菌种选育方法1课件

生物工艺学2 菌种选育菌种选育(1)1学 习 目 的n理解菌种选育的原理理解菌种选育的原理n掌握菌种选育的技术掌握菌种选育的技术 2菌种选育的意义 n发发酵酵工工业业的的发发展展除除了了发发酵酵工工艺艺和和设设备备得得以以改改进进外外，其决定因素是优良菌种的获得其决定因素是优良菌种的获得n菌种选育菌种选育n提提供供各各种种类类型型的的突突变变株株:提提高高发发酵酵单单位位，改改进进产品质量，去除多余的代谢产物和合成新品种产品质量，去除多余的代谢产物和合成新品种n微生物潜在资源的广泛利用和开发微生物潜在资源的广泛利用和开发3主要内容n菌种的来源菌种的来源n生物物质产生菌的筛选生物物质产生菌的筛选n微生物选择性分离的原理和发展微生物选择性分离的原理和发展n重要工业微生物的分离重要工业微生物的分离n菌种选育菌种选育n自然选育自然选育n诱变育种诱变育种n抗噬菌体菌株的选育抗噬菌体菌株的选育n杂交育种杂交育种n原生质体融合技术原生质体融合技术nDNA重组技术重组技术n菌种保藏菌种保藏42.1 菌种的来源n生物物质产生菌的筛选生物物质产生菌的筛选n微生物选择性分离的原理和发展微生物选择性分离的原理和发展n重要工业微生物的分离重要工业微生物的分离52.1.1 微生物生物产物的来源n微生物是各种生物活性产物的丰富资源。微生物是各种生物活性产物的丰富资源。n微生物的初级代谢产物，如氨基酸、维生素；微生物的初级代谢产物，如氨基酸、维生素；n微生物的次级代谢产物，如抗生素微生物的次级代谢产物，如抗生素n获得所需生物特性新产物的关键获得所需生物特性新产物的关键n生物产物的来源生物产物的来源微生物的选择；微生物的选择；n采用什么样的筛选方案采用什么样的筛选方案(检测系统检测系统)。n筛选方法筛选方法n选择性选择性n灵敏度灵敏度62.1.2 微生物选择性分离的原理和发展介绍放线菌纲为主的分离方法原理的发展。介绍放线菌纲为主的分离方法原理的发展。n 选择性分离方法大致可分为五个步骤：选择性分离方法大致可分为五个步骤：n含微生物材料的选择含微生物材料的选择n材料的预处理材料的预处理n所需菌种的分离所需菌种的分离n菌株的培养菌株的培养n菌落的选择和纯化菌落的选择和纯化以上任何一个阶段都可引入选择压力：以上任何一个阶段都可引入选择压力：选择压力选择压力，或进化压力进化压力，可以被认为是外界施与一个生物进化过程的压力，从而改变该过程的前进方向。所谓达尔文的自然选择，或者物竞天择，适者生存，即是说，自然界施与生物体选择压力从而使得适应自然环境者得以存活和繁衍。7 (1)含微生物材料的选择n材料来源的广泛性材料来源的广泛性n特定环境压力下的材料更容易筛选到特定的微生物类群特定环境压力下的材料更容易筛选到特定的微生物类群n耐高温、嗜高温耐高温、嗜高温温泉、火山口、温泉、火山口、海底热液喷口海底热液喷口n耐低温耐低温/嗜低温嗜低温海底、雪山海底、雪山n嗜酸：矿山酸性废水嗜酸：矿山酸性废水n脂肪酶产生菌：屠宰场土壤脂肪酶产生菌：屠宰场土壤n（光合细菌：池塘、污水处理厂）（光合细菌：池塘、污水处理厂）8特殊环境台北阳明台北阳明山小油坑山小油坑9n极端环境微生物的代谢产物极端环境微生物的代谢产物特殊环境微生物的开发利用10n最适生长温度在最适生长温度在 90以上的微生物以上的微生物，被称做，被称做极端嗜热菌。极端嗜热菌。n2 0多个属多个属，大多是古细菌，大多是古细菌，生活在深海火山，生活在深海火山喷口附近或其周围区域。喷口附近或其周围区域。n嗜热菌的营养范围很广嗜热菌的营养范围很广，多为异养菌，多为异养菌，其中，其中许多能将硫氧化以取得能量许多能将硫氧化以取得能量n应用应用n利用菌体发酵利用菌体发酵:有人用极端嗜热菌生产乙醇。有人用极端嗜热菌生产乙醇。n利用菌体产生的酶利用菌体产生的酶:如用于如用于PCR技术的技术的TaqDNA聚合酶聚合酶，是从嗜热古细菌，是从嗜热古细菌Thermus aquaticus中中分离出来的。分离出来的。n为基因工程菌提供特异性基因为基因工程菌提供特异性基因 极端嗜热菌(Thermophiles)Mud Volcano AreaThermus aquaticus11极端嗜酸菌极端嗜酸菌(Acidophiles)n生活环境生活环境pH值在值在 1以下的微生物以下的微生物，往往生长在火山区或含硫，往往生长在火山区或含硫量极为丰富的地区量极为丰富的地区，多为古细菌，多为古细菌，体内环境保持，体内环境保持pH值值 7左左右。能氧化硫右。能氧化硫。嗜酸菌往往也是嗜高温菌。嗜酸菌往往也是嗜高温菌。nSulfolobus acidocaldariusn应用应用n脱除煤中的无机硫，处理含硫废气，改良土壤等。脱除煤中的无机硫，处理含硫废气，改良土壤等。n还有用于冶金，提取矿物等。还有用于冶金，提取矿物等。Sulfuric GeyserSulfuric Hot Spring12极端嗜盐菌极端嗜盐菌(Extreme halophiles)n高盐度环境中的古细菌。生活在高盐度环境中的古细菌。生活在 10%-30%的盐液中。的盐液中。n应用应用n生产聚羟基丁酸生产聚羟基丁酸(PHB)、胞外多糖类物质、胞外多糖类物质(如如EPS)等多聚化合物；除等多聚化合物；除去工业废水中的磷酸盐、开发盐碱地、开发能源等。去工业废水中的磷酸盐、开发盐碱地、开发能源等。n从利用嗜盐酶看从利用嗜盐酶看，有利用生产，有利用生产SOD、胞外核酸酶、胞外淀粉酶、胞、胞外核酸酶、胞外淀粉酶、胞外木聚糖酶等。外木聚糖酶等。13极端嗜碱菌极端嗜碱菌(Alkaliphiles)n盐碱湖或碱湖、碱池中盐碱湖或碱湖、碱池中，生活环境，生活环境 pH值可达值可达 11.5以上以上，最适最适 pH值值 8-10。n应用应用n如用耐碱蛋白酶和碱性纤维素酶作洗涤剂的添加成分；如用耐碱蛋白酶和碱性纤维素酶作洗涤剂的添加成分；n碱性淀粉酶用于纺织品退浆；碱性淀粉酶用于纺织品退浆；n用于皮革工业中的脱毛工艺以提高脱毛效率和质量；用于皮革工业中的脱毛工艺以提高脱毛效率和质量；n利用嗜碱菌进行苎麻脱胶。利用嗜碱菌进行苎麻脱胶。14极端嗜压菌极端嗜压菌(Barophiles)n一般生活在深海底一般生活在深海底 ，能耐普通微生物不能忍耐的高压。低于，能耐普通微生物不能忍耐的高压。低于 0 0.4-0.5.4-0.5PaPa则不能生长。则不能生长。n美国发现的一些种能够生长在美国发现的一些种能够生长在 1 1.3-1.4.3-1.4PaPa环境中。日本在环境中。日本在 3 3000-6000000-6000深的深海鱼类肠道内发现了极端嗜压菌。多为古深的深海鱼类肠道内发现了极端嗜压菌。多为古细菌。细菌。n应用应用n日本发现的深海鱼类肠道内的嗜压古细菌日本发现的深海鱼类肠道内的嗜压古细菌 ，80%80%以上的菌株可以生产以上的菌株可以生产EPAEPA和和DHADHA，最高产量可达最高产量可达 36%36%和和 2 4%2 4%。n嗜压菌可以用于高压生物反应器。嗜压菌可以用于高压生物反应器。15极端嗜冷菌极端嗜冷菌(Psychophiles)n深海的极端嗜压菌往往也是极端嗜冷菌。在真核深海的极端嗜压菌往往也是极端嗜冷菌。在真核生物中也有一些嗜冷的真菌和藻类生物中也有一些嗜冷的真菌和藻类，它们在两极冰，它们在两极冰雪和高山雪坡上生长。极端嗜冷菌的最适生长温度雪和高山雪坡上生长。极端嗜冷菌的最适生长温度一般为一般为-2以上以上，高于，高于 1 0则不能生长。则不能生长。n应用应用n国内的应用报道较少。国内的应用报道较少。n国外有人将嗜冷酶应用于洗涤剂中。国外有人将嗜冷酶应用于洗涤剂中。16(2)材料的预处理n热处理：热处理：减少细菌数量，因为许多放细菌的孢子和菌丝片断比减少细菌数量，因为许多放细菌的孢子和菌丝片断比G(-)细菌细菌细胞耐热。同样也减少放细菌的数目；细胞耐热。同样也减少放细菌的数目；n水样品的浓缩：水样品的浓缩：滤膜过滤、离心；滤膜过滤、离心；n添加固体基质或喷淋可溶性养分，增加特定微生物的数量；或添加固体基质或喷淋可溶性养分，增加特定微生物的数量；或诱使特定微生物附着在固体基质上。诱使特定微生物附着在固体基质上。n黄瓜黄瓜+菜园土菜园土腐酶腐酶n花粉花粉+土壤土壤小瓶菌小瓶菌腐霉菌（Pythium spp.）17材料的预处理18(3)所需菌种的分离n适当的培养基：适当的培养基：广泛使用的三种培养基为：广泛使用的三种培养基为：n几丁质培养基几丁质培养基土壤和水中的放线菌土壤和水中的放线菌n淀粉淀粉-酪素培养基酪素培养基分离的放线菌种类与几丁质培养基分离的放线菌种类与几丁质培养基相似，但菌落密度更大、色素更多，细菌容易生长。相似，但菌落密度更大、色素更多，细菌容易生长。nM3培养基培养基容易分离链霉菌以外的其他放线菌如红球容易分离链霉菌以外的其他放线菌如红球菌。菌。19所需菌种的分离（续）n适当的适当的pH条件条件n大多数放线菌为中性，培养基大多数放线菌为中性，培养基pH为为6.7-7.5。n分离嗜酸性放线菌，分离嗜酸性放线菌，pH4.5-5.0。n加入抗生素加入抗生素n抗真菌抗生素，对放线菌无影响；抗真菌抗生素，对放线菌无影响；n抗细菌抗生素同时影响放线菌数量，选择合适的抗细菌抗抗细菌抗生素同时影响放线菌数量，选择合适的抗细菌抗生素如生素如新生霉素、亚胺环己酮新生霉素、亚胺环己酮能分离出普通高温放线菌。能分离出普通高温放线菌。20菌种的培养n培养的温度培养的温度n常温：常温：25-30 n嗜热菌：嗜热菌：45-55 n嗜冷菌：嗜冷菌：4-10 n培养的时间培养的时间n一般的嗜温菌链霉菌、小单胞菌一般的嗜温菌链霉菌、小单胞菌7-14dn嗜热菌嗜热菌1-2dn长时间培养可能得到不寻常的菌种长时间培养可能得到不寻常的菌种21菌落的选择n菌落的选择非常重要，决定筛菌的成功以及使筛菌的效率。菌落的选择非常重要，决定筛菌的成功以及使筛菌的效率。具体方法取决于筛菌的目的。具体方法取决于筛菌的目的。n常用方法：常用方法：n铺菌法：一个分离平板试验一种菌测定各个菌落的抗生素铺菌法：一个分离平板试验一种菌测定各个菌落的抗生素产生能力。产生能力。缺点：菌落被污染。缺点：菌落被污染。n复印平板法：复印平板法：stamp法。将菌落复印在平板上的办法来研法。将菌落复印在平板上的办法来研究它们对一系列试验菌的作用。究它们对一系列试验菌的作用。缺点：对不长孢子的链霉菌不缺点：对不长孢子的链霉菌不适用，也不适用于游动细菌的筛选。适用，也不适用于游动细菌的筛选。22放线菌的菌落特征 n放线菌菌丝相互交错缠绕形成放线菌菌丝相互交错缠绕形成质地致密的小菌落，干燥、不质地致密的小菌落，干燥、不透明、难以挑取，当大量孢子透明、难以挑取，当大量孢子覆盖于菌落表面时，就形成表覆盖于菌落表面时，就形成表面为粉末状或颗粒状的典型放面为粉末状或颗粒状的典型放线菌菌落，常有颜色。线菌菌落，常有颜色。nA：诺尔斯氏链霉菌；诺尔斯氏链霉菌；nB：皮疽诺卡氏菌；皮疽诺卡氏菌；nC：酒红指孢囊菌；酒红指孢囊菌；nD：游动放线菌；游动放线菌；nE：小单胞菌；小单胞菌；nF：皱双孢马杜拉放线菌皱双孢马杜拉放线菌23产抗菌素的放线菌的菌落特征nA：卡特利链霉菌；卡特利链霉菌；nB：弗氏链霉菌；弗氏链霉菌；nC：吸水链霉菌金泪亚种；吸水链霉菌金泪亚种；nD：卡那霉素链霉菌；卡那霉素链霉菌；nE：除虫链霉菌；除虫链霉菌；nF：生磺酸链霉菌生磺酸链霉菌24印章复印菌落印章复印菌落原始菌落原始菌落产生抑菌圈产生抑菌圈试验菌平板试验菌平板复印平板法复印平板法25未来的发展n天然基质的选择：天然基质的选择：特定的天然环境必定有特定的微生物。重视微环境特定的天然环境必定有特定的微生物。重视微环境的变化，如厌氧微生物。的变化，如厌氧微生物。n富集技术的发展富集技术的发展n（1）分离前改变天然菌群的组成，利用微生物生理知识，如前体的）分离前改变天然菌群的组成，利用微生物生理知识，如前体的加入可以富集合成相应次级代谢物的菌类。加入可以富集合成相应次级代谢物的菌类。n（2）恒化器（）恒化器（Chemostat)培养混合菌，富集目的菌。培养混合菌，富集目的菌。n定向的分离培养基配方的选择定向的分离培养基配方的选择n取决于对微生物营养生理的了解程度和经验，以选择更合理的培养基取决于对微生物营养生理的了解程度和经验，以选择更合理的培养基配方。配方。n分子生物学技术的应用分子生物学技术的应用nDNA杂交技术杂交技术n基因芯片的发展基因芯片的发展26空气调节器空气调节器泵泵发酵液发酵液储液瓶储液瓶 7 8 1Water Level磁力搅拌器磁力搅拌器恒化器示意图恒化器示意图272.1.3 重要工业微生物的分离n分离分离/isolation 是指获得纯的或混合的培养物。是指获得纯的或混合的培养物。n筛选工业微生物筛选工业微生物n首先就要分离到一个或多个菌株。首先就要分离到一个或多个菌株。n接着筛选出能够产生所需要物质或具有某种生化反应的菌接着筛选出能够产生所需要物质或具有某种生化反应的菌种。种。n分离分离鉴定鉴定28n生长快，发酵周期短生长快，发酵周期短n高产高产n副产物少、产物容易回收副产物少、产物容易回收n原料利用广泛原料利用广泛n耐受前体物质，不当作一般碳源利用耐受前体物质，不当作一般碳源利用n产生泡沫少产生泡沫少n抗噬菌体抗噬菌体n遗传稳定遗传稳定发酵菌种的要求29筛选菌株时应该考虑的指标n菌的营养特征：廉价、来源广。菌的营养特征：廉价、来源广。n菌的生长温度：高于菌的生长温度：高于40，n降低冷却成本；降低冷却成本；n提高反应速度；提高反应速度；n有时利于产物分离，如乙醇发酵，高温产物的蒸馏变得容易。有时利于产物分离，如乙醇发酵，高温产物的蒸馏变得容易。n菌对设备和生产过程的适应性。菌对设备和生产过程的适应性。n菌的稳定性。菌的稳定性。n菌的产物得率和产物在培养液中的浓度菌的产物得率和产物在培养液中的浓度n容易从培养液中回收产物。容易从培养液中回收产物。n产物的毒性。产物的毒性。30（1）施加选择压力的分离方法A 富集液体培养富集液体培养n富集培养（富集培养（enrichment culture)指能增加混合菌群中所需菌指能增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术。株数量的一种技术。n富集培养的关键富集培养的关键是提高有利于所需菌株而不利于其他类型菌是提高有利于所需菌株而不利于其他类型菌株生长的物理、化学条件。如营养、温度、酸度、溶解氧等株生长的物理、化学条件。如营养、温度、酸度、溶解氧等n当所需菌株大量生长，会改变培养条件，从而改变选择压力，当所需菌株大量生长，会改变培养条件，从而改变选择压力，使其他微生物也能生长。此时，需要转移富集培养物至新鲜使其他微生物也能生长。此时，需要转移富集培养物至新鲜培养基，重新建立选择压力。培养基，重新建立选择压力。31嗜中温浸矿微生物富集n温泉水样温泉水样n液体培养基配方：液体培养基配方：9k基本盐基本盐【（NH4)2SO4 3g/L；KCl 0.1g/L；K2HPO4 0.5g/L；MgSO4.7H2O 0.5g/L；Ca(NO3)2 0.01g/L】n能源：液体培养以能源：液体培养以S粉做能源物质，设计粉做能源物质，设计S粉浓度分别为粉浓度分别为5 g/L，Yeast extract浓度浓度0.5 g/Ln培养基培养基pH值设置：分别用值设置：分别用2.0、3.0、4.0进行实验进行实验n培养条件：培养条件：50度，度，200rpm。32n利用不同菌株比生长速率与基质浓度的关系，改变稀释速率，利用不同菌株比生长速率与基质浓度的关系，改变稀释速率，控制基质浓度，达到筛选所需菌株的目的。比生长速率低的控制基质浓度，达到筛选所需菌株的目的。比生长速率低的菌将最终被洗出（菌将最终被洗出（washout）.n根据连续培养理论：根据连续培养理论：n细胞积累细胞积累=生长量生长量-流出量流出量ndX/dt=*X D*X；n比生长速率，比生长速率，D稀释率，稀释率，X菌体浓度菌体浓度n对于生长快的和生长慢的菌，必然存在一个基质浓度，使生长慢的菌对于生长快的和生长慢的菌，必然存在一个基质浓度，使生长慢的菌的比生长速率的比生长速率稀释率，结果该菌被洗出。稀释率，结果该菌被洗出。连续培养筛选菌株连续培养筛选菌株33假定连续培养的稀释率为D，微生物A、B比生长速率相等时，限制性基质浓度为S1：当基质浓度当基质浓度S1，则则B大于大于A，当当B=D，A D，从而从而dA/dtS1，则则B小于小于A，当当A=D，B D，从而从而dB/dt 50)条件下连续培养；条件下连续培养；n欲培养降解欲培养降解PCP（五氯酚）的微生物，在基质中加入五氯酚）的微生物，在基质中加入PCP。连续培养筛选菌株（续）35n常用于分离某些酶产生菌，其选择性培养基常含有所常用于分离某些酶产生菌，其选择性培养基常含有所需酶的基质，以促进酶产生菌的生长。如蛋白酶、脂需酶的基质，以促进酶产生菌的生长。如蛋白酶、脂肪酶。肪酶。n例：分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌属例：分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌属n土壤须经巴氏法消毒，以减少不产孢子的微生物。然后铺土壤须经巴氏法消毒，以减少不产孢子的微生物。然后铺在在pH910的琼脂培养基的琼脂培养基(含有均匀的不溶性蛋白质含有均匀的不溶性蛋白质)表面。表面。n碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白，产生一清碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白，产生一清晰圈。清晰圈的大小可以初步作为选择高产菌的依据。晰圈。清晰圈的大小可以初步作为选择高产菌的依据。B 固体培养基的使用固体培养基的使用36平板分离培养大肠杆菌平板菌落大肠杆菌平板菌落霉菌菌落霉菌菌落裴氏着色芽菌的菌落裴氏着色芽菌的菌落 细菌菌落细菌菌落37海洋微生物菌落海洋微生物菌落硅酸盐细菌菌落硅酸盐细菌菌落38（2）随机分离方法n大多数情况下，采用随机分离方法分离菌株。大多数情况下，采用随机分离方法分离菌株。n随机分离培养基制作原则：随机分离培养基制作原则：n制备一系列培养基，其中有各种类型的养分成为生长限制因素（制备一系列培养基，其中有各种类型的养分成为生长限制因素（C、N、P、O）；）；n使用一聚合或复合形式的生长限制养分；使用一聚合或复合形式的生长限制养分；n避免使用容易同化的碳源（葡萄糖）或氮源（避免使用容易同化的碳源（葡萄糖）或氮源（NH4+），），它们可能引它们可能引起起分解代谢物阻遏（与容易同化的碳源接触，而使酶合成速率相对分解代谢物阻遏（与容易同化的碳源接触，而使酶合成速率相对降低的作用）降低的作用）；n确定含有所需的辅因子（确定含有所需的辅因子（Co2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+），），以利于酶的以利于酶的活性；活性；n加入缓冲液减少加入缓冲液减少pH变化。变化。39抗生素产生菌的筛选n检测潜在产生菌的拮抗能力检测潜在产生菌的拮抗能力n平板法：平板法：抑菌圈法。快速、简便。抑菌圈法。快速、简便。n液体培养基培养：液体培养基培养：培养液过滤液的抗菌活性。培养液过滤液的抗菌活性。优点：优点：与与深层培养性能比较一致。深层培养性能比较一致。缺点：缺点：要求较为复杂的设备、要求较为复杂的设备、空间更大。空间更大。n专一的筛选技术：专一的筛选技术：利用某种特殊用途的生物物质对某种利用某种特殊用途的生物物质对某种酶的抑制作用，在体外进行筛选。如负责细菌细胞壁肽酶的抑制作用，在体外进行筛选。如负责细菌细胞壁肽聚糖的交联的羧肽酶抑制剂的筛选。聚糖的交联的羧肽酶抑制剂的筛选。40药理活性化合物的筛选药理活性化合物的筛选自自 20世纪世纪6 0年代起年代起,开始从微生物代谢产物中寻找具有除抗菌开始从微生物代谢产物中寻找具有除抗菌作用外的其它生理活性的物质，抗肿瘤抗生素、抗虫抗生素、作用外的其它生理活性的物质，抗肿瘤抗生素、抗虫抗生素、抗病毒抗生素和农用抗生素等。抗病毒抗生素和农用抗生素等。n微生物产物的获得微生物产物的获得n体外对某种人体关键酶的抑制实验（可能在体内对人体也体外对某种人体关键酶的抑制实验（可能在体内对人体也有作用）；有作用）；n动物体内实验，筛选新的药理活性化合物。动物体内实验，筛选新的药理活性化合物。n或者用动物细胞和组织建立筛选模型。或者用动物细胞和组织建立筛选模型。41n抗肿瘤活性物质抗肿瘤活性物质:观察细胞形态的变化观察细胞形态的变化,测定体外细胞毒性测定体外细胞毒性 IC50值。值。n免疫抑制剂免疫抑制剂:测定对淋巴细胞增殖反应的抑制作用。测定对淋巴细胞增殖反应的抑制作用。n神经营养因子样物质神经营养因子样物质:以神经细胞的分化以神经细胞的分化,如以神经轴突的如以神经轴突的伸长为指标。伸长为指标。n血管平滑肌松弛物质血管平滑肌松弛物质:以大鼠或家兔的胸部大动脉为材料以大鼠或家兔的胸部大动脉为材料,观察对血管平滑肌的松弛作用。观察对血管平滑肌的松弛作用。n血管生成抑制剂血管生成抑制剂:以鸡绒毛膜尿囊膜和动物角膜微囊为材料以鸡绒毛膜尿囊膜和动物角膜微囊为材料,观察对新血管生成的抑制作用。观察对新血管生成的抑制作用。用动物细胞和组织建立的筛选模型用动物细胞和组织建立的筛选模型4243生长因子产生菌的筛选n生长因子如氨基酸、核苷酸不能利用选择压力，可以随机分离，生长因子如氨基酸、核苷酸不能利用选择压力，可以随机分离，并通过筛选试验检出产生菌，并通过筛选试验检出产生菌，主要看菌株能否促进营养缺陷型主要看菌株能否促进营养缺陷型的生长。的生长。n营养缺陷型：营养缺陷型：某些突变株失去合成某些该菌株生长必需的营养物质（通某些突变株失去合成某些该菌株生长必需的营养物质（通常为生长因子）的能力，必须从外界获得该物质才能生长繁殖。常为生长因子）的能力，必须从外界获得该物质才能生长繁殖。n通过夹层培养法检测产生菌通过夹层培养法检测产生菌n影印法复制多个分离菌落至能够支持生长因子产生的平板上，培养影印法复制多个分离菌落至能够支持生长因子产生的平板上，培养2-3 d;n紫外线杀死菌落；紫外线杀死菌落；n上铺含营养缺陷型菌的琼脂，培养上铺含营养缺陷型菌的琼脂，培养16h；n检测检定菌周围是否产生生长圈，对应影印，找到产生菌。检测检定菌周围是否产生生长圈，对应影印，找到产生菌。44生物浸矿微生物的筛选n从酸性矿山废水中筛选：从酸性矿山废水中筛选：9K培养基培养基n从含硫温泉筛选高温菌从含硫温泉筛选高温菌n从海洋中火山口、海底热硫化物附近筛选高温菌种，从海洋中火山口、海底热硫化物附近筛选高温菌种，遗传改良遗传改良采样采样富集富集分离分离45思考题n1.分离微生物时，含微生物材料的选择的原则是什么？n2.分离微生物时，含微生物材料的预处理目的和具体措施。n3.微生物常见的分离技术有哪些？n4.在微生物分离过程中如何引入选择压力，举例说明。46