第六讲药物制剂微生物学检查课件

第六章第六章 药物制剂的微生物学药物制剂的微生物学检查检查微生物与药学的关系密切微生物与药学的关系密切1 1、许多抗生素是微生物的代谢产物许多抗生素是微生物的代谢产物,2 2、选用微生物来制造医药卫生方面广泛应用的药物、选用微生物来制造医药卫生方面广泛应用的药物,如维生素如维生素,辅酶；辅酶；3 3、药品卫生质量的控制需要进行微生物学检验；、药品卫生质量的控制需要进行微生物学检验；4 4、药品和生物制剂应用生物工程技术生产时，采用、药品和生物制剂应用生物工程技术生产时，采用工程菌进行，如：胰岛素、干扰素和生长因子等。工程菌进行，如：胰岛素、干扰素和生长因子等。3基本概念基本概念灭灭菌菌(sterilization)(sterilization)：应应用用物物理理或或化化学学等等方方法法将将物物体体上上或或介介质质中中所所有有微微生生物物繁繁殖殖体体及及其其芽芽孢孢全全部部杀灭或除去的杀灭或除去的手段手段。无无菌菌(sterility)(sterility)：在在任任一一指指定定的的物物体体、介介质质或或环境中无任何活的微生物。环境中无任何活的微生物。无无菌菌操操作作(aseptic(aseptic technique)technique)：在在整整个个操操作作中中利利用用或或控控制制一一定定的的条条件件，使使产产品品避避免免被被微微生生物物污污染的一项操作方法和技术。染的一项操作方法和技术。4空空气气净净化化技技术术是是以以创创造造洁洁净净的的空空气气为为主主要要目目的的的的空空气气调调节节措措施施。空气净化分工业净化(尘埃粒子)和生物净化(尘埃粒子和微生物)。药物制剂行业中的空气净化需要生物净化，即在除掉空气中的各种尘埃的同时除掉各种微生物等。空空气气净净化化技技术术是是以以创创造造洁洁净净的的空空气气为为主主要要目目的的的的空空气气调调节节措措施施。空空气气净净化化分分工工业业净净化化(尘尘埃埃粒粒子子)和和生生物物净净化化(尘尘埃埃粒粒子子和和微微生生物物)。药药物物制制剂剂行行业业中中的的空空气气净净化化需需要要生生物物净净化化，即在除掉空气中的各种尘埃的同时除掉各种微生物等。即在除掉空气中的各种尘埃的同时除掉各种微生物等。洁净级别洁净级别尘粒数尘粒数(粒粒/升升)粒径粒径 0.5 m尘粒数尘粒数(粒粒/英尺英尺3)粒径粒径 0.5 m温度温度()相邻级别相邻级别室间压差室间压差湿度湿度(%)菌落数菌落数100 3.5 10018-26正压正压40-60110000 350 100003100000 3500 10000010100000 35000 1000000/1.掌握药物的体外试菌试验方法（琼脂扩散法和系列稀释法），了解药物的体内抗菌实验。2.掌握一般灭菌制剂的无菌检查方法和原理，熟悉特殊药品的无菌检查法。3.掌握非灭菌药物的微生物总数测定方法，熟悉药品的大肠杆菌检查方法。4.了解一般药品的沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和破伤风杆菌的检查方法。第一节第一节 药物的抗菌试验药物的抗菌试验第二节第二节 灭菌制剂的无菌检查灭菌制剂的无菌检查第三节第三节 药物的微生物限度检查药物的微生物限度检查药物的体外抗菌试验包括用于区别药物是抑菌或药物的体外抗菌试验包括用于区别药物是抑菌或杀菌药物的杀菌药物的抑菌试验抑菌试验；测定药物杀菌活性的；测定药物杀菌活性的杀菌杀菌试验试验；以及检查两种药物联合作用的；以及检查两种药物联合作用的联合抗菌试联合抗菌试验验等。等。一般抑菌药物只能抑制微生物生长，不能杀死微一般抑菌药物只能抑制微生物生长，不能杀死微生物，抑菌药物被除去，微生物又可以恢复继续生物，抑菌药物被除去，微生物又可以恢复继续生长。杀菌药物能杀死微生物，杀菌药物除去后，生长。杀菌药物能杀死微生物，杀菌药物除去后，微生物仍然不能生长微生物仍然不能生长。第一节第一节 药物的抗菌试验药物的抗菌试验药物的抑菌作用或杀菌作用是在一定条件下相对药物的抑菌作用或杀菌作用是在一定条件下相对而言的。在我们检测时，药物的作用受到用药时而言的。在我们检测时，药物的作用受到用药时培养基的组成、温度、培养基的组成、温度、PHPH值及所用的菌种、菌量值及所用的菌种、菌量等各个因素有关等各个因素有关。一般我们在体外对药物进行测试后，有效的药再一般我们在体外对药物进行测试后，有效的药再要进行体内试验，如果体内试验再次证实此药有要进行体内试验，如果体内试验再次证实此药有效的话，才能推荐应用到临床。效的话，才能推荐应用到临床。一、药物的体外抑菌试验一、药物的体外抑菌试验（一）体外抑菌试验（一）体外抑菌试验药物的体外抑菌试验是常用抗菌试验方法，其中最药物的体外抑菌试验是常用抗菌试验方法，其中最常用的方法用常用的方法用连续稀释法连续稀释法和和琼脂扩散法琼脂扩散法。1、连续稀释法、连续稀释法包括包括液体培养基稀释法液体培养基稀释法和和固体培养基稀释法固体培养基稀释法两种。两种。均可以用来测定药物的均可以用来测定药物的最小抑菌浓度最小抑菌浓度(MIC)。MIC:是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用用g/ml或或U/ml表示。表示。（1）液体培养基稀释法）液体培养基稀释法 在试管中用液体培养基进行在试管中用液体培养基进行2倍系列稀释药物，倍系列稀释药物，后在每一管中加入定量的试验菌液，经后在每一管中加入定量的试验菌液，经2448h培培养后观察结果。以能抑制试验菌生长的最低浓度养后观察结果。以能抑制试验菌生长的最低浓度为药物的为药物的MIC。（2）固体培养基稀释法）固体培养基稀释法 平板法：测定多种细菌对同一药物的平板法：测定多种细菌对同一药物的MIC 斜面法：较长时间培养的试验菌和霉菌。斜面法：较长时间培养的试验菌和霉菌。2、琼脂扩散法、琼脂扩散法利用药物在琼脂培养基中扩散，并在一定浓度范利用药物在琼脂培养基中扩散，并在一定浓度范围内抑制细菌生长的原理进行的。一般用于细菌围内抑制细菌生长的原理进行的。一般用于细菌和酵母菌的药敏试验。和酵母菌的药敏试验。（1）滤纸片法（纸碟法）滤纸片法（纸碟法）滤纸片法是最常用的方法，可在滤纸片法是最常用的方法，可在1个平板上测定个平板上测定多多种药物对同一试验菌的抗菌作用种药物对同一试验菌的抗菌作用；适用于；适用于新药的新药的初筛试验初筛试验（初步药物是否有抗菌作用）及（初步药物是否有抗菌作用）及临床的临床的药敏试验药敏试验（细菌药物第三性试验、以便选择用药）。（细菌药物第三性试验、以便选择用药）。滤纸片分湿、干两种，可以在试验时用无菌纸片滤纸片分湿、干两种，可以在试验时用无菌纸片沾取药物溶液放在含菌的平板表面，也以预先做沾取药物溶液放在含菌的平板表面，也以预先做成一定浓度的干燥纸片。一般来说预先做成的干成一定浓度的干燥纸片。一般来说预先做成的干燥纸片实用一些而且准确一些。燥纸片实用一些而且准确一些。一般药敏试验常采用滤纸片法，我们可以根据抑一般药敏试验常采用滤纸片法，我们可以根据抑菌环的直径的大小，来判断菌种对药物的敏感性，菌环的直径的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是是敏感敏感(S)，中介，中介(I)还是耐药还是耐药(R)？国际标准采用国际标准采用K-B法法：水解酪蛋白培养基和卡尺：水解酪蛋白培养基和卡尺世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条件下根据抑菌圈大小来判断，比如：件下根据抑菌圈大小来判断，比如：抗生素抗生素 抑菌圈直径（抑菌圈直径（mmmm）耐药耐药 中敏中敏 敏感敏感氯霉素氯霉素 12 13-17 18 12 13-17 18红霉素红霉素 13 14-17 18 13 14-17 18四环素四环素 14 15-18 19 14 15-18 19卡那霉素卡那霉素 13 14-17 18 13 14-17 18（2 2）挖沟法）挖沟法适用于适用于测试测试一种药物对几种细菌的抗菌作用一种药物对几种细菌的抗菌作用。方法是先制备普通琼脂平板，并在平板上挖直沟，方法是先制备普通琼脂平板，并在平板上挖直沟，在沟内滴加药液，在沟侧接种细菌。经过培养以后在沟内滴加药液，在沟侧接种细菌。经过培养以后观察家细菌生长的情况。我们可以根据沟和细菌间观察家细菌生长的情况。我们可以根据沟和细菌间的抑菌距离的长短，来判断该药物对这些细菌的抗的抑菌距离的长短，来判断该药物对这些细菌的抗菌能力。菌能力。(二二)体外杀菌试验体外杀菌试验杀菌试验是用来评价药物对微生物的致死活性的。杀菌试验是用来评价药物对微生物的致死活性的。1 1、最低杀菌浓度、最低杀菌浓度(MBC)(MBC)(最小致死浓度最小致死浓度MLC)MLC)按液体培养基稀释法的操作方法测了药物的按液体培养基稀释法的操作方法测了药物的MICMIC。然后把然后把未长出菌未长出菌的各个试管培养液分别的各个试管培养液分别移种移种到无菌到无菌平板上，培养后凡是平板上无菌生长的药物最低浓平板上，培养后凡是平板上无菌生长的药物最低浓度就是度就是MLC。如果是细菌的话可以称为如果是细菌的话可以称为MBC。2、活菌计数法活菌计数法活菌计数一般是将定量的药物与试验菌活菌计数一般是将定量的药物与试验菌作用后混合液稀释作用后混合液稀释后，后，混入琼脂培养基做成混入琼脂培养基做成平平板，培养后数平板上形成的菌落数，板，培养后数平板上形成的菌落数，由于一个菌落是由一个细菌繁殖而来的，所以可以用菌数乘由于一个菌落是由一个细菌繁殖而来的，所以可以用菌数乘以稀释倍数，计算出混合液中以稀释倍数，计算出混合液中存活的细菌数存活的细菌数。或者也可以用。或者也可以用微孔滤膜过滤药物与试验菌的混合液，洗净药液，将滤膜放微孔滤膜过滤药物与试验菌的混合液，洗净药液，将滤膜放在平板上培养后数菌落数。在平板上培养后数菌落数。3、酚系数测定（石炭酸系数测定）酚系数测定（石炭酸系数测定）这种方法仅仅这种方法仅仅适用于酚类消毒剂杀菌效力适用于酚类消毒剂杀菌效力的测定。的测定。酚系数是以酚为标准，将待测的化学消毒剂与杀菌效酚系数是以酚为标准，将待测的化学消毒剂与杀菌效力相比较，所得的就是杀菌效力的比值。力相比较，所得的就是杀菌效力的比值。具体的测定方法具体的测定方法是分别将酚及待测化学消毒剂按不同是分别将酚及待测化学消毒剂按不同比例稀释，各取比例稀释，各取5 5mlml放到试管中，再加入经放到试管中，再加入经2424小时培小时培养后的菌悬液各养后的菌悬液各0.50.5mlml，混匀后放入混匀后放入 20 20水浴中，水浴中，5 5、1010、1515分钟分别取一接种环混合液移种到另一支分钟分别取一接种环混合液移种到另一支5 5 mlml的肉汤培养基中，的肉汤培养基中，3737培养培养2424小时记录生长情况。小时记录生长情况。（三）（三）联合抗菌试验联合抗菌试验联合抗菌试验主要用于测定两种或以上抗菌药物联联合抗菌试验主要用于测定两种或以上抗菌药物联合应用时的合应用时的相互影响相互影响。抗菌药联合应用时抗菌作用加强的称为抗菌药联合应用时抗菌作用加强的称为协同作用协同作用；等于两药单独抗菌活性成为等于两药单独抗菌活性成为相加作用相加作用；抗菌作用减弱的称为抗菌作用减弱的称为拮抗作用拮抗作用；相互无影响的称为相互无影响的称为无关作用无关作用；常用的联合抗菌试验的方法有以下常用的联合抗菌试验的方法有以下2 2种。种。1 1、棋盘格法、棋盘格法棋盘稀释法是常用的定量方法，首先分别测定拟联棋盘稀释法是常用的定量方法，首先分别测定拟联合的抗菌药物对检测菌的合的抗菌药物对检测菌的MIC。药物最高浓度为药物最高浓度为MIC的的2倍，对倍稀释。两种药物的倍，对倍稀释。两种药物的稀释分别在方阵的纵列和横列进行，这样在每管稀释分别在方阵的纵列和横列进行，这样在每管（孔）中可得到不同浓度组合的两种药物混合液。（孔）中可得到不同浓度组合的两种药物混合液。接种菌量为接种菌量为5105CUFml，35孵育孵育18h24h后后观察结果。计算部分抑菌浓度观察结果。计算部分抑菌浓度（FIC）指数指数。药物及浓度 青霉素G(IUm1)链霉素单药对照 4 2 1 0.5 0.25链霉素（gml）64 -32 -16 -8 -+4 -+青霉素G单药对照 -+细菌对照-：无细菌生长：无细菌生长+：有细菌生长：有细菌生长 FIC指数指数=11+1616=2无关无关0.5为协同作用；为协同作用；0.51为相加作用；为相加作用；12为无关作用；为无关作用；2为拮抗作用。为拮抗作用。棋盘棋盘法的设计法的设计棋盘棋盘法的主要优点在于甲、乙两药的每个药物浓度都有单法的主要优点在于甲、乙两药的每个药物浓度都有单独的和与另一个药物不同浓度的联合，因此能精确测定两独的和与另一个药物不同浓度的联合，因此能精确测定两种抗菌药物在适当浓度的比例下所产生的相互作用。种抗菌药物在适当浓度的比例下所产生的相互作用。在进行在进行棋盘棋盘法之前应先测定两种抗菌药物单独对受试菌的法之前应先测定两种抗菌药物单独对受试菌的MIC，然后以两药然后以两药MIC的的8倍、倍、4倍、倍、2倍、倍、1倍以及倍以及MIC的的1/2、1/4、1/8浓度（或浓度（或4倍、倍、2倍、倍、1倍、倍、1/2、1/4浓度）分浓度）分别进行联合。可见举例，如表别进行联合。可见举例，如表1的青霉素的青霉素G与链霉素联合与链霉素联合药敏实验和表药敏实验和表2的的TMP+SMZ的联合作用。的联合作用。联合药物敏感试验和杀菌试验的意义联合药物敏感试验和杀菌试验的意义治疗混合性感染；治疗混合性感染；预防或推迟细菌抗生素耐药性的发生；预防或推迟细菌抗生素耐药性的发生；联合用药可以减少剂量以避免达到毒性剂量；联合用药可以减少剂量以避免达到毒性剂量；联合用药比单一用药时效果更好。联合用药比单一用药时效果更好。2、琼脂扩散纸条法、琼脂扩散纸条法将两种含药纸片贴于已涂布试验菌的将两种含药纸片贴于已涂布试验菌的MH琼脂平板琼脂平板表面，培养表面，培养24h后观察结果。后观察结果。培养后观察两药形成的抑菌区的图形来判断两药培养后观察两药形成的抑菌区的图形来判断两药联合应用时，是无关、相加、协同还是拮抗作用联合应用时，是无关、相加、协同还是拮抗作用（P148）。）。二、药物的体内抗菌试验二、药物的体内抗菌试验药物的体内抗菌试验又称为药物的体内抗菌试验又称为动物试验治疗试验动物试验治疗试验或或保护力试验保护力试验。当抗菌药物进入机体后，其效力的发挥要受体内当抗菌药物进入机体后，其效力的发挥要受体内各种因素的影响。因此在评定新药的药效时除做各种因素的影响。因此在评定新药的药效时除做体外抗菌试验外还需要做体内的抗菌试验。体外抗菌试验外还需要做体内的抗菌试验。设立对照组设立对照组三、影响抗菌试验的因素三、影响抗菌试验的因素 1、试验菌：常用细菌、霉菌和酵母菌的、试验菌：常用细菌、霉菌和酵母菌的标准菌标准菌 株；特殊情况下用分离株株；特殊情况下用分离株 （传代次数；对数期传代次数；对数期）2、培养基、培养基：按各试验菌的营养要求进行配制，严：按各试验菌的营养要求进行配制，严格控制各种原料、成分的质量及培养基的配制过程；格控制各种原料、成分的质量及培养基的配制过程；不能含有降低药物活性的成分或对抗物不能含有降低药物活性的成分或对抗物。3、抗菌药物、抗菌药物：药物的物理状态、浓度、稀释方法：药物的物理状态、浓度、稀释方法等都会直接影响抗菌试验的结果，必需精确配制。等都会直接影响抗菌试验的结果，必需精确配制。（均质；均质；PH值为中性；中草药值为中性；中草药）4、对照试验、对照试验：为确保试验结果的科学性和准确性，：为确保试验结果的科学性和准确性，试验时应同时进行各种对照试验。试验时应同时进行各种对照试验。试验菌对照试验菌对照-在无药情况下，应能在培养基内正常在无药情况下，应能在培养基内正常生长。生长。溶剂及稀释液对照溶剂及稀释液对照-配制抗菌药物时所用的溶剂及配制抗菌药物时所用的溶剂及稀释液均应无抗菌作用。稀释液均应无抗菌作用。已知药物对照已知药物对照-应使已知抗菌药物对标准菌株出现应使已知抗菌药物对标准菌株出现抗菌效应。抗菌效应。灭菌和无菌制剂灭菌和无菌制剂：直接注入体内或直接接触创伤面、：直接注入体内或直接接触创伤面、粘膜等的一类制剂。粘膜等的一类制剂。灭菌制剂灭菌制剂：采用某一物理或化学方法将杀灭或除去：采用某一物理或化学方法将杀灭或除去所有活的微生物繁殖体和芽孢的一类药物制剂。所有活的微生物繁殖体和芽孢的一类药物制剂。无菌制剂无菌制剂：采用某一无菌操作方法或技术制备的不：采用某一无菌操作方法或技术制备的不含任何活的微生物繁殖体和芽孢的一类药物制剂。含任何活的微生物繁殖体和芽孢的一类药物制剂。第二节灭菌制剂的无菌检查法第二节灭菌制剂的无菌检查法 需要进行无菌检查的药品、敷料、灭菌器具的范围需要进行无菌检查的药品、敷料、灭菌器具的范围各种注射剂各种注射剂：用于肌肉、皮下和静脉的各种针剂，包括注：用于肌肉、皮下和静脉的各种针剂，包括注射用的无菌水、输射用的无菌水、输 液、注射剂液、注射剂 原液等。原液等。眼用及外伤用制剂眼用及外伤用制剂：用于眼科手术、角膜创伤及一般创伤、：用于眼科手术、角膜创伤及一般创伤、溃疡和烧伤等外科用药制剂。溃疡和烧伤等外科用药制剂。外科用的敷料、器材外科用的敷料、器材：如外：如外 科手术用的脱脂棉、纱布、缝科手术用的脱脂棉、纱布、缝合线及一次性注射器与一次性无菌手术刀片、输血袋等。合线及一次性注射器与一次性无菌手术刀片、输血袋等。植入剂植入剂：用于包埋于人体内的药物制剂，如不溶于水的激：用于包埋于人体内的药物制剂，如不溶于水的激素、免疫药物及抗肿瘤药物等无菌的制剂。素、免疫药物及抗肿瘤药物等无菌的制剂。可吸收的止血剂可吸收的止血剂：如凝血酶等用于止血并可被组织吸收的：如凝血酶等用于止血并可被组织吸收的各种药物制剂。各种药物制剂。一、无菌检查的基本原则一、无菌检查的基本原则1、严格的无菌操作、严格的无菌操作：环境：环境+操作操作2、建立方法的验证、建立方法的验证：适合的检查方法：适合的检查方法3、相关试剂及培养条件、相关试剂及培养条件：供试品：供试品+三种培养基三种培养基+合适温度合适温度4、正确的采样、正确的采样：随机：随机+采样量和比例采样量和比例5、结果判断、结果判断：任一不合格则不合格：任一不合格则不合格二、无菌检查方法验证试验二、无菌检查方法验证试验 方法验证可与供试品的无菌检查同时进行方法验证可与供试品的无菌检查同时进行（一）试验菌株：代次（一）试验菌株：代次+保藏技术保藏技术（二）培养基：需氧菌（二）培养基：需氧菌+厌氧菌厌氧菌+真菌培养基真菌培养基（三）稀释液与冲洗液：灭菌（三）稀释液与冲洗液：灭菌（四）验证试验方法：（四）验证试验方法：菌液制备菌液制备 薄膜过滤法薄膜过滤法 直接接种法直接接种法 结果判断结果判断三、无菌检查的基本方法三、无菌检查的基本方法（一）供试品的检查数量与检验量（一）供试品的检查数量与检验量每批产品数量每批产品数量每种培养基最低检每种培养基最低检验量验量注射剂注射剂10010%或最少或最少4个个100-50010瓶（支）瓶（支）5002%或最多或最多30个个眼用及其他非注眼用及其他非注射产品射产品4每个容器每个容器2005%或最少或最少2个个20010个个桶装固体原料桶装固体原料5-5020%或最少或最少4个个502%或最少或最少10个个供试品检查的接种量、培养基装量和取供试品供试品检查的接种量、培养基装量和取供试品中国药典中国药典2000版版 单位：单位：ml供试品装量供试品装量每管每管接种量接种量直接接种法直接接种法培养基量培养基量薄膜过滤法薄膜过滤法接种培养基量接种培养基量取供试品数取供试品数(瓶、支瓶、支)1或或1以下以下全量全量15112-5以下以下半量半量15115-20以下以下2151120-50以下以下5401150-100以下以下(静静脉脉)全量全量-1005100-500全量全量-1005500以上以上500-1005无菌粉针剂无菌粉针剂11无菌粉末原料无菌粉末原料6份各份各0.5gq阳性对照菌阳性对照菌需氧菌阳性对照菌需氧菌阳性对照菌：金黄色葡萄球菌：金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003或藤黄八叠球菌或藤黄八叠球菌CMCC(B)28001厌氧菌阳性对照菌厌氧菌阳性对照菌：生孢梭状芽胞杆菌：生孢梭状芽胞杆菌CMCC(B)64941真菌阳性对照菌真菌阳性对照菌：白色念珠菌：白色念珠菌CMCC(F)98001或曲或曲霉菌霉菌ATCC16404无菌检查法无菌检查法1.直接接种法：直接接种法：适用于非抗菌作用药物检查适用于非抗菌作用药物检查2.薄薄膜膜过过滤滤法法：适适用用于于有有抗抗菌菌作作用用的的或或大大容容量量的的供试药物检查供试药物检查 各种培养基种类、数量及培养温度和时间各种培养基种类、数量及培养温度和时间 中国药典中国药典2000版版培养基种培养基种类类培养温度培养温度（）培养时间培养时间d培养基数量培养基数量试验管试验管（支）（支）阳性阳性对照对照（支）（支）阴性阴性对照对照（支）（支）需氧菌需氧菌30-355211厌氧菌厌氧菌30-365211真菌真菌20-257511无无 菌菌 检检 查查 结结 果果 分析分析供供试试品品需氧需氧菌菌厌氧厌氧菌菌真真菌菌对照试验对照试验结果结果判定判定备注备注阳性阳性阴性阴性4_ _ _ _+_合格2+_ _ _+_不合格重新取样复试2次仍有菌生长，判不合格3_ _+_ _+_不合格4_ _ _+_不合格5_ _ _ _重做按特殊药品检查6+_ _+培养基染菌或操作不严格更换培养基，重检并严格无菌操作第三节非灭菌制剂的微生物限度检查法第三节非灭菌制剂的微生物限度检查法微生物限度检查项目内容：v染菌量的检查细菌数霉菌数酵母菌数v控制菌的检查大肠埃希氏杆菌(大肠杆菌)金黄色葡萄球菌沙门氏菌铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)破伤风杆菌v活螨的检验中国药典中国药典2000版二部微生物限度标准版二部微生物限度标准(单位：个单位：个/g或个或个/ml)表表1编号剂型细菌数霉菌、酵母菌数大肠杆菌金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌1片剂1000100-2酊剂100100-3胶囊剂1000100-4软膏剂100100-5一般眼膏剂100-6一般滴眼剂100-7丸剂(滴丸、糖丸等)1000100-8气雾剂10010-9糖浆剂100100-中国药典中国药典2000版二部微生物限度标准版二部微生物限度标准 (单位：个单位：个/g或个或个/ml)表表2编号剂型细菌数霉菌、酵母菌数大肠杆菌金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌10膜剂 100/10cm2100/10cm2-11颗粒剂 1000100-12口服溶液剂、混悬剂、乳剂100100-13散剂外用散剂1000100100-14滴耳剂10010-15滴鼻剂10010-16洗剂100100-17搽剂100100-18凝胶剂100100-一、染菌量的检查一、染菌量的检查1.目的细菌数测定我们是为了考察每克或每毫升供试品所污染的活细菌数，来判明供试品被细菌污染的程度。霉菌与酵母菌数的测定是考察每克或每毫升供试品所污染的活的霉菌和酵母菌数，以此来判明供试品被真菌污染的程度。2.测定的方法细菌总数的测定 营养琼脂平板培养基+0.001%三苯四唑氯化物（TTC）霉菌总数的测定 玫瑰红钠（马丁）培养基 控制菌的检查控制菌的检查1.口服制剂中不能检出大肠杆菌口服制剂中不能检出大肠杆菌2.脏器口服制剂不得检出沙门氏菌和大肠杆菌脏器口服制剂不得检出沙门氏菌和大肠杆菌3.一般外用药和眼科制剂不得检出金黄色葡萄球一般外用药和眼科制剂不得检出金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌菌和绿脓杆菌4.用创伤、溃疡、止血、深部组织的药材药粉制用创伤、溃疡、止血、深部组织的药材药粉制剂不得检出破伤风杆菌。剂不得检出破伤风杆菌。大肠杆菌的检验大肠杆菌的检验供供试试品品供供试试液液胆胆盐盐乳乳糖糖增增菌菌液液麦麦康康凯凯（MacC）或或曙曙红红亚亚甲甲基基蓝蓝琼琼脂脂（EMB）平平板板，常常用用的的针针对对大大肠肠杆杆菌菌的的选选择择培培养养基基，进进行行分分离离培培养养纯纯培培养养染染色色镜镜检检IMVC试试验验、乳糖发酵试验、乳糖发酵试验报告结果报告结果大肠杆菌的形态及染色性大肠杆菌的形态及染色性 显微镜下的大肠杆菌显微镜下的大肠杆菌 透射电镜下的大肠杆菌透射电镜下的大肠杆菌大肠杆菌检查结果判断大肠杆菌检查结果判断曙红亚甲基蓝琼脂曙红亚甲基蓝琼脂染色镜检结果染色镜检结果IMViC结果结果无菌生长无菌生长未检出大肠杆菌未检出大肠杆菌有菌有菌生长生长菌落呈菌落呈紫黑色，紫黑色，并有金并有金属光泽属光泽两端钝圆的短两端钝圆的短小杆菌，革兰小杆菌，革兰氏阴性菌，无氏阴性菌，无芽胞，周身有芽胞，周身有鞭毛鞭毛_+_检出大肠杆菌检出大肠杆菌有菌有菌生长生长+_检出大肠杆菌检出大肠杆菌 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌检验程序检验程序 供供试试品品供供试试液液10 ml亚亚碲碲酸酸钠钠肉肉汤汤或或营营养养肉肉汤汤100 ml增增菌菌培培养养卵卵黄黄高高盐盐琼琼脂脂平平板板或或甘甘露露醇醇高高盐盐琼琼脂脂培培养养基基分分离离培培养养（含含有有高高盐盐作作用用是是抑抑制制革革兰兰氏氏阴阴性性短短杆杆菌菌生生长长，但但不不影影响响金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌正正常常生生长长）普普通通肉肉汤汤琼琼脂脂斜斜面面革革兰兰染染色色镜镜检检、金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌凝固酶试验凝固酶试验结果报告结果报告 沙门菌的检验沙门菌的检验 供试品供试品供试液供试液10ml 营养肉汤营养肉汤10ml(37，18-24h)四硫磺酸盐四硫磺酸盐增菌增菌液液，37，24h 分分离培养离培养，DHL琼脂琼脂(或或SS琼脂平板琼脂平板)或或EMB琼脂琼脂平板平板(或麦康凯琼脂平板或麦康凯琼脂平板)，37，24h 初步初步确定试验确定试验，TSI琼脂斜面琼脂斜面(37，24h)生化反生化反应（应（氰化钾试验氰化钾试验 赖氨酸脱羧试验赖氨酸脱羧试验 靛基质试验靛基质试验 尿素酶试验等）尿素酶试验等）血清学试验血清学试验 革兰染色镜检革兰染色镜检报告报告 活螨的检验活螨的检验用于口服、创伤、粘膜和腔道的药品均不得检出活螨用于口服、创伤、粘膜和腔道的药品均不得检出活螨o直接观察法直接观察法o漂浮法漂浮法o分离法分离法