第七章-化学检测-课件

第七章化学检测ppt课件化学检测技术特点：化学检测技术特点：根据物质的化学性质而对物质进行定量、定性测定。应用最早、最广泛的检测技术简便、快速、操作容易2第一节第一节 糖类的化学检测糖类的化学检测 糖类物质的测定方法糖类物质的测定方法 相对密度法相对密度法折光法折光法 旋光法旋光法物理法物理法 物理法物理法 化学法化学法 色谱法色谱法 发酵法发酵法 酶酶 法法 重量法重量法5第一节第一节 糖类的化学检测糖类的化学检测 直接滴定法直接滴定法 (改良的改良的兰兰爱农法爱农法）高锰酸钾法高锰酸钾法 萨氏法萨氏法 3，5二硝基水杨酸二硝基水杨酸 酚酚硫酸法硫酸法 蒽酮法蒽酮法 半胱氨酸半胱氨酸咔唑法咔唑法化学法化学法还原糖法还原糖法碘量法碘量法比色法比色法糖类检测的化学法糖类检测的化学法61.兰爱农法n此法以次甲基蓝为指示剂，直接用糖液滴定到斐林试剂中进行测定；或者将糖液加到斐林试剂中，再用标准葡萄糖液反滴定。又称置换法，直接滴定法或者次甲基蓝法。8n1.1原理糖液滴到斐林试剂中时，还原糖中的游离羰基与酒石酸钾钠铜反应，使二价铜离子还原生成一价的氧化亚铜沉淀。由于次甲基蓝氧化能力比二价铜弱，当二价铜离子全部被还原后，过量一滴还原糖立即使次甲基蓝还原，溶液的蓝色消失，从而显示反应终点。9第一节第一节 糖类的化学检测糖类的化学检测 还原糖的测定还原糖的测定方法方法兰爱农（Lane-Eynon）法：斐林试剂甲液：硫酸铜斐林试剂甲液：硫酸铜+次甲基蓝次甲基蓝斐林试剂乙液：酒石酸钾钠斐林试剂乙液：酒石酸钾钠+NaOH+NaOH+亚铁氰化钾亚铁氰化钾乙酸锌溶液乙酸锌溶液亚铁氰化钾溶液亚铁氰化钾溶液葡萄糖标准溶液：准确称取经葡萄糖标准溶液：准确称取经9898100100干燥至恒干燥至恒重的无水葡萄糖，加水溶解后移入重的无水葡萄糖，加水溶解后移入1000m11000m1容量瓶中，容量瓶中，加入加入5m15m1盐酸盐酸(防止微生物生长防止微生物生长)。10第一节第一节 糖类的化学检测糖类的化学检测 操作要点操作要点（1）斐林试剂的标定（a）标定预备试验A、B各5mL10mL水（250mL三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，2滴1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（0.1或0.2）V1mL。（b）标定A、B各5mL10mL水（250mL三角瓶中）摇匀，从滴定管中预先加入（V1-1)mL标准葡萄糖液，摇匀后加热加热至沸腾，2滴1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在1min内完成），记录消耗标准葡萄糖液的总毫升数V011第一节第一节 糖类的化学检测糖类的化学检测 (2)定糖（a）定糖预备试验A、B各5mL10mL样品糖液（250mL三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，2滴1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（0.1或0.2）V2mL。（b）定糖A、B各5mL10mL样品糖液（250mL三角瓶中）摇匀，补加（V0-V2）mL水，并从滴定管中预先加入（V2-1)mL标准葡萄糖液，摇匀后加热加热至沸腾，2滴1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在1min内完成），记录消耗标准葡萄糖液的总毫升数V12第一节第一节 糖类的化学检测糖类的化学检测 (3)计算还原糖含量（以葡萄糖计）（V0-V)c(1/10)n注意：（a）AB分开储存，防止Cu+变化，临用混合（b）单标移液管吸液准确，外壁也需擦干净（c）体积需控制在一定范围内，对pH有影响（d）煮沸时间要一致（e）注意指示剂加入时间和加入量一致（f）滴定速度一致（后滴定0.51mL，1min内完成）（g）产物Cu2O不稳定，次甲基蓝变色也不稳定，暴露于空气或沸腾颜色变化，滴定过程不能摇动，不可中途中止加热13第一节第一节 糖类的化学检测糖类的化学检测 斐林试剂快速法：斐林试剂快速法：在斐林试剂中加入亚铁氰化钾（黄血盐）反应终点为蓝色消失，淡黄色出现。反应终点比兰爱农法更为明显。其特点是试剂用量少，操作和计算都比较简其特点是试剂用量少，操作和计算都比较简便、快速，滴定终点明显。便、快速，滴定终点明显。14n2.2实验操作 2.2.1斐林试剂的标定吸取斐林甲、乙液各5ml，置于250ml三角瓶内，加10ml水，从滴定管中预先加入约20ml0.1标准葡萄糖液，摇匀后于电炉上加热至沸，立即用标准葡萄糖液继续滴定至蓝色消失。记录消耗葡萄糖液的总毫升数V0。15n2.2.2 样品含糖量测定 吸取斐林甲、乙液各5ml，置于250ml三角瓶内，加入样品稀释液10ml，及适量的0.1标准葡萄糖液。摇匀后按标定时相同操作进行。记录消耗标准葡萄糖液的毫升数（V)。16n2.2.3 计算还原糖含量（）（V0-V)*c*N/10式中，V0斐林试剂标定值，mlV样品糖液测定值，mlc标准葡萄糖液浓度，g/ml10样品液体积，mlN样品稀释倍数173.碘量法3.1原理此法是利用碘与氢氧化钠反应生成次碘酸钠，氧化还原糖的自由醛基，过量的碘再用硫代硫酸钠滴定，从而测定糖的含量。次碘酸钠氧化能力比较弱，所以只适用于醛糖的滴定，与酮糖不起反应。18第一节第一节 糖类的化学检测糖类的化学检测 I2NaIO(氧化剂），其氧化能力较弱，仅适用于醛糖的测定，与酮糖不起反应操作要点：（1）标准硫代硫酸钠溶液配制，0.05mol/L，沸腾后冷却水配制，存放在棕色瓶中，一周后用标准重铬酸钾标定。（2）标准碘液配制，0.1mol/L（3）空白滴定：空白液，用硫代硫酸钠滴定试剂中全部碘醛糖醛糖+I2+3 NaOH=醛糖酸钠醛糖酸钠+2 NaI+2H2OI2+2 NaOH=NaIO+NaI+H2ONaIO +NaI+2 HCl=I2+2 NaCl+H2O19第一节第一节 糖类的化学检测糖类的化学检测 碘量瓶中，10mL0.1mol/L碘液15mL0.1mol/LNaOH5mL空白液，摇匀后暗反应15min1mL1mol/L硫酸溶液，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至浅黄色，加0.2mL0.5淀粉液作指示剂，滴定至蓝色消失，记录V0(4)样品滴定：以5mL样品液代替空白液，V1(5)计算：醛糖含量（V0V1）CMn注意：暗反应后需酸化再滴定，滴定时开始轻摇（碘挥发），后再摇（淀粉吸附碘）配合次甲基蓝法测定某些糖含量（如果糖）配合次甲基蓝法测定某些糖含量（如果糖）204.铜试剂法n4.1原理铜试剂提供二价铜离子和碘，还原糖与二价铜离子反应生成的氧化亚铜被碘氧化，再用硫代硫酸钠滴定反应液中剩余的碘，从而测定样品中还原糖的含量。铜试剂中适当增加或减少硫酸铜和碘酸钾的量，就可测定不同范围的糖的含量。21n4.2 实验操作 4.2.1铜试剂配制4.2.2标准曲线制作：4.2.2.1配制葡萄糖标准液4.2.2.2取6个三角瓶，分别加入0、1、2、3、4、5ml标准葡萄糖液和5、4、3、2、1、0ml蒸馏水。4.2.2.3各瓶加入5ml铜试剂。置于沸水浴中加热10min，冷却至室温。224.2.2.4加入0.5mol/L硫酸5ml，振荡。待红色氧化亚铜沉淀完全溶解后，立即用0.005mol/L硫代硫酸钠滴定至浅黄色，加数滴淀粉指示剂，继续滴定至蓝色消失。记录所用硫代硫酸钠毫升数。4.2.2.5以葡萄糖含量为纵坐标，以空白滴定值减去标准样品滴定值得出的硫代硫酸钠毫升数为横坐标，绘标准曲线。4.2.3样品的含糖量测定将还原糖样品液适当稀释，取5ml样品液代替标准葡萄糖液，按上述方法进行测定。测样品中总糖含量，则样品经过水解后，按还原糖含量测定方法进行测定。测淀粉或半纤维素含量时，水解后测定的还原糖量要乘上系数0.9。235.比色法测糖上述4种糖检测方法都是通过滴定的方法进行糖含量的测量；此外，我们还可以通过比色法等检测糖的含量，主要有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法和DNS法等，其原理分别如下：24n5.1苯酚-硫酸法原理苯酚硫酸法主要用于多糖检测。其原理是：多糖在浓硫酸作用下水解成单糖,并迅速脱水生成糠醛衍生物,随后与苯酚结合生成有色化合物,从而可以利用分光光度计测定其吸光度,并利用标准曲线定量测定样品中的多糖含量。n5.2蒽酮-硫酸法原理非还原性糖在浓硫酸催化下，迅速水解为还原糖。还原糖与浓硫酸作用形成5-羟甲基糠醛，5-羟甲基糠醛，与蒽酮反应生成蓝绿色物质，在625nm处有最大吸收值。25n5.3DNS法原理3,5-二硝基水杨酸在中性或偏碱性条件下与多糖水解的还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物3-氨基-5-硝基水杨酸,在一定范围内,还原糖的量和反应液的颜色呈正比。265.4DNS法测发酵残糖5.4.1标准曲线的绘制预先配制好1mg/ml葡萄糖标准液。取6支具塞比色管，编号，分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8及1ml的葡萄糖标准液，再补充蒸馏水至2ml，分别添加DNS试剂3ml。将各管溶液混合均匀，在预先加热好的沸水中加热5min，取出立即用自来水冷却至室温，再向每管补充蒸馏水至25ml，小心摇匀。在分光光度计上，测520nm波长处溶液的OD值。以葡萄糖mg数为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。275.4.2发酵残糖的测定准确吸取已分离菌体后的发酵液1ml，用蒸馏水稀释至适当倍数得到稀释液。精确吸取稀释液1ml，按照5.4.2中的方法测定OD值，根据DNS法标准曲线和稀释倍数计算发酵液残糖含量。28注意事项：a.实验中OD值最好在0.20.8范围内。发酵液中残糖比较高，所以可能需要进行预备实验，根据实验结果对发酵液进行适当的稀释。b.发酵液和其他试剂在具塞试管内要充分混合均匀。c.沸水浴的时间要严格掌握好，时间过长会使溶液颜色加深，实验误差变大。29第一节第一节 糖类的化学检测糖类的化学检测 蔗糖是葡萄糖和果糖组成的双糖，没有还蔗糖是葡萄糖和果糖组成的双糖，没有还原性，不能用碱性铜盐试剂直接测定，但在一定原性，不能用碱性铜盐试剂直接测定，但在一定条件下，蔗糖可水解为具有还原性的葡萄糖和果条件下，蔗糖可水解为具有还原性的葡萄糖和果糖（转化糖）。因此，可以用测定还原糖的方法糖（转化糖）。因此，可以用测定还原糖的方法测定蔗糖含量。对于纯度较高的蔗糖溶液，其相测定蔗糖含量。对于纯度较高的蔗糖溶液，其相对密度、折光率、旋光度等物理常数与蔗糖浓度对密度、折光率、旋光度等物理常数与蔗糖浓度都有一定关系，故也可用物理检验法测定。这里都有一定关系，故也可用物理检验法测定。这里介绍还原糖法。介绍还原糖法。蔗糖的测定蔗糖的测定30第一节第一节 糖类的化学检测糖类的化学检测 淀粉的测定方法有多种，部分是根据淀粉淀粉的测定方法有多种，部分是根据淀粉的理化性质而建立的。常用的方法有：的理化性质而建立的。常用的方法有：酸水解法酸水解法酶水解法酶水解法旋光法旋光法酸化酒精沉淀法。酸化酒精沉淀法。淀粉的测定方法淀粉的测定方法31第一节第一节 糖类的化学检测糖类的化学检测 酸水解法酸水解法 （一）（一）原理原理样品经乙醚除去脂肪，乙醇除去可溶性糖类后，用盐酸水解淀粉为葡萄糖，按还原糖测定方法测定还原糖含量，再折算为淀粉含量。淀粉水解于250m1锥形瓶中加入30ml6mol/L盐酸，装上冷凝管，置沸水浴中回流2h,速冷。蔗糖水解：于250m1锥形瓶中加入5ml6mol/L盐酸，置6870水浴中15min,速冷。32第一节第一节 糖类的化学检测糖类的化学检测 酶水解法酶水解法（一）（一）原理：原理：含淀粉含淀粉 糊精、麦芽糖糊精、麦芽糖 葡萄糖葡萄糖样品样品酸解液化糖化酸解淀粉酶水解有选择性33二.蛋白质和氨基酸定量检测n蛋白质的定性定量分析是生物化学和其他生物学科、食品检验、临床检验诊断疾病、生物药物分离提纯和质量检验中最常用的手段。34第二节第二节 蛋白质与氨基酸的化学检测蛋白质与氨基酸的化学检测 （1 1）一切蛋白质都含）一切蛋白质都含N N元素，且各种蛋白质的元素，且各种蛋白质的含氮量很接近，平均为含氮量很接近，平均为1616；（2 2）蛋蛋白白质质系系数数：任任何何生生物物样样品品中中每每1g1g元元N N的的存存在在，就就表表示示大大约约有有100/16=6.25100/16=6.25蛋蛋白白质质的的存存在在，6.256.25常称为蛋白质常数常称为蛋白质常数100克样品中蛋白质的含量克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数每克样品含氮克数 6.251001/16%蛋白质元素组成的特点：蛋白质元素组成的特点：35第二节第二节 蛋白质与氨基酸的化学检测蛋白质与氨基酸的化学检测 含氮量 每gN相当P肉、蛋、豆 16 6.25 面粉 17.6 5.70 奶品 15.7 6.38 花生 18.2 5.50 鲑精蛋白 31.5 3.17361.凯氏定氮法n1.1原理将样品与浓硫酸共热时蛋白质分解，其中氮与硫酸反应生成硫酸胺，然后碱化蒸馏使氨游离。氨由硼酸吸收生成硼酸铵以标准酸滴定。从而可以计算出含氮量。滴定时以甲基红-溴甲酚绿混合液为指示剂，滴至溶液变为紫红色即为终点。也可用标准酸吸收氨，再用标准碱滴定剩余酸。（甲基橙为指示剂，黄色为终点）37常量凯氏定氮装置38微量凯氏定氮装置简图39微量凯氏定氮装置40n1.2 实验操作 1.2.1 样品处理 固体样品应在105干燥至恒重。液体样品可直接吸取一定量或者稀释后吸取一定量进行测定，应该使样品的含氮量在0.21.0mg范围内。41n1.2.2 消化 取一定量样品，于50ml干燥的凯氏烧瓶内。加入300mg硫酸钾硫酸铜混合粉末，再加入3ml浓硫酸。电炉加热，在通风橱中消化，瓶口加一小漏斗，先以文火加热避免泡沫飞溅，不能让泡沫上升到瓶颈，待泡沫停止发生后，加强火保持瓶内液体沸腾。时常转动烧瓶使样品全部消化完全，直到消化液清澈透明。另取凯氏烧瓶一个，不加样品，其他操作相同，作空白对照。42n1.2.3 蒸馏n将微量凯氏蒸馏装置洗涤干净。将凯氏烧瓶内的消化液冷却后，全部转入100ml容量瓶中。凯氏烧瓶用蒸馏水洗涤三次，洗涤液全部转入容量瓶内，再用蒸馏水定容。n 吸取20ml稀释消化液，置于蒸馏装置反应室中，加10ml30氢氧化钠溶液，将玻璃塞塞紧，漏斗中加少许蒸馏水作为水封。n取一三角瓶，加入10ml硼酸田氏指示剂混合液，置于冷凝管下口，冷凝管口浸没在硼酸液面之下，保证氨的吸收。n 加热水蒸气发生器，沸腾后。夹紧夹子，开始蒸馏。三角瓶中硼酸指示剂混合液吸收蒸出来的氨，由紫红色变为绿色。蒸馏15min，让硼酸液面离开冷凝管口，再蒸12min冲洗冷凝管口。空白试验按相同操作进行。43n1.2.4 滴定n样品和空白均蒸馏完毕后，用0.01mol/L标准盐酸滴定，至硼酸指示剂混合液由绿色变回紫红色，即为滴定终点。44n1.2.5 计算 样品总氮含量（mg）（A-B）*C*14*100/20 式中，A样品滴定时消耗的标准盐酸体积，ml B空白滴定时消耗的标准盐酸体积，ml C标准盐酸的当量浓度 14氮的相对分子质量 20用于蒸馏的稀释消化液体积，ml 100稀释消耗液体积，ml 样品粗蛋白含量（mg）样品总氮含量*6.25452.双缩脲试剂法(Biuret法)n2.1 原理 蛋白质含有两个以上的肽键，具有双缩脲反应，即蛋白质在碱性溶液中与二价铜离子结合，生成紫红色络合物。络合物的颜色深浅与蛋白质含量成正比，而与蛋白质的相对分子质量和氨基酸组成无关。46n2.2 实验操作 2.2.1 双缩脲试剂的配制 配置的溶液若出现黑点或红色沉淀时，则不能再用。加入0.1碘化钾可防止铜的析出。2.2.2 标准曲线的制作 于试管中分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml1酪蛋白溶液，用水补足至1ml。然后加入4ml双缩脲试剂，充分摇匀在室温下反应30min，于540nm波长下测定光吸收率。以酪蛋白含量为横坐标，光吸收率为纵坐标，绘制标准曲线。47n2.3 样品测定 取样品溶液1ml，加入4ml双缩脲试剂，摇匀后在室温下反应30min测定540nm处光吸收率，根据标准曲线查处蛋白质含量。3.注意：a.双缩脲试剂法测定范围为110mg蛋白质。b.双缩脲并非蛋白质的特效反应，所以测定前必须先使蛋白质完全沉淀，去除其他干扰物质。c.双缩脲法操作简便，快速，但测定不是十分精确。硫酸铵不干扰反应，但Tris缓冲液等给予阳性反应，干扰蛋白质测定。483.福林-酚试剂法(lowry法)n3.1 原理 福林-酚试剂由两种试剂组成，其中的碱性铜试剂能与蛋白质中的肽键发生双缩脲反应生成蛋白质-铜复合物。另一种稀释的苯酚试剂则与酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸残基反应，呈现蓝色。两种显色反应可以叠加，所以此法具有很高的敏感性。49n3.2 实验操作 3.2.1 福林-酚试剂的配制 3.2.2 蛋白质标准溶液配制 准确称取一定量的结晶牛血清蛋白，溶于0.9的NaCl溶液中，配制成适当浓度的标准液。（也可用酪蛋白，但需要经凯氏定氮法测定其蛋白质含量）50n3.2.3 样品的测定 取1ml样品液（含蛋白质15500ug），加入5ml试剂甲，混匀于室温放置10min，再加入试剂乙0.5ml，立即混匀，于室温反应30min。然后选择500750nm间一个波长，以蒸馏水作空白对照测定吸光率。蛋白质含量高时，选择靠近500nm波长测定；含量低时，选择靠近750nm波长测定。514、紫外吸收法n由于蛋白质分子中，酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度与蛋白质含量成正比，可用作定量测定。n紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，n利用280nm进行紫外检测，来判断蛋白质吸附或洗脱情况是最常用的方法。52n紫外吸收法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。n若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。n因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。535、考马斯亮兰法（Bradford法）n1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。n考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。n在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。54Bradford法的优点：n灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。n测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。n干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。55Bradford法的缺点：n由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 G-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。n仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。n标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。566、茚三酮显色法测定氨基酸含量n6.1原理 茚三酮溶液与氨基酸共同加热，生成氨。氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物。其颜色深浅与氨基酸含量成正比，可通过测定570nm处的光密度测定氨基酸含量。57n6.2 实验操作n6.2.1 标准曲线制作 分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml0.3mmol的标准氨基酸溶液于试管中，用水补足至1ml。各加入1mlpH5.42mol/L醋酸缓冲液；再加入1ml茚三酮显色液，充分混合后，盖住试管口，在100水浴中加热15min，用自来水冷却。放置5min后，加入3ml60乙醇稀释，用分光度计测定OD570。以OD570为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。58n6.2.2 样品氨基酸的测定n 取样品液1ml，加入1mlpH5.42mol/L醋酸缓冲液；再加入1ml茚三酮显色液，充分混合后，盖住试管口，在100水浴中加热15min，自来水冷却。放置5min后，加入3ml60乙醇稀释，用分光度计测定OD570。（生成 的颜色在60min内稳定）n将样品OD570测定与标准曲线对照，即可确定样品中氨基酸含量。59n注意事项：脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈现黄色，应该在440nm处测 光密度，从而测定氨基酸含量。测量氨基酸含量还有甲醛滴定法等等，因时间关系，在此不作具体介绍。6061三.蛋白质氨基酸序列测定n 蛋白质或多肽N-末端分析方法有二硝基氟苯法（DNFB或FDNB法）、丹磺酰氯法（DNS法）、苯异硫氰酸脂法（PITC法）和氨肽酶法等；n C-末端分析方法有肼解法、还原法和羧肽酶法等。621.丹磺酰氯法（DNS法）n1.1 原理 蛋白质的-氨基与荧光试剂丹磺酰氯在碱性条件下反应，生成丹磺酰-蛋白质（DNS-蛋白质）。DNS-蛋白质经水解可生成DNS-氨基酸，DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析进行分离和检测，从而可知道蛋白质的N-末端氨基酸。此法灵敏度高，比茚三酮法高10倍以上，比二硝基氟苯法高100倍以上，可使用于蛋白质的氨基酸组成的测定。63n1.2 实验操作 1.2.1 丹磺酰反应 取0.20.5mg蛋白质样品置于有塞的微型试管中，加入0.5ml0.2mol/L碳酸氢钠溶液，再加入0.5ml0.2DNS-Cl丙酮溶液，用三乙胺调pH至9.0-9.5，塞好，于40烘箱中反应2h，或室温反应2-4h。反应结束后，用真空干燥除去丙酮。1.2.2 水解 将上述干燥的反应物用0.5ml6mol/L盐酸水解后，移至水解管，抽真空密封管口，于105-110水解18-24h。开管后，蒸去盐酸。641.2.3 检测 将上述水解物用0.5ml50吡啶溶液溶解后，进行聚酰胺薄膜层析。或者用0.5ml乙酸乙酯抽提，将抽提液干燥除去乙酸乙酯，用少量丙酮溶解后进行聚酰胺薄膜层析。层析后，在360nm或280nm波长紫外光灯下可看到层析谱呈黄色荧光的DNS-氨基酸斑点与标准DNS-氨基酸层析图谱比较，就可确定N-末端氨基酸。652.Edman法 Edman法，即异硫氰酸苯脂分析法，也称PTC法。其优点是在切下N-末端氨基酸残基时，链的其他氨基酸残基不受影响，Edman试剂很容易和大多数的N-末端氨基酸残基反应，所以广泛应用于蛋白质和多肽的氨基酸序列分析中。66n2.1 原理 蛋白质（多肽）的游离-氨基与异硫氰酸苯脂反应形成苯氨基硫甲酰-蛋白质（PTC-蛋白质）。PTC-蛋白质在无水的酸中裂解产生噻唑啉酮衍生物，而肽的其他部分被完整地释放出来。噻唑啉酮衍生物水解生成苯氨基硫甲酰-氨基酸（PTC-氨基酸），然后再环化生成乙内酰苯硫脲氨基酸（PTH-氨基酸），经过聚酰胺薄膜层析，再与标准PTH-氨基酸层析图谱比较，就可确定蛋白质（多肽）的N-末端氨基酸。67n2.2 实验操作 2.2.1 蛋白质PTC化 取0.210mg蛋白质，用0.1ml水溶解，加入等体积的吡啶，用0.1mol/L氢氧化钠调pH到8.79.0，加入0.1ml异硫氰酸苯脂，摇匀，在室温反应2h，生成PTC-蛋白质后，真空干燥去除吡啶。2.2.2 PTC衍生物的环化 PTC-蛋白质中加入0.2ml无水三氟醋酸，盖严于40保温30min，生成PTC-氨基酸后，再真空干燥除去三氟醋酸。然后加入0.2ml蒸馏水，水解，环化生成PTH-氨基酸。68 2.2.3 PTH-氨基酸的抽提 在上述的PTH-氨基酸和残肽混合液中加入0.15ml有机溶剂（苯、乙酸乙酯等）抽提，振荡分层后，吸取有机相。再重复抽提二次，合并有机相，真空干燥得到PTH-氨基酸。水相含残肽，干燥后可继续测下一个N-末端氨基酸。2.2.4 PTH-氨基酸的检测 直接用聚酰胺薄膜层析检出PTH-氨基酸，或者将其水解成游离氨基酸用纸层析或氨基酸自动分析仪检测。693.2，4二硝基氟苯测定法n3.1 原理 FDNB能在温和条件下（室温、pH8-9)与蛋白质的自由-氨基定量地发生反应，生成DNP蛋白质。DNP蛋白质经酸水解，生成DNP氨基酸和氨基酸混合液。用有机溶剂抽提，除了碱性氨基酸的DNP衍生物留在水溶液中，其他DNP氨基酸都在有机相中。DNP氨基酸呈现黄色，可用聚酰胺薄膜层析或其他层析，电泳分离后再进行定性定量测定。70n3.2实验操作 3.2.1 蛋白质的二硝基苯化 称取一定量的蛋白质（1-2umol），加入等量的碳酸氢钠，溶于5ml水中，再加入2倍体积的5 FDNB乙醇溶液，混匀，盖紧，于室温下避光振摇2h。反应结束后，用一定量的盐酸酸化，离心收集沉淀。沉淀用1：1乙醇-乙醚相继洗涤。所得DNP蛋白质置于干燥器中避光干燥。71 3.2.2 DNP蛋白质水解 DNP蛋白质放入水解管，加入2ml5.7mol/L恒沸点盐酸，抽气封管，于105烘箱中水解4-24h。3.2.3 DNP氨基酸抽提 水解完毕启封后，用2-3倍体积的蒸馏水稀释，再用乙醚提取三次，合并醚层，以去除残酸。醚层提取液蒸干乙醚后，得醚溶性DNP氨基酸（中性与酸性氨基酸）。水层蒸干后，反复用水溶解和蒸干，得到碱性氨基酸的DNP衍生物。72 3.2.4 DNP氨基酸检测 将DNP氨基酸加少许丙酮溶解，点样进行聚酰胺薄膜双向层析，用下列溶剂系统展开：苯：冰醋酸80：20（V/V）88甲酸：水50：50（V/V）将层析图谱与标准DNP氨基酸层析图谱比较，可确定蛋白质的N-末端氨基酸。将图谱中的黄色斑点剪下，用1碳酸氢钠洗脱后，在360nm的波长下测定光密度可进行定量测定。73四.蛋白质的免疫检测(单独讲解）n 蛋白质的免疫化学检测是指利用抗原与抗体之间的特异结合反应而对蛋白质进行定性定量分析的技术。n免疫反应具有特异性强，灵敏度高的特点，非常使用于蛋白质的检测。74五.核酸的化学检测n根据核酸中所含的磷及戊糖的化学性质测定核酸的含量，主要方法有定磷法、二苯胺法和地衣酚法。751.定磷法n1.1 原理 核酸中含的磷，用强酸消化，变成无机磷。无机磷在酸性条件下与钼酸铵反应生成磷钼酸。在还原剂作用下，磷钼酸生成蓝色的化合物钼蓝。钼蓝在650-660nm波长处有最大吸收峰，通过测定OD650，测定磷的含量，进一步可算出核酸含量。76n1.2 实验操作1.2.1 标准曲线的制作准备不同含量的无机磷溶液各 1ml加蒸馏水2ml和定磷试剂3ml，混匀，于45恒温水浴中反应25min。冷却至室温，于650nm波长处测光密度OD650。以标准磷含量（mg）作横坐标，OD650为纵坐标绘制标准曲线。771.2.2 核酸的消化 取1ml1的核酸溶液，加入2-3ml5mol/L硫酸，于凯氏烧瓶中，140-160下消化2-4h。待溶液呈黄褐色后，取出，稍冷，加入1-2滴30双氧水，继续消化，直到溶液透明为止。取出冷却后加1ml蒸馏水，在沸水浴中加热10min，以分解消化过程中形成的焦磷酸。然后移到100ml容量瓶中定容。78n1.2.3 总磷和无机磷的测定 取样品液1ml加蒸馏水2ml和定磷试剂3ml，混匀，于45恒温水浴中反应25min。冷却至室温，于650nm波长处测光密度OD650。用1ml蒸馏水代替样品液作空白对照。取1ml1核酸溶液，不经消化，稀释100倍。取1ml按上述方法测OD650。根据标准曲线查出对应的总磷和无机磷含量。79n1.2.4 核酸的计算RNA量（总磷-无机磷）*10.9DNA量（总磷-无机磷）*10.5注意定磷剂的配制：3mol/L硫酸：水:2.5%钼酸铵：10Vit C=1：2：1:1，当天混合使用。802.二苯胺法n2.1 原理nDNA中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应。在595nm处有最大吸收峰。在40400ug范围内，OD与DNA浓度成正比。少量的乙醛可提高反应灵敏度，在使用前加入到配制好的二苯胺试剂中。81n2.2 实验操作 2.2.1 二苯胺试剂配制 2.2.2 标准曲线制作 取一定量的标准DNA，用0.01mol/L氢氧化钠溶液配成200ug/ml的DNA标准液。分别吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml DNA标准液，补足蒸馏水至2ml。然后各加入3ml二苯胺试剂，混匀，于60水浴中保温1h。冷却后，分别测定OD595。以DNA浓度为横坐标，OD595为纵坐标，绘制标准曲线。822.2.3 样品种DNA含量测定 准确称取一定量的样品，用0.01mol/L氢氧化钠溶液配成一定浓度。取2ml样品液按上述方法测定OD595，从标准曲线查出样品液中的DNA含量。注意：脱氧木糖和阿拉伯糖也有此反应，可能会造成干扰。833.地衣酚法测RNA含量n3.1 原理n核糖核酸在浓盐酸和三氯化铁存在下，与3,5二羟甲苯反应生成绿色物质，该绿色物质在670nm处有光吸收高峰，在一定浓度范围内，吸光度和RNA浓度成正比。84n3.2 实验操作 3.2.1 地衣酚试剂的配制 3.2.2 标准曲线的制作 称取标准RNA，用蒸馏水配制成100ug/ml的RNA标准液，分别吸取0、0.5、1.0、1.5、2、2.5ml标准液，分别添加蒸馏水至2.5ml。然后各自加入2.5ml地衣酚试剂。混匀后，于沸水浴中加热30min，冷却后测定OD670。以RNA含量为横坐标，OD670为纵坐标，绘制标准曲线。85n3.2.3 样品RNA的测定 取2.5ml样品液，按上述方法测OD670。根据标准曲线查出RNA含量。注意;因为所有戊糖均可进行地衣酚反应，所以DNA会干扰测量。86