第一章1-紫外可见分光光度法课件

第一章第一章 光谱分析光谱分析1 光是一种电磁辐射光是一种电磁辐射,透过介质时将吸透过介质时将吸收一定波长的光收一定波长的光,反射或透过另一部分波反射或透过另一部分波长的光长的光.光谱分析法就是以测定物质发射或吸光谱分析法就是以测定物质发射或吸收的电磁辐射的波长和强度为基础建立收的电磁辐射的波长和强度为基础建立起来的分析方法起来的分析方法.2p紫外、可见分光光度紫外、可见分光光度法法p荧光分光光度法荧光分光光度法p原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法p红外光谱法红外光谱法3紫外可见分光光度法一、概述一、概述 紫外、可见分光光度法又称紫外、可见吸收光谱法，是基于分子内电子跃迁产是基于分子内电子跃迁产生的吸收光谱进行分析测定的一种仪器分生的吸收光谱进行分析测定的一种仪器分析方法析方法，波长范围200800nm。45U运动状态：电子运动、组成分子的各原子间振动、分子的整体转动U对应能级：电子能级、振动能级、转动能级U相应光谱:电子光谱、振动光谱、转动光谱6特点特点 v灵敏度高灵敏度高：痕量分析（0.0010.0001%）、微量分析（0.0011）、常量分析（150）v准确度高准确度高：相对误差25v仪器简单、价格便宜、操作方便仪器简单、价格便宜、操作方便v应用广泛应用广泛：含有生色团和共轭体系的有机化合物的鉴定，几乎所有金属元素的测定，也能用于非金属元素分析。7二、方法原理二、方法原理 紫外、可见吸收光谱起源于分子中电子能级的变化,各种化合物的紫外、可见吸收光谱的特征是分特征是分子中电子在各种能级间跃迁的内在规律的体现子中电子在各种能级间跃迁的内在规律的体现.8 1.1.有机化合物的紫外、可见吸收光谱有机化合物的紫外、可见吸收光谱 有机化合物的紫外、可见吸收光谱取决于有有机化合物的紫外、可见吸收光谱取决于有机化合物分子的结构。从化合物的性质来看机化合物分子的结构。从化合物的性质来看,与与紫外、可见吸收光谱有关的电子跃迁：紫外、可见吸收光谱有关的电子跃迁：n-*n-*跃迁：含杂原子跃迁：含杂原子N N、O O、P P、S S和卤素原子的和卤素原子的饱和有机化合物发生此跃迁；饱和有机化合物发生此跃迁；-*-*跃迁和跃迁和n-*n-*跃迁：要求有机化合物分子跃迁：要求有机化合物分子中含不饱和基团，如：中含不饱和基团，如：C CC,CC,CO,CNO,CN9生色团生色团：分子中能吸收紫外或可见光的结构单元分子中能吸收紫外或可见光的结构单元.均含键基团。助色团助色团：能使生色团吸收峰向长波长位移并增强吸能使生色团吸收峰向长波长位移并增强吸收强度收强度.并无生色作用，但能增加生色团的生色能力，含有n未成键电子，如-OH，-SH，-X，-NH2-*跃迁跃迁：产生强吸收带，摩尔吸收系数达达104L/（mol cm）n-*跃迁跃迁：吸收光谱强度小，一般在500L/（mol cm）以下1011 如有机化合物含几个生色团含几个生色团,生色团之间由单键分开,不产生共轭效应,则该化合物的吸收光谱基本上由这些生色团的吸收带组成;如有机化合物含多个相同的生色团多个相同的生色团,其吸收峰的波长基本不变,而摩尔吸收系数将随生色团数目而增加;如有机化合物分子中生色团发生共轭作用共轭作用,则原有吸收峰将发生位移,同时摩尔吸收系数增大.12 溶剂效应溶剂效应：溶剂极性的波动引起某些化合物吸收光谱的红移或蓝移。极性较大的溶剂，一般使-*跃迁谱带向长波方向移动，称为红移；极性较小的溶剂，一般使n-*跃迁谱带向短波方向移动，称为蓝移。红移效应红移效应：吸收峰的max向长波方向移动的现象。如某些有机化合物经取代反应引入含有未共享电子对的基团之后(例例:有机苯有机苯)蓝移效应蓝移效应：吸收峰的max向短波方向移动的现象。如在生色团一端引入一些取代基后。132.朗伯朗伯-比尔定律比尔定律Lambert-Beer 在一定条件下，物质的吸光度与溶液浓度和溶液厚度的乘积成正比。光度法定量分析依据：A=bc A=lg1/T=lgI0/I成立条件：t样品溶液因素样品溶液因素：仅在稀溶液成立t仪器因素仪器因素：只适用于单色光14三、仪器的结构与原理三、仪器的结构与原理记录仪记录仪光源光源检测器检测器分光分光器器吸收池吸收池15161.辐射光源辐射光源 能发射足够强度的连续光谱，稳定性好，辐射能力随波长无明显变化，使用寿命长。钨灯钨灯：可见光区的连续光源，在可见的能量只占钨灯总辐射能的11左右，波长范围3002500nm氘灯氘灯：近紫外区光源，在160375nm处产生连续光谱，其辐射强度比氢灯约大4倍172.分光器分光器 从连续光谱中分离出所需要的足够窄波段的光束，核心部件，其性能直接影响光谱带通的宽度，从而影响测定的灵敏度、选择性和工作曲线的线性范围。v分光器由入射狭缝、反射镜、色散元件、出入射狭缝、反射镜、色散元件、出射狭缝射狭缝组成v常用色散元件有棱镜和光栅。光栅在整个波长区可提供良好的、均匀一致的分辨能力，而且成本低，便于保存。183.吸收池吸收池 根据材料分为玻璃和石英吸收池，前者用于可见区，后者用于紫外和可见光区，光学区必须平整光洁，尺寸和构造根据使用要求选用。194.检测器检测器 检测光信号，并将光信号转变为电信号。要求灵敏度高，响应时间短，线性关系好，对不同波长的辐射具有相同的响应，噪声低，稳定性好等。现在广泛使用的检测器是光电倍增管光电倍增管。205.记录器记录器和信号显示系统和信号显示系统 电信号再经适当放大后，用记录器进行记录，或用数字显示。微机处理机(信号记录和处理、对分光光度计进行操作控制)v常有的可见分光光度计有721型分光光度计和722型分光光度计等.紫外分光光度计为751型分光光度计和753型分光光度计等.21四、实验技术四、实验技术1.样品的制备样品的制备 紫外、可见吸收光谱测定通常在溶液在溶液中进行中进行.对光谱分析溶剂的要求溶剂的要求:良好的溶解能力,在测定波段没有明显的吸收,被测组分在溶剂中具良好的吸收峰形,挥发性小,不易燃,无毒性,价格便宜.22232.参比溶液的选择参比溶液的选择 溶剂参比溶液溶剂参比溶液:待测组分溶液的组成较简单,共存组分在测定波长光吸收值很小时,可用溶剂作为参比溶液,可消除溶剂、吸收池等因素影响.试剂参比溶液试剂参比溶液:如显色剂或其他试剂在测定波长有吸收,按显色反应相同的条件,以不加入试样的溶液作为参比溶液.243.测定条件的选择测定条件的选择波长的选择波长的选择:max(除:待测组分的max受共存杂质干扰或待测组分浓度太高)狭缝的选择狭缝的选择:不减少吸光度时的最大狭缝宽度不减少吸光度时的最大狭缝宽度吸光度范围吸光度范围:0.20.8 254.反应条件的选择反应条件的选择u溶液酸度溶液酸度:直接影响待测组分的吸收光谱、显色剂形态、待测组分的化合状态及显色化合物组成.u显色剂浓度显色剂浓度:过量的显色剂可使显色反应趋于完全,但过量太多,有可能改变有色化合物的组成,影响化合物的颜色.u温度的影响温度的影响:室温室温u显色时间显色时间:由于显色反应速率不同,达到反应完全所需的时间;有色化合物维持稳定的时间.265.共存离子的干扰共存离子的干扰 如共存组分本身有颜色,或能与显色剂反应生成有色化合物,将使测定结果偏高;如共存组分与显色剂反应,使显色剂或被测组分的浓度减少,影响显色反应的完成,会使测定结果偏低.消除干扰方法：消除干扰方法：v加入适当的掩蔽剂加入适当的掩蔽剂:与体系中干扰物质进行配合反应,降低干扰物质的浓度,减少对待测组分的影响.v改变干扰离子的价态改变干扰离子的价态:用氧化剂或还原剂改变干扰离子的价态,使其不影响待测组分的测定.v选择适当的波长选择适当的波长:仅在干扰组分与待测组分的吸收峰波长相距较大的情况下才能使用v预分离预分离:将干扰组分与待测组分分开27五、紫外、可见吸收光谱的应用范围五、紫外、可见吸收光谱的应用范围 1.定性分析定性分析 将未知物测定到的光谱参数与已知化合物进将未知物测定到的光谱参数与已知化合物进行比较行比较,从而确定未知物的基本性质从而确定未知物的基本性质.注意:p测试溶剂测试溶剂:对标准物和待测物有良好的溶解度对标准物和待测物有良好的溶解度,本身在测本身在测定的波长内无光吸收定的波长内无光吸收,有较好的稳定性有较好的稳定性;p测试的条件测试的条件:标准物和待测物的测试条件要完全相同；标准物和待测物的测试条件要完全相同；p更改测试条件更改测试条件:为防止测试数据的假象为防止测试数据的假象,对现有某些条件对现有某些条件进行适当的变换进行适当的变换,改变其中的某些测定条件改变其中的某些测定条件,然后看标准然后看标准物和待测物的吸收光谱是否仍然完全相同物和待测物的吸收光谱是否仍然完全相同.282.纯度鉴定纯度鉴定 一种纯物质在一定的条件、一定的波长范围内,吸收光谱是一定的.根据它们的吸收光谱最大吸收峰max的位置或吸收峰形状和数量,可判断该物质的纯度.如果是某些生物大分子（如核酸和蛋白质）,可根据它们的紫外光区的特征吸收峰max（如核酸在260nm，蛋白质在280nm）处测得的吸收值，通过求出二者吸收值的比值来判断纯度。纯核酸吸收值的比值A280/A260=0.5纯蛋白质吸收值的比值A280/A260=1.8293.定量测定定量测定（1）比色测定）比色测定:大多数采用在可见光波区进行比色分析.在一定浓度范围内,溶液中溶质的含量与溶液颜色的深浅成正比,而溶液的颜色又与透过该溶液的单色光成反比,与溶液吸收该单色光的强弱成正比.根据朗伯-比尔定律,待测溶液在一定的浓度范围内吸收值的大小与浓度成正比.在生物大分子的定量分析中,大部分都是采用比色法.30比色溶液分为比色溶液分为:t有色溶液有色溶液:蛋白质与某些化学试剂反应生成有色溶液.t无色溶液无色溶液:由于生物大分子中含有某些特殊的生色基团.有色的溶液主要有有色的溶液主要有3类类:t本色溶液本色溶液:具生色基团或显色基团t显色溶液显色溶液:无显色基团,要与某些化学试剂(显色剂)反应,产生比较稳定的颜色,如双缩脲t染色溶液染色溶液:无显色基团,与某些染料(染色剂)染色后再进行比色,如考马斯亮蓝.31提问与解答环节Questions And Answers32谢谢聆听 学习就是为了达到一定目的而努力去干,是为一个目标去战胜各种困难的过程,这个过程会充满压力、痛苦和挫折Learning Is To Achieve A Certain Goal And Work Hard,Is A Process To Overcome Various Difficulties For A Goal33