第6章-细胞质功能区隔与蛋白质分选-课件[1]

INTRACELLULAR COMPARTMENT AND PROTEINS SORTING第六章细胞内功能区隔与蛋白质分选2020/10/281第一节 蛋白质分选的基本原理第二节 膜泡运输第三节 内质网第四节 高尔基体第五节 溶酶体与过氧化物酶体2020/10/282精品资料2020/10/283定义：结构、功能和发生上相关的内膜形成的细胞结构称为细胞内膜系统。功能：区隔化；增加表面积。系统发生上内膜起源于质膜的内陷和内共生。个体发生上内膜来源于原有内膜系统的分裂，具有epigenetic的特性。2020/10/284第一节 蛋白质分选的基本原理细胞内合成的蛋白质、脂类等物质之所以能够定向的转运到特定的细胞器取决于两个方面：其一是蛋白质中包含特殊的信号序列信号序列（signal sequence）。其二是细胞器上具特定的信号识识别别装装置置（分选受体，sorting receptor）。2020/10/285一、蛋白质分选信号信号序列（signal sequence）：引导蛋白质定向转移的线性序列，通常15-60个氨基酸残基，对所引导的蛋白质没有特异性要求。信号斑（signal patch）：存在于完成折叠的蛋白质中，构成信号斑的信号序列之间可以不相邻，折叠在一起构成蛋白质分选的信号。2020/10/286signal sequence and signal patch2020/10/287二、蛋白质分选运输机制1、门控运输（gated transport）：如通过核孔复合体的运输。2、跨膜运输（transmembrane transport）：蛋白质通过跨膜通道进入目的细胞器。3、膜泡运输（vesicular transport）：蛋白质在内质网或高尔基体中被包装成衣被小泡，选择性地运输到靶细胞器。2020/10/288第二节 胞内膜泡运输内膜系统之间的物质传递常通过膜泡运输进行。多数运输小泡在膜的特定区域以出芽的方式产生。表面具有一个笼子状的由蛋白质构成的衣被（coat）。衣被在运输小泡与靶细胞器的膜融合之前解体。2020/10/289衣被小泡在细胞内沿微管或微丝运输。与膜泡运输有关的马达蛋白有3类，在这些马达蛋白的牵引下，可将膜泡运到特定的区域。动力蛋白（dynein），趋向微管负端；驱动蛋白（kinesin），趋向微管正端；肌球蛋白（myosin），趋向微丝的正极。2020/10/2810一、衣被类型已知三类：1.笼形蛋白（clathrin）2.COPI3.COPII主要作用：1.选择性的将特定蛋白聚集在一起，形成运输小泡；2.如同模具一样决定运输小泡的外部特征。2020/10/2811三种衣被小泡的功能衣被类型 GTP酶组成与衔接蛋白运输方向clathrinARFClathrin重链与轻链，AP2质膜内体Clathrin重链与轻链，AP1高尔基体内体Clathrin重链与轻链，AP3高尔基体溶酶体，植物液泡COP IARFCOP高尔基体内质网COP IISar 1Sec23/Sec24复合体，Sec 13/31复合体，Sec 16内质网高尔基体2020/10/2812（一）笼形蛋白衣被小泡运输途径：质膜内体；高尔基体内体；高尔基体溶酶体、植物液泡。衣被结构：3重链、3轻链，形如triskelion。clathrin的曲臂交织在一起，形成5边形网孔的笼子。衔接蛋白：连接衣被与受体。2020/10/2813Clathrin coated vesicles2020/10/2814Deep-etch view of a typical clathrin lattice2020/10/2815Selective transport by clathrin coated vesicles2020/10/2816当衣被小泡形成时，可溶性蛋白dynamin聚集成一圈围绕在芽的柄部，使柄部的膜尽可能地拉近（小于1.5nm），导致膜融合，pinch off衣被小泡。2020/10/2817（二）COP I衣被小泡功能：回收、转运内质网逃逸蛋白（escaped proteins）返回内质网；也可介导高尔基体不同区域间的蛋白质运输。组成：由7种蛋白组成。回收信号：Lys-Asp-Glu-Leu（KDEL）。2020/10/2818COP I Vesicles2020/10/2819Cop I and II Vesicles2020/10/2820Lys-Asp-Glu-Leu（KDEL）2020/10/2821（三）COP衣被小泡介导内质网到高尔基体的物质运输。形成于内质网出口位点，该处无核糖体。主要亚基：Sar1GTP、Sec23/Sec24、Sec13/Sec31。多数跨膜蛋白直接与COP II结合，少数跨膜蛋白和多数可溶性蛋白通过受体与COP II结合。分选信号：位于跨膜蛋白胞质面，形式多样，常包含双酸性基序DEXDE，如Asp-X-Glu。2020/10/2822COP II Vesicles2020/10/2823COPII Coated vesicle2020/10/2824二、衣被形成衣被召集GTP酶：为G蛋白，活化状态可引起衣被蛋白聚集，包括ARF和SAR 1。存在于细胞质，激活后转位到膜上。ARF：参与clathrin和COP I衣被的形成。SAR 1：参与COP II衣被的形成。2020/10/2825ER上形成COPII小泡时，SAR1交换GDP/GTP而激活。激活的SAR1暴露出脂肪酸链尾巴，插入ER膜，促进衣被蛋白的核化和组装。SAR1可激活磷脂酶D，将一些磷脂水解，使衣被蛋白牢固地结合在膜上。当小泡从膜上释放后，衣被很快就解体。2020/10/2826Coat assembly2020/10/2827三、膜泡运输的定向机制（一）SNAREs 功能：介导运输小泡与靶膜的融合。类型：v-SNAREs和t-SNAREs。结构：具有一个螺旋结构域，相互缠绕形成跨SNAREs复合体，将小泡与靶膜拉在一起。2020/10/2828SNAREs2020/10/2829SNAREs in vesicle transport2020/10/2830神经细胞中，SNAREs负责突触小泡的停泊和融合。破伤风毒素和肉毒素能选择性地降解SNAREs，阻断神经传导。病毒融合蛋白的工作原理与SNAREs相似，介导病毒与宿主质膜的融合。2020/10/2831HIV fusion protein2020/10/2832（二）Rabs也叫targeting GTPase，属于G蛋白，起分子开关作用。已知30余种，不同膜上具有不同的Rabs。Rabs促进和调节运输小泡的停泊和融合。Rabs还有许多效应因子，帮助运输小泡聚集和靠近靶膜，触发SNAREs抑制因子。2020/10/2833Rabs in docking2020/10/2834四、受体介导的内吞批量内吞（Bulk-phase endocytosis）：非特异性的摄入细胞外物质，穴样内陷（caveolae）是发生批量内吞的部位。受体介导的内吞(receptor mediated endocytosis)是一种选择浓缩机制。LDL、运铁蛋白、生长因子、胰岛素等都通过RME转运。2020/10/2835衣被小窝（coated pits）是质膜内凹的部位，相当于分子过滤器(约占肝细胞表面积2%)。受体、笼形蛋白和衔接蛋白大量集中于此处。受体胞质端的Tyr-X-X-是衔接蛋白识别的信号，X为任何氨基酸，为分子较大的疏水氨基酸(如Phe、Leu、Met)。受体同配体结合后启动内化作用，衣被开始组装。2020/10/2836Clathrin coated piton the cytosolic face of a cell2020/10/2837低密脂蛋白的吸收：胆固醇主要在肝细胞中合成，以低密脂蛋白（low-density lipoproteins，LDL）释放到血液。LDL颗粒芯部含有被长链脂肪酸酯化的胆固醇分子。周围由磷脂和胆固醇构成的脂单层包围，有一个较大的Apo-B蛋白（配体）。2020/10/2838LDL Particle2020/10/2839LDL endocytosis2020/10/2840细胞需要胆固醇时，合成LDL跨膜受体蛋白。受体与LDL颗粒结合后，形成衣被小泡；进入细胞质的小泡随即脱掉衣被，成为平滑小泡，同早期内体融合，内体中PH值低，使受体与LDL颗粒分离；再经晚期内体将LDL送人溶酶体。在溶酶体中，LDL被水解成游离的胆固醇。2020/10/2841The receptor-mediated endocytosis of LDL2020/10/2842LDL Endocytosis2020/10/2843受体回收途径：大部分返回原来的质膜结构域，如LDL受体；有些进入溶酶体被消化，如EGF的受体，称为受体下行调节（receptor down-regulation）；有些被运至质膜不同的结构域，形成穿胞运输（transcytosis）。2020/10/2844Transcytosis2020/10/2845五、外排作用组成型外排途径：由TGN区分泌囊泡向质膜运输，通过default pathway完成转运。更新膜蛋白和膜脂、形成ECM、营养成分或信号分子。调节型外排途径：如激素或酶储于分泌泡内，当细胞在受到胞外信号刺激时，分泌泡释放出去。2020/10/2846The constitutive and regulated secretory pathways2020/10/2847第三节 内质网Porter等于1945年发现于培养的小鼠成纤维细胞，因最初看到的是位于细胞质内部的网状结构，故名endoplasmic reticulum，ER。2020/10/2848一、形态与组成约占细胞总膜面积的一半，是封闭的网络系统。分为RER和SER。RER呈扁平囊状，排列整齐，有核糖体附着。SER呈分支管状或小泡状，无核糖体附着。细胞不含纯粹的RER或SER，它们分别是ER连续结构的一部分。2020/10/2849RER2020/10/2850SER2020/10/2851膜含60%的蛋白和40%的脂类，PC含量较高，SM含量较少，没有或很少含胆固醇。约30多种膜结合蛋白，另有30多种位于ER网腔。葡糖-6-磷酸酶是ER标志酶，核糖体结合糖蛋白（ribophorin）只分布在RER，P450酶系只分布在SER。2020/10/2852二、ER的功能（一）蛋白质合成内质网上合成的蛋白主要有：1.向细胞外分泌的蛋白、如抗体、激素；2.膜的整合蛋白；3.需要与其它细胞组分严格分开的酶，如溶酶体的各种水解酶；4.需要进行修饰的蛋白，如糖蛋白。2020/10/2853Blobel等（1975）提出信号假说，认为蛋白质N端的信号肽，指导蛋白质转至内质网上合成，获1999年诺贝尔生理医学奖。Blobel with members of his laboratoryGnter Blobel2020/10/2854蛋白质转移到内质网合成涉及以下成分：1.信号肽：位于N端，约1630个氨基酸，含有6-15个连续排列的带正电荷的非极性氨基酸，又称开始转移序列。2.信号识别颗粒（SRP）：6种多肽和1个7S RNA组成，属RNP。与信号序列结合，导致Pr合成暂停。2020/10/2855AA Sequences of ER Signal Peptides2020/10/28563.SRP受体，ER膜的整合蛋白，异二聚体，可与SRP特异结合。4.停止转移序列，与内质网膜的亲合力很高，阻止肽链继续进入网腔，成为跨膜蛋白。5.转位因子，由3-4个Sec61蛋白构成的通道，每个Sec61由3条肽链组成。2020/10/2857Translocation of proteins across ER2020/10/2858蛋白质转入内质网合成的过程：信号肽与SRP结合肽链延伸终止SRP与受体结合SRP脱离肽链进入内质网信号肽切除肽链延伸至终止。这种肽链边合成边向内质网腔转移的方式，称为co-translation。2020/10/2859Insertion of Transmembrane protein into the ER membrane2020/10/2860（二）蛋白质的修饰与加工包括糖基化、羟基化、酰基化、二硫键形成等，几乎所有内质网上合成的蛋白最终都被糖基化。糖基化的作用：使蛋白质能够抵抗消化酶的作用；赋予蛋白质传导信号的功能；某些蛋白只有在糖基化之后才能正确折叠。2020/10/2861糖基一般连接在4种氨基酸上，分为2种：N-连接的糖基化：与天冬酰胺残基的NH2连接，糖为N-乙酰葡糖胺。O-连接的糖基化：与Ser、Thr和Hyp的OH连接，连接的糖为半乳糖或N-乙酰半乳糖胺，在高尔基体上进行。2020/10/2862内质网上进行N-连接的糖基化。糖的供体为核苷糖，如GDP-甘露糖、UDP-N-乙酰葡糖胺。糖分子首先被糖基转移酶转移到膜上的磷酸长醇分子上，装配成寡糖链。再被寡糖转移酶转到Asn-X-Ser或Asn-X-Thr的Asn上。2020/10/2863Protein glycosylation in RER2020/10/2864Protein glycosylation in RER2020/10/2865Protein glycosylation in RER2020/10/2866（三）新生肽链的折叠、组装和运输蛋白的折叠在hsp70家族的ATP酶的作用下完成。无法正确折叠的蛋白被转入溶酶体降解，约90%的新合成T细胞受体亚单位和Ach受体都被降解，而从未到达靶膜。COP II介导由ER输出的膜泡运输。2020/10/2867（四）内质网的其它作用1.合成磷脂、胆固醇等。2.解毒，如肝细胞的细胞色素P450酶系。3.参与甾体类激素的合成。4.使葡糖6-磷酸水解，释放糖至血液中。5.储存钙离子，作为胞内信号物质，如肌质网。6.提供酶附着的位点和机械支撑作用。2020/10/2868第四节 高尔基体发现于1855年，1889年，Golgi用银染法，在猫头鹰的神经细胞内观察到了清晰的结构，因此定名为高尔基体。2020/10/2869一、形态与组成由扁平囊泡堆积而成，有极性。通常48个(某些藻类较多)扁平囊在一起，构成Golgi stack。分布于ER与细胞膜间，呈弓形或半球形。凸出的一面对着ER称为顺面（cis face），凹进的一面对着质膜称为反面（trans face）。2020/10/2870Structure of the Golgi Complex2020/10/2871Distribution，nucleus green，Golgi body red2020/10/2872膜含有约60%的蛋白和40%的脂类，具有一些和ER共同的蛋白成分。主要的酶有糖基转移酶、磺基-糖基转移酶、氧化还原酶、磷酸酶、蛋白激酶、甘露糖苷酶、转移酶和磷脂酶等。标志酶为糖基转移酶。2020/10/2873二、功能区隔1.cis Golgi network，CGN是入口区域。2.medial Golgi，多数糖基修饰，糖脂的形成以及与高尔基体有关的糖合成发生于此处。3.trans Golgi network，TGN是出口区域，参与蛋白质的分类与包装，最后输出。2020/10/2874Golgi network2020/10/2875高尔基体不同区域的细胞化学反应：嗜锇反应：cis面膜囊被特异地染色；TPP酶：trans面的膜囊；NADP酶：显示中间的膜囊；CMP酶：trans面的囊状和管状结构。2020/10/2876三、主要功能1、参与细胞分泌活动：RER合成PrER腔COPII小泡CGNmedial Gdgi加工TGN区形成运输泡与质膜融合、排出。高尔基体依据信号序列或信号斑对蛋白质分类。2、O-连接的糖基化：糖的供体为核苷糖。2020/10/28773、进行膜的转化功能：ER合成膜脂转移至高尔基体，经过修饰和加工，形成运输泡与质膜融合。4、将蛋白水解为活性物质：如将胰岛素C端切除；或将神经肽前体降解为活性片段。5、参与形成溶酶体。6、植物细胞壁的形成，合成纤维素和果胶质。2020/10/2878第五节 溶酶体与过氧化物酶体Lysosome为de Duve与Novikoff 1955年发现。Peroxisome由Rhodin 1954在鼠肾小管上皮细胞中发现。2020/10/2879一、溶酶体的结构含酸性水解酶（最适pH=5），执行细胞内消化。具有异质性，酸性磷酸酶是标志酶。膜有质子泵，溶酶体内pH值低。膜蛋白高度糖基化。2020/10/28801、初级溶酶体（primary lysosome）由高尔基体分泌形成，含多种酸性水解酶。2020/10/28812、次级溶酶体（secondary lysosome）是正在进行或完成消化作用的溶酶体，分为自噬溶酶体和异噬溶酶体。3、残体（residual body）又称后溶酶体（post-lysosome），已失去酶活性，仅留未消化的残渣，故名。可排出细胞，也可能留在细胞内逐年增多，如表皮细胞的老年斑，肝细胞的脂褐质。2020/10/2882Secondary lysosome2020/10/2883肝细胞脂褐质肝细胞脂褐质2020/10/2884二、溶酶体的功能1.细胞内消化：如从LDL释放胆固醇，单细胞真核生物籍其消化食物。2.自体吞噬：清除无用生物大分子，衰老细胞、细胞器、个体发育中多余的细胞。3.防御作用：如巨噬细胞。4.参与分泌过程的调节：如将甲状腺球蛋白降解成有活性的甲状腺素。5.形成精子的顶体。2020/10/28852020/10/2886三、溶酶体的发生在高尔基体的trans面以出芽的方式形成：前溶酶体蛋白N-连接的糖基化高尔基体磷酸转移酶识别信号斑将N-乙酰葡糖胺磷酸转移在12个甘露糖残基上在中间膜囊切去N-乙酰葡糖胺形成M6P配体与trans膜囊上M6P受体结合通过clathrin衣被包装成运输小泡与晚期的内体融合，受体解离切除甘露糖残基上的磷酸。2020/10/2887The recognition of a lysosomal hydrolase in Golgi and mannose phosphorylation 2020/10/2888Transport of newly synthesized hydrolases to lysosomes2020/10/2889四、溶酶体与疾病1.矽肺：二氧化硅尘粒（矽尘）吸入肺泡后被巨噬细内吞噬，导致吞噬细胞溶酶体破裂。激活成纤维细胞，导致胶原纤维沉积，肺组织纤维化。2.肺结核：结核杆菌引起肺组织钙化和纤维化。3.类风湿性关节炎：溶酶体膜易脆裂。2020/10/28903各类贮积症台-萨氏综合症：缺少氨基已糖酯酶A。II型糖原累积病：缺乏-1,4-葡萄糖苷酶。Gaucher病：缺乏-葡萄糖苷酶。细胞内含物病：N-乙酰葡糖胺磷酸转移酶单基因突变。2020/10/2891台台-萨氏综合症溶酶体的同心圆结构萨氏综合症溶酶体的同心圆结构2020/10/2892五、过氧化物酶体Rhodin 1954发现于鼠肾小管上皮细胞。具有异质性，由单层膜围绕而成。特点：含过氧化氢酶（标志酶）和一至多种依赖黄素（flavin）的氧化酶，已发现40多种氧化酶。酶特点是将底物氧化后生成过氧化氢，而过氧化氢酶又利用H2O2去氧化其它底物。RH2+O2R+H2O22020/10/2893Peroxisome of hepatocyte2020/10/2894烟草叶肉细胞的过氧化物酶体（中央具有尿酸氧化酶形成的晶体状核心）2020/10/28951.在动物中：参与脂肪酸的-氧化；具有解毒作用，过氧化氢酶氧化有害物质，饮入的酒精1/4是在微体中氧化为乙醛。2.在植物中：参与光呼吸，将光合作用的副产物乙醇酸氧化为乙醛酸和过氧化氢，在萌发的种子中，进行脂肪的-氧化。2020/10/2896酶由核基因编码，在细胞质基质中合成，信号序列为-Ser-Lys-Leu-COO-。膜脂在内质网上合成，通过磷脂转移蛋白PTP转移而来。已有的过氧化物酶体在细胞分裂时，以分裂方式传给子代细胞。2020/10/2897