质、核酸生物学领域此法常用于分离蛋白质、核酸等生物大分子。等生物大分子。67蛋白质一级结构的测定方法l支持物是人工交联的带有能解离基团的有机高分支持物是人工交联的带有能解离基团的有机高分子，如离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交子，如离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶等。带阳离子基团的，如磺酸基（换凝胶等。带阳离子基团的，如磺酸基（SO3H）、羧甲基（）、羧甲基（CH2COOH）和磷酸基等）和磷酸基等为阳离子交换剂。带阴离子基团的，如为阳离子交换剂。带阴离子基团的，如DEAE（二乙基胺乙基）和（二乙基胺乙基）和QAE（四级胺乙基）等为（四级胺乙基）等为阴离子交换剂。离子交换层析只适用于能在水中阴离子交换剂。离子交换层析只适用于能在水中解离的化合物，包括有机物和无机物。对于蛋白解离的化合物，包括有机物和无机物。对于蛋白质、核酸、氨基酸及核苷酸的分离分析有极好的质、核酸、氨基酸及核苷酸的分离分析有极好的分辨力。离子交换基团在水溶液中解离后，能吸分辨力。离子交换基团在水溶液中解离后，能吸引水中被分离物的离子，各种物质在离子交换剂引水中被分离物的离子，各种物质在离子交换剂上的离子浓度与周围溶液的离子浓度保持平衡状上的离子浓度与周围溶液的离子浓度保持平衡状态，各种离子有不同的交换常数，态，各种离子有不同的交换常数，K值愈高，被值愈高，被吸附愈牢。洗脱时，增加溶液的离子强度，如改吸附愈牢。洗脱时，增加溶液的离子强度，如改变变pH，增加盐浓度，离子被取代而解吸下来。洗，增加盐浓度，离子被取代而解吸下来。洗脱过程中，按脱过程中，按K值不同，分成不同的区带。值不同，分成不同的区带。68蛋白质一级结构的测定方法蛋白质分离纯化（细分级）的方法都可以用。蛋白质分离纯化（细分级）的方法都可以用。对角线法：双向电泳和双向层析，第一相电泳后对角线法：双向电泳和双向层析，第一相电泳后不作任何处理进行第二相电泳，得到对角线图谱不作任何处理进行第二相电泳，得到对角线图谱说明肽段纯度高。改良对角线技术可以确定二硫说明肽段纯度高。改良对角线技术可以确定二硫键的存在。键的存在。高效液相色谱：目前已经成为纯化蛋高效液相色谱：目前已经成为纯化蛋白质和多肽的有力工具。白质和多肽的有力工具。层析和电泳层析和电泳游离末端鉴定游离末端鉴定纯度鉴定：纯度鉴定：69蛋白质一级结构的测定方法4.肽的顺序分析肽的顺序分析 1）化学法）化学法Edman降解法降解法（一）（一）EdmanEdman化学降解法：分析短肽最基本、最有效的方法化学降解法：分析短肽最基本、最有效的方法 Edman Edman试剂：异硫氰酸苯酯（试剂：异硫氰酸苯酯（PITCPITC或或PTCPTC）降解过程：降解过程：（1 1）耦联反应：）耦联反应：PITC PITC与肽段与肽段N N末端氨基酸的末端氨基酸的氨基氨基（游离）在碱性条件下发生耦联反应，生成（游离）在碱性条件下发生耦联反应，生成PTCPTC肽。肽。（2 2）断裂反应：在强酸作用下，）断裂反应：在强酸作用下，离离PTCPTC肽最近的氨肽肽最近的氨肽键断裂，形成键断裂，形成2 2苯胺苯胺5 5噻唑啉酮衍生物（噻唑啉酮衍生物（PTZPTZ）,原来的原来的肽段少一个氨基酸残基。肽段少一个氨基酸残基。（3 3）转化（环化）：）转化（环化）：PTZ PTZ不稳定，在酸性条件下，自发不稳定，在酸性条件下，自发环化转变成环化转变成3 3苯基苯基2 2乙内酰脲（乙内酰脲（PTHPTHAAAA）。）。70蛋白质一级结构的测定方法 利用Edman试剂降解一次最多可以测出多少残基，关键在于，肽片段转变为PTC肽及随后的Edman降解反应的产率。一般来说，反应产率逐渐降低。71蛋白质一级结构的测定方法Edman化学降解的图示耦联断裂转化72蛋白质一级结构的测定方法1）化学法）化学法Edman降解法降解法PTH氨基酸的鉴定改进氨基酸的鉴定改进A.1967年年Edman及及Begg介绍了一种介绍了一种Edman降解的液相自动分析装置，使顺序分析开始降解的液相自动分析装置，使顺序分析开始走向自动化。将样品先在反应杯内旋转成薄走向自动化。将样品先在反应杯内旋转成薄膜，使之固定。然后与膜，使之固定。然后与PITC试剂反应。再试剂反应。再用有机溶剂多次抽提除去过剩试剂，因而样用有机溶剂多次抽提除去过剩试剂，因而样品易丢失，且仪器昂贵，使用受到限制。品易丢失，且仪器昂贵，使用受到限制。73蛋白质一级结构的测定方法1）化学法）化学法Edman降解法降解法PTH氨基酸的鉴定改进氨基酸的鉴定改进B.1970年年Laursen改进为固相氨基酸顺序仪。此法改进为固相氨基酸顺序仪。此法样品用量少，检出灵敏，可分析超过样品用量少，检出灵敏，可分析超过2000肽，其肽，其原理是将肽共价结合到惰性支持物上，固定后装原理是将肽共价结合到惰性支持物上，固定后装柱再行柱再行Edman降解。降解。74蛋白质一级结构的测定方法（三）减数（三）减数EdmanEdman序列分析法序列分析法 这也是这也是EdmanEdman降解的改良技术。降解的改良技术。分析用分析用EdmanEdman试剂降解后肽段的氨基酸组成，每一试剂降解后肽段的氨基酸组成，每一次丢失的氨基酸就是次丢失的氨基酸就是N N末端的氨基酸。末端的氨基酸。优点：快速、准确、样品需要量少。优点：快速、准确、样品需要量少。需要有氨基酸自动分析仪。需要有氨基酸自动分析仪。（四）（四）DABITC/PITCDABITC/PITC双耦联法双耦联法 DABITC DABITC（4 4N N，N N二甲氨基偶氮苯二甲氨基偶氮苯44异硫异硫氰酸苯酯）是改进的氰酸苯酯）是改进的EdmanEdman试剂。试剂。N N末端的氨基酸从肽段末端的氨基酸从肽段上裂解下来后，生成的颜色明显的上裂解下来后，生成的颜色明显的DABITHAADABITHAA。在聚酰。在聚酰胺薄膜上层析分离，盐酸蒸汽熏，显示红色斑点，杂质胺薄膜上层析分离，盐酸蒸汽熏，显示红色斑点，杂质显蓝紫色。其原理与显蓝紫色。其原理与EdmanEdman降解法相同。降解法相同。76蛋白质一级结构的测定方法（五）酶降解法进行肽段序列分析（五）酶降解法进行肽段序列分析1 1 氨肽酶法：氨肽酶法：各种氨肽酶的专一性各种氨肽酶的专一性2 2 羧肽酶法：羧肽酶法：3 3 二肽酶法：二肽酶法：每次切下两个氨基酸残基，进行分析测定。每次切下两个氨基酸残基，进行分析测定。77蛋白质一级结构的测定方法自动序列分析自动序列分析 蛋白质序列仪蛋白质序列仪 （一）液相序列仪：自旋式反应器，使用微量样品测定（一）液相序列仪：自旋式反应器，使用微量样品测定大片断，不适于小肽片段。大片断，不适于小肽片段。（二）固相序列仪：用聚苯乙烯作固相载体，近年来用（二）固相序列仪：用聚苯乙烯作固相载体，近年来用微孔玻璃球，球表面连接丙氨基侧链，在丙氨基侧链后面再微孔玻璃球，球表面连接丙氨基侧链，在丙氨基侧链后面再连接反应基团与肽片段结合，肽片段的类型（羧基端不同）连接反应基团与肽片段结合，肽片段的类型（羧基端不同）不同与其连接的反应基团不同。不同与其连接的反应基团不同。（三）气相序列仪：也称气相固相序列仪。再气态条（三）气相序列仪：也称气相固相序列仪。再气态条件下完成件下完成EdmanEdman降解，反应室内引入携带体降解，反应室内引入携带体polybrenepolybrene与多肽与多肽片段结合，防止样品流失。片段结合，防止样品流失。优点：灵敏度高，效率高，试剂和溶剂消耗量低。优点：灵敏度高，效率高，试剂和溶剂消耗量低。仪器价格昂贵仪器价格昂贵78蛋白质一级结构的测定方法用自动序列分析仪测序用自动序列分析仪测序用自动序列分析仪测序用自动序列分析仪测序仪器原理：仪器原理：EdmanEdman法。法。19671967液相测序仪液相测序仪 自旋反应器，适于大肽段。自旋反应器，适于大肽段。19711971固相测序仪固相测序仪表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的端。表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的端。19811981气相测序仪气相测序仪 用用PolybrenePolybrene反应器。反应器。（聚阳离子）四级铵（聚阳离子）四级铵盐聚合物盐聚合物 液相：液相：5nmol 20-405nmol 20-40肽肽 97%97%气相：气相：5pmol 60 5pmol 60 肽肽 98%98%79蛋白质一级结构的测定方法PolybrenePolybrene：AbbottAbbott公司商标公司商标俗名：俗名：hexadimethrine bromidehexadimethrine bromide。化学名：化学名：1 1，5 5dimethyldimethyl1 1，5 5diazaundecamethylenediazaundecamethylene polymethobromide polymethobromide 1 1，5 5二甲基二甲基1 1，5 5二氮十一亚甲基聚甲溴化物二氮十一亚甲基聚甲溴化物用途：哺乳动物细胞感染，蛋白质自动测序，肝素拮抗剂。用途：哺乳动物细胞感染，蛋白质自动测序，肝素拮抗剂。80蛋白质一级结构的测定方法四四 由已知序列肽段建立蛋白质一级结构由已知序