菌落总数-梅玲玲课件

食品微生物学检验 菌落总数测定GB/T4789.2-2008 2024/7/201何谓何谓菌落菌落 指细菌在固体培养基上生长繁殖而形指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。当样品被以万计相同的细菌集合而成。当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够定培养条件下，每个能够生长繁殖生长繁殖的细的细菌都可以在平板上形成一个可见的菌落。菌都可以在平板上形成一个可见的菌落。何谓菌落总数何谓菌落总数:指指检样经过处理，在一定条件下检样经过处理，在一定条件下培养后培养后(如培基成分、培养温度和时间、如培基成分、培养温度和时间、pHpH、需、需氧性质等氧性质等)，所得，所得1mL(g)1mL(g)检样中所形成菌落的总检样中所形成菌落的总数。现标准规定的培养条件下所得结果，只包括数。现标准规定的培养条件下所得结果，只包括一群在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温性需氧一群在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的菌落总数。的菌落总数。所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此1.1.菌落菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数。总数并不表示实际中的所有细菌总数。2.2.菌落总菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。杂菌数，需氧菌数等。菌落总数卫生学意义1.作为食品被细菌污染程度即清洁状态的作为食品被细菌污染程度即清洁状态的标志。它反映了食品本身的新鲜程度、食标志。它反映了食品本身的新鲜程度、食品加工、贮存、运输过程中是否符合卫生品加工、贮存、运输过程中是否符合卫生要求。要求。2.用来预测食品耐存放程度或期限。用来预测食品耐存放程度或期限。3.通过观察细菌在食品中繁殖的动态，为对通过观察细菌在食品中繁殖的动态，为对被检样品进行卫生学评价时提供依据。被检样品进行卫生学评价时提供依据。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。生质量的优劣。菌落总数测定标准修订意义菌落总数测定标准修订意义为了在食品中有效开展菌落总数测定，以保为了在食品中有效开展菌落总数测定，以保障食品安全，障食品安全，保障大众健康，防止细菌性食保障大众健康，防止细菌性食源性疾病的发生，我国在源性疾病的发生，我国在1984年制定了年制定了食品卫生微生物学检验食品卫生微生物学检验 菌落总数测定菌落总数测定（GB/T 4789.2-1988）标准，该标准的）标准，该标准的颁布为菌落总数的规范测定起到了重要的作颁布为菌落总数的规范测定起到了重要的作用。用。菌落总数测定标准修订意义菌落总数测定标准修订意义在以后的二十多年时间里，食品中菌落在以后的二十多年时间里，食品中菌落总数测定标准经过总数测定标准经过1994年、年、2003年年二次修订，但内容可以说完全与二次修订，但内容可以说完全与1984年版相同。年版相同。修订依据标准清理多年未进行修订WTO的要求（紧迫性）原标准的局限（培养基、计数方式等）2024/7/207修订依据（修订的主要参考方法）FDA/BAM Chapter 3 Aerobic Plate Count Jan.2001SN 0168-92 出口食品平板菌落计数AOAC 986.32Aerobic Plate Count in FoodsAOAC 988.18Aerobic Plate CountAOAC 990.12Aerobic Plate Count in FoodsUSDA/FSIS MLG CHAPTER 3 EXAMINATION OF FRESH,REFRIGERATED AND FROZEN PREPARED MEAT,POULTRY AND PASTEURIZED EGG PRODUCTS ISO 4833:1991 Microbiology-General guidance for the enumeration of micro-organisms-Colony count technique at 30 degrees C ISO 6610:1992 Milk and milk products-Enumeration Colony-forming units of micro-organisms-Colony-count technique at 30NMKL APHA CCFRA JAPAN HPB2024/7/208 修订的主要内容培养基由营养琼脂改为平板计数琼脂添加了PetrifilmTM 细菌总数检验测试片法菌落计数公式进行了修改添加了拍打式均质器或等效的设备 2024/7/2091、培养基平板计数琼脂平板计数琼脂（PCA)胰蛋白胨 5.0g酵母浸膏 2.5g葡萄糖 1.0g琼脂 15.0g蒸馏水 1000mL营养琼脂（营养琼脂（NA)蛋白胨 10.0g牛肉膏3.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g蒸馏水 1000mL2024/7/20101、培养基依据:国外食品微生物权威的检测方法平板计数琼脂的优点2024/7/20111、培养基培养基改变对结果的影响:能力验证的结果CCIBLAC T004(中国国家出入境检疫检疫认可委员会)APLAC T030(亚太实验室认可合作组织)CNAL T0159(中国实验室国家认可委员会)本次比对的结果江苏省CDC辽宁出入境检验检疫局2024/7/20122.3MTM PetrifilmTM 细菌总数试片法国外情况比对试验数据（已发表）标准方法国内情况使用状况比对试验数据（已发表）2024/7/2013PetrifilmTM 细菌总数试片法比对试验数据（已发表）3M Petrifilm细菌总数检验测试片的研究论文细菌总数检验测试片的研究论文Abgrall,B.,and J.J.Cleret.1990.J.Food Protection 53(3):213-216.Evaluation of Petrifilm SM for the Enumeration of the Aerobic Flora of Fish.Andrews,W.H.1988.Food Laboratory Newsletter 13:34-38.Recent developments in the Microbiological analysis of foods.Bailey,J.S.,and N.A.Cox.1987.J.Food Protection 50(8):643-644.Evaluation of Petrifilm SM and VRB Dry Media Culture Plates for Determining Microbial Quality of Poultry.Bishop,J.Russell.1989.Dairy,Food and Environmental Sanitation 9(12):698-701.A Simple Shelf-Life Estimation Method As An Integral Part Of A Total Dairy Quality Assurance Program.Bishop,J.R.,and J.Y.Juan.1988.J.Food Protection 51(12):955-957.Improved Methods for Quality Assessment of Raw Milk Study found no difference between Petrifilm plate and agar pour plate shelf life test methods.Bishop,J.R.,Waxman,A.M.and Ives,M.1988.J.Dairy Science 71(Supplement 1):113.Utilization of Petrifilm and Standard Agar Methods for Quality Assessment of Pasteurized Milk.Blackburn,C.de W.,C.L.Baylis,and S.B.Petitt.1996.Letters in Applied Microbiology 22:137-140.Evaluation of Petrifilm methods for enumeration of aerobic flora and coliforms in a wide range of foods.Byrne,R.D.,and J.R.Bishop.1991.J.Food Protection 54(4):308-309.Evaluation of a Dry Medium Culture Plate(3M Petrifilm AC)for Laboratory Pasteurized Counts.Byrne,R.D.,J.R.Bishop,and J.W.Boling.1989.J.Food Protection 52(11):805-807.Estimation of Potential Shelf Life of Pasteurized Fluid Milk Utilizing a Selective Preliminary Incubation.Carlier,V.,J.Rozier,M.Gauthier,and C.Dufour.1988.RIA 408 du 11 juillet au 12 Septembre:VIII-IX.Film for counting colonies.(French)Chain,V.S.,and D.Y.C.Fung.1991.J.Food Protection 54(3):208-211.Comparison of Redigel,Petrifilm,Spiral Plate System,Isogrid,and Aerobic Plate Count for Determining the Numbers of Aerobic Bacteria in Selected Foods.Champagne,C.P.,N.Gardner,M.Piette,and C.St-Gelais.1994.Int.Dairy J.4:789-795.The Use of Petrifilm for the Enumeration of Lactococci.Cormier,A.,S.Chiasson,and A.Leger.1993.J.Food Protection 56(3):249-251.A Comparison of Maceration and Enumeration Procedures for Aerobic Count in Selected Seafoods by Standard Method,Petrifilm,Redigel,and Isogrid.Correge,I,A.le Roux,and M.Butin.1995 Viandes et Produits Carnes 16(4):123-130.Comparison of Rapid Methods for Assessment of Efficacy of Cleaning and Disinfection.(French)Curiale,M,S.,P.Fahey,T.L.Fox,and J.S.McAllister.1989.J.Assoc.Off.Anal.Chem.72(2):312-318.Dry Rehydratable Films for Enumeration of Coliforms and Aerobic Bacteria in Dairy Products:Collaborative Study.Curiale,M.S.,T.Sons,J.S.McAllister,B.Halsey,and T.L.Fox.1990.J.Assoc.Off.Anal.Chem.73(2):242-248.Dry Rehydratable Film for Enumeration of Total Aerobic Bacteria in Foods:Collaborative Study.Dal Maso,G.,S.Adami,and V.Dal Bon.1993.Boll.Chim.Farmaceutico 132:23-28.Microbiological Validation of Dry Rehydratable Film Method for Detecting Contamination and Enumeration of Aerobic Bacteria on Overalls and Laboratory Surfaces in Controlled Areas.(Italian)Dasen,A.and G.Duboz.1985.Revue Laitiere Francaise 443 Juillet-Aout:28-30.A Petrifilm for the Determination of the Flora of Raw Milk.(French)Fernandes,Custy F.,G.J.Flick Jr.,J.L.Silva,T.A.McCaskey,and A.F.Hood.1995.J.Food Protection 58(Supplement):35.Effect of Processing Protocols on the Quality of Aquacultured Fresh Catfish Fillets.Fernandes,Custy F.,G.J.Flick Jr.,J.L.Silva,T.A.McCaskey,and A.F.Hood.1995.J.Food Protection 58(Supplement):49.Evaluation of Microbial Swabs for Releasing HCMC and Their Viability of Ice Using 3M Petrifilm.Fung,D.Y.C.1989.Food Australia 41(12):1094-1097.Rapid Methods and Automation in Meat Microbiology:A Review.Ginn,R.E.,V.S.Packard,and T.L.Fox.1984.J.Food Protection 47(10):753-756.Evaluation of the 3M Dry Medium Culture Plate(Petrifilm SM)Method for Determining Numbers of Bacteria in Raw Milk.Ginn,R.E.,V.S.Packard,and T.L.Fox.1986.J.Assoc.Off.Anal.Chem.69(3):527-531.Enumeration of Total Bacteria and Coliforms in Milk by Dry Rehydratable Film Methods:Collaborative Study.Gotze,Von Heike and J.Baumgart.1990.Lebensmittel Technik,March.New Test System.(German)2024/7/20143MTM PetrifilmTM 纸片法优点1、培养基具有良好的生产质量；、培养基具有良好的生产质量；2、菌落计数特别方便（容易判读），红色菌落，易于食品颗粒、菌落计数特别方便（容易判读），红色菌落，易于食品颗粒分开，也不菌落重叠现象；分开，也不菌落重叠现象；3、准确计数，尤其是数目较多时，尤其两个人分别计数同一纸、准确计数，尤其是数目较多时，尤其两个人分别计数同一纸片时，还有方格，如片时，还有方格，如3005004、菌落分布特别均匀；、菌落分布特别均匀；5、平行平板菌落结果一致性比较好，与避免了热损伤有关；、平行平板菌落结果一致性比较好，与避免了热损伤有关；6、菌落蔓延或半透明菌膜现象很少发生；、菌落蔓延或半透明菌膜现象很少发生；7、安全方面：不像玻璃平皿易碎、对人员造成潜在的伤害，另、安全方面：不像玻璃平皿易碎、对人员造成潜在的伤害，另外密封比较好，不容易直接接触菌落。外密封比较好，不容易直接接触菌落。3MTM PetrifilmTM 纸片法缺点1、某些有红色颗粒的，需要注意；粘稠的液体样品，不易分散开；表面活性比较大，易流出；泡沫比较丰富的样品等2、颜色特别重的，如桔黄色，掩盖了菌落；3、抑菌剂浓度比较高时；辣根及辣根粉、大蒜及洋葱制品；4、某些微生物会液化凝胶，造成局部扩散或菌落模糊的现象，大部分是芽胞杆菌。菌落计算公式有两个稀释度的菌落数在合适范围，按照如下公式计算：N=样品中菌落数C=平板菌落数之和n1=含合适范围菌落数的第一稀释度（低）平板数n2=含合适范围菌落数的第二稀释度（高）平板数d=第一稀释度（低）(稀释倍数)2024/7/2017菌落计算公式1:100（第一稀释度）180，1741:1000（第二稀释度）33，352024/7/2018菌落计算公式1:100（第一稀释度）180，1741:1000（第二稀释度）36，372024/7/2019菌落计算公式统计学依据统计学依据：平板菌落数越多，结果越具有代表性；平板菌落数越多，结果越具有代表性；（不考虑稀释倍数和培养基的营养状况等）取样量越大，结果越具有代表性；取样量越大，结果越具有代表性；（同等取样条件、排除其他方面的干扰因素）2024/7/2020菌落计算例子1:100（第一稀释度）232，2441:1000（第二稀释度）38，352024/7/2021其它修订内容添加了拍打式均质器或等效的设备添加了拍打式均质器或等效的设备菌落形成单位的定义菌落总数的英文培养温度和时间微量移液器天平2024/7/2022修订的其他内容2024/7/2023关于空白对照菌落计数范围的确定关于蔓延菌落的描述菌落总数的报告食品卫生微生物学检验食品卫生微生物学检验菌落总数测定菌落总数测定GB/T4789.2-2008标准介绍标准介绍1 范围本标准规定了食品中菌落总数的测定方法。本标准适用于食品中菌落总数的测定。2术语和定义食品检样经过处理，在一定条件下培养后食品检样经过处理，在一定条件下培养后(如如培基成分、培养温度和时间、培基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等、需氧性质等)，所得，所得1mL(g)检样中所检样中所形成形成菌落的总数。本方菌落的总数。本方法规定的培养条件下所得结果，只包括一群在平法规定的培养条件下所得结果，只包括一群在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温性需氧菌或兼性板计数琼脂上生长发育的嗜中温性需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。厌氧菌的菌落总数。3 设备和材料3.13.1恒温培养箱：恒温培养箱：361361、301301。3.23.2冰箱：冰箱：2 255。3.33.3恒温水浴箱：恒温水浴箱：461461。3.43.4天平：感量天平：感量0.1g0.1g。3.53.5均质器均质器3.63.6震荡器。震荡器。3.7 3.7 无菌刻度吸管：无菌刻度吸管：1 1 mLmL（具（具0.01 0.01 mLmL刻度），刻度），10 10 mLmL（具（具0.1 0.1 mLmL刻度）或微量移液器及吸头。刻度）或微量移液器及吸头。3.83.8无菌锥形瓶：无菌锥形瓶：500 500 mLmL、250 250 mLmL。3.93.9无菌培养皿：直径无菌培养皿：直径90 mm90 mm。3.10 3.10 pHpH计或计或pHpH比色管或精密比色管或精密pHpH试纸试纸3.11 3.11 放大镜或（放大镜或（和）菌落计数器或和）菌落计数器或PetrifilmPetrifilmTMTM 自自动判读仪动判读仪4培养基和试剂4.1平板计数琼脂培养基4.2磷酸盐缓冲稀释液4.3生理盐水。4.41 mol/L氢氧化钠（NaOH）4.5 1 mol/L盐酸（HCl）4.6 PetrifilmPetrifilmTMTM菌落总数测试片和压板注意:质量控制第一法第一法 平板菌落计数法平板菌落计数法5 检验程序见GB4789.2程序图.doc2024/7/20306操作步骤 6.1样品的稀释 6.1.1 固体和半固体食品：以无菌操作取25g样品,放入装有225 mL生理盐水的无菌均质杯内,于8000 10000r/min均质1min2min,制成1:10样品匀液，或放入225 mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min2min，制成1:10的样品匀液。6.1.2 液体食品：以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠)中,充分混匀，制成1:10的样品匀液。注意：无菌操作；操作环境；采样的代表性 6.1.3 用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10的样品匀液1 mL加到装有9 mL PBS的稀释管中，充分混匀制成1：100的样品匀液。6.1.4按照6.1.3操作程序，制备十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。注意：勿使吸管尖端伸入稀释液内勿使吸管尖端伸入稀释液内勿使吸管尖端伸入稀释液内勿使吸管尖端伸入稀释液内6.1.5根据对样品污染状况的估计，选择根据对样品污染状况的估计，选择23个个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度分别吸取择原液），每个稀释度分别吸取1mL样品均匀加样品均匀加入两个无菌平皿内。同时分别取入两个无菌平皿内。同时分别取1mL稀释液加入稀释液加入两个无菌平皿两个无菌平皿内作空白对照。内作空白对照。6.1.6及时将及时将1520ml冷却至冷却至46平板计数琼平板计数琼脂培养基（可放置于脂培养基（可放置于46 1恒温水浴箱内保恒温水浴箱内保温）倾注平板，并转动平皿使其混合均匀。温）倾注平板，并转动平皿使其混合均匀。注意：时间不得超过注意：时间不得超过15min;空白对照；食品颗粒；空白对照；食品颗粒；46水浴内保温水浴内保温。6.2培养6.2.1 琼脂凝固后，将平板翻转，置361培养482h。水产品301培养723h。6.2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生成的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL），凝固后翻转平板，按6.2.1条件进行培养。注意：水产品的培养温度；湿度，培养基失重不水产品的培养温度；湿度，培养基失重不应超过应超过15。6.3菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，(以防遗漏)记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示。6.3.1选取菌落数在30300之间、无蔓延菌落生成的平板计数菌落总数。低于30 CFU的平板记录具体菌落数，大于300的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。注意：到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于04，但不得超过24h6.3菌落计数6.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表一个平板的菌落数。6.3.3当平板上出现菌落间无明显界限的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。7 结果的表述7.1菌落总数的计算方法菌落总数的计算方法7.1.1.若只有一个稀释度平板上的菌落数在适应计数范围内，若只有一个稀释度平板上的菌落数在适应计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（或毫升）中菌落总数结果。作为每克（或毫升）中菌落总数结果。7.1.2 若两个稀释度的菌落数在合适范围，按照如下公式计算：若两个稀释度的菌落数在合适范围，按照如下公式计算：N=C/n1+(0.1*n2)*(d)N=样品中菌落数样品中菌落数C=平板菌落数之和平板菌落数之和n1=含合适范围菌落数的第一稀释度（低）平板数含合适范围菌落数的第一稀释度（低）平板数n2=含合适范围菌落数的第二稀释度（高）平板数含合适范围菌落数的第二稀释度（高）平板数d=稀释因子稀释因子(第一稀释度）第一稀释度）7 结果的表述7.1.3 若所有稀释度的平均菌落数均大于若所有稀释度的平均菌落数均大于300,则应按则应按稀释度最高的平均菌落数乘以释稀倍数报告之。稀释度最高的平均菌落数乘以释稀倍数报告之。7.1.4 若所有稀释度的平均菌落数均小于若所有稀释度的平均菌落数均小于30,则应则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。7.1.5 若所有稀释度均无菌落生长若所有稀释度均无菌落生长,则以小于则以小于1乘以乘以最低稀释倍数报告之最低稀释倍数报告之。7.1.6 若所有稀释度的平均菌落数均不在若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间之间,其中一部分大于其中一部分大于300或小于或小于30时时,则以最接近则以最接近30或或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之的平均菌落数乘以稀释倍数报告之7.2 菌落总数的报告7.2.1菌落数菌落数在在100以内时以内时,按按“四舍五入四舍五入”原则修约，原则修约，采用二位有效数字报告。采用二位有效数字报告。7.2.2大于或等于大于或等于100时时,第三位数字采用第三位数字采用“四舍五入四舍五入”原则修约后，取前二位数字。后面用原则修约后，取前二位数字。后面用0代替位数；代替位数；也也可用可用10的指数来表示，的指数来表示，按按“四舍五入四舍五入”原则修约，采原则修约，采用二位有效数字。用二位有效数字。7.2.3若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。落蔓延。7.2.4若空白对照有菌落生长，则此次检测结果无效若空白对照有菌落生长，则此次检测结果无效。7.2.5称重取样以称重取样以CFU/g为单位报告。为单位报告。体积取样体积取样以以CFU/mL为单位报告。为单位报告。例次例次稀稀释度及菌落数度及菌落数两稀两稀释液之比液之比菌落菌落总数（数（CFU/g（ml）结果果10-110-210-3原原标准准现标准准1多不可多不可计1682516000或或1.6 610104 4 多不可多不可计160152多不可多不可计284401.638000或或3.810104 4 多不可多不可计306523多不可多不可计270652.227000或或2.710104 4 多不可多不可计272554多不可多不可计多不可多不可计313310000或或3.110105 5 多不可多不可计多不可多不可计309524115270或或2.710102 2 3010600010 0007多不可多不可计3051231000或或3.110104 4 多不可多不可计3129例次例次稀稀释度及菌落数度及菌落数两稀两稀释液之比液之比菌落菌落总数（数（CFU/g（ml）结果果10-110-210-3原原标准准现标准准1多不可多不可计1682516000或或1.6 610104 416000或或1.6 610104 4多不可多不可计160152多不可多不可计284401.638000或或3.810104 431000或或3.110104 4多不可多不可计306523多不可多不可计270652.227000或或2.710104 430000或或3.010104 4多不可多不可计272554多不可多不可计多不可多不可计313310000或或3.110105 5310000或或3.110105 5多不可多不可计多不可多不可计309524115270或或2.710102 2270或或2.710102 23010600010100007多不可多不可计3051231000或或3.110104 431000或或3.110104 4多不可多不可计3129第二法第二法 菌落总数菌落总数PetrifilmPetrifilmTMTM测试片法测试片法8检测程序除将平板计数琼脂培养基改为PetrifilmTM菌落总数测试片法外，其他与第5章相同。9 操作步骤9.1 样品的稀释样品的稀释按照按照6.1.1 6.1.2制备制备1:10的的样品匀液后,用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl调节pH值至6.67.2.9 操作步骤9.2 9.2 接种接种根据对样品污染状况的估计，选择根据对样品污染状况的估计，选择2 23 3个适宜的个适宜的连续稀释度的样品匀液进行检测。将测试片置于连续稀释度的样品匀液进行检测。将测试片置于平坦实验台面，揭开上层膜，用无菌吸管或微量平坦实验台面，揭开上层膜，用无菌吸管或微量移液器吸取移液器吸取1mL1mL样品匀液垂直滴加在测试片的中央，样品匀液垂直滴加在测试片的中央，然后再将上层膜缓慢盖下，静置然后再将上层膜缓慢盖下，静置1min1min使培养基凝使培养基凝固，每个稀释度接种两片。固，每个稀释度接种两片。9.39.3培养培养 将测试片透明面朝上水平置于恒温培养箱内，堆将测试片透明面朝上水平置于恒温培养箱内，堆叠片数不超过叠片数不超过2020片。培养温度和时间同片。培养温度和时间同6.26.2。9.4 计数 9.4.1培养结束后立即计数，可肉眼观察计数，或用菌落培养结束后立即计数，可肉眼观察计数，或用菌落计数器、放大镜、计数器、放大镜、PetrifilmPetrifilmTMTM自动判读仪计数。选择菌自动判读仪计数。选择菌落在落在30300个之间的纸片进行计数。个之间的纸片进行计数。9.4.2计数所有红色菌落。细菌浓度很高时，整个测试片计数所有红色菌落。细菌浓度很高时，整个测试片会变成红色或粉红色，将结果记录为会变成红色或粉红色，将结果记录为“多不可计多不可计”。9.4.3 有时，当细菌浓度很高时，测试片中央没有可见菌有时，当细菌浓度很高时，测试片中央没有可见菌落，但圆形培养膜的边缘有许多小的菌落，其结果也记录落，但圆形培养膜的边缘有许多小的菌落，其结果也记录为为“多不可计多不可计”；进一步稀释样品可获得准确的读数。；进一步稀释样品可获得准确的读数。9.4.4 某些微生物会液化凝胶，造成局部扩散或菌落模糊某些微生物会液化凝胶，造成局部扩散或菌落模糊的现象，如果液化现象干扰计数，可以计数未液化的面积的现象，如果液化现象干扰计数，可以计数未液化的面积来估算菌落数，来估算菌落数，10.结果表述同第七章结果表述同第七章