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第二节第二节 基因克隆操作基因克隆操作意义意义基因克隆常用工具基因克隆常用工具PCR基因文库构建基因文库构建基因的筛选与鉴定基因的筛选与鉴定一、基因分离的意义特有基因：生物进化，木本果树与草本植物不同，更复杂；目的不同，果树以生产果实为目的；多年生，控制更复杂，影响因素也更多。通过分离的基因，对生理现象遗传控制的分子机理进行研究，这是无法以拟南芥代替的。例如，果树童期分子机理的研究。互相促进，相辅相承。2.基因分离的工具就像在一堆稻草里寻就像在一堆稻草里寻找一根针一样，一段找一根针一样，一段特殊特殊DNA序列的分离序列的分离过程十分困难。一般过程十分困难。一般都需要在大肠杆菌扩都需要在大肠杆菌扩增与表达。增与表达。1973年年Cohen完成第一个基因操作实验完成第一个基因操作实验经经体外重组体外重组获得杂合获得杂合DNA杂合子转化入大肠杆菌杂合子转化入大肠杆菌所需元件：所需元件：限制性内切酶限制性内切酶 连接酶连接酶 载体载体 受体细胞受体细胞二、基因分离常用工具二、基因分离常用工具限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶连接酶连接酶聚合酶聚合酶载体载体受体细胞受体细胞限制性内切酶的特点限制性内切酶的特点1、有有特特定定的的识识别别序序列列，通通常常为为46个个碱碱基基的的回回文文对称序列。对称序列。2、切切割割位位点点位位于于识识别别序序列列内内的的固固定定位位置置上上，切切割割后在后在5末端有磷酸基团，末端有磷酸基团，3末端有羟基。末端有羟基。3、切切割割后后形形成成粘粘性性末末端端或或平平末末端端，前前者者又又分分为为3突出端（如突出端（如PstI）和）和5突出端突出端(如如EcoRI)两种两种4、其活性发挥只需、其活性发挥只需Mg2作辅酶。作辅酶。EcoR I:5-NG35AATTCN-33-NCTTAA53GN-5BamH I:5-NG35GATCCN-33-NCCTAG53GN-5EcoRV5-NGATATCN-33-NCTATAGN-55-NGAT35ATCN-33-NCTA53TAGN5-5-NGGATCCN-33-NCCTAGGN-55-NGAATTCN-33-NCTTAAGN-5连接酶连接酶体体外外催催化化磷磷酸酸二二酯酯键键的的形形成成可可使使用用两两种种酶酶：大大肠肠杆杆菌菌连连接接酶酶和和T4噬噬菌菌体体连连接接酶酶，但但几几乎乎在在所所有有的的克克隆隆中中T4噬噬菌菌体体连连接接酶酶都都是是首首选选的的酶酶，因因其其能能在在正正常常的的反反应应条条件件下下能有效的将平端连接起来。能有效的将平端连接起来。各种连接酶特性的比较：各种连接酶特性的比较：T4DNA Ligase E.coli DNA LigaseT4 RNA LigaseLigases of thermophilic bacteria最适最适pH辅酶辅酶7.2-7.8ATP7.5-8.0NAD7.2-8.4ATPNAD平滑末端平滑末端可能可能*不能不能NODNA 5P末末端端和和RNA 3OH末端末端可能可能可能可能不能不能NORNA 5P末末端端和和DNA3 OH末端末端可能可能不能不能不能不能NORNA和和RNA少数少数 可能可能不能不能可能可能NO聚合酶催化催化DNADNA的合成的合成E.coli DNAE.coli DNA聚合酶聚合酶I:I:聚合和外切活性聚合和外切活性 用来切口平移标记，末端标记用来切口平移标记，末端标记Klenow DNAKlenow DNA聚合酶：补平聚合酶：补平3 3凹端，抹平凹端，抹平3 3凸凸端，随机引物标记。端，随机引物标记。耐热耐热DNADNA聚合酶：聚合酶：TaqDNATaqDNA聚合酶，聚合酶，Vent DNAVent DNA聚聚合酶，合酶，pfuDNApfuDNA聚合酶。聚合酶。反转录酶：反转录酶：AMV,MMuLVAMV,MMuLVT4/T7T4/T7噬菌体噬菌体DNADNA聚合酶聚合酶载体必备条件：载体必备条件：1.含含有有复复制制子子，载载体体在在受受体体细细胞胞中中能能大大量量繁繁殖殖，其其携携带带的的外外源源基基因因才才能能在在受受体体细细胞胞中中得得到到大大量扩增；量扩增；2.有有1到到几几个个限限制制内内切切酶酶的的单单一一识识别别与与切切割割位位点，便于外源基因的插入；点，便于外源基因的插入；3.具具有有选选择择性性的的遗遗传传标标记记(如如抗抗生生素素抗抗性性标标记记等等)以以此此知知道道它它是是否否已已进进入入受受体体细细胞胞，并并据据此此标标记将受体细胞从其他细胞中分离出来。记将受体细胞从其他细胞中分离出来。克隆载体克隆载体载体类型A.质粒载体B.噬菌体载体C.粘粒载体D.BAC/YAC载体E.其他l质质粒粒是是染染色色体体之之外外的的一一种种稳稳定定的的遗遗传传因因子子，具具有自主复制和转录能力有自主复制和转录能力l是双链闭合环状是双链闭合环状DNA分子分子l大小在大小在120kb之间之间l它它可可独独立立游游离离于于细细胞胞质质中中，也也可可整整合合到到细细菌菌染染色体上。色体上。质粒的基本特点质粒的基本特点质粒pCAMBIA1301和和pCAMBIA1391的区别的区别？标记基因抗生素基因：四环素抗性基因Tetracycline氯霉素抗性基因Chloramphenical卡那霉素抗性Kanamycin新霉素抗性Neomycin氨苄青霉素Ampicillin其他质粒转录载体插插入入型型载载体体噬菌体载体：置换型载体噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 l l l l 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNAl l l l 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性：感染周期感染周期感染周期感染周期E.coliE.coli吸吸吸吸附附附附LamBLamB受体受体受体受体注入注入注入注入复制复制复制复制包包包包装装装装裂解裂解裂解裂解噬菌体载体主要用于构建基因文库，特别是cDNA文库主要步骤有载体纯化；载体与外源DNA的酶切；连接；重组噬菌体的体外包装；感染；筛选粘粒载体Cosmid质粒的衍生物，是带有cos序列的质粒，cos序列是噬菌体DNA中的一段序列。大小一般5-7kb,用来克隆35-45kb大小的片段BAC/YAC载体细菌人工染色体BacterialAritificialChromosome酵母人工染色体Yeast操作比较困难，主要用于大片段DNA；如基因组文库受体细胞受体细胞1 1、定义：外源、定义：外源DNADNA导入的细胞，是重组体扩导入的细胞，是重组体扩增的场所。增的场所。2 2、要求：易于接纳外源、要求：易于接纳外源DNADNA 无特异的内源性核酸内切酶无特异的内源性核酸内切酶 载体复制、扩增不受阻载体复制、扩增不受阻 与载体有互补性与载体有互补性3 3、细胞生长过程中有这样的时期。、细胞生长过程中有这样的时期。受体类型原核：大肠杆菌，枯草杆菌，链霉菌，蓝藻等真核：真菌：酵母、构巢曲霉；植物：原生质体、细胞、组织、器官动物：昆虫细胞、卵母细胞等分离基因用简单易于操作的受体；用于遗传信息的表达和功能研究则用真核生物受体细胞。DNA向宿主细胞的导入方法CaCl2法：感受态细胞与质粒DNA热击法42C电击法基因枪法病毒侵染其他三、聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction）简称PCR技术，是一种体外扩增特异DNA片段的技术。利用PCR技术可在短时间内获得数百万个特异的DNA序列的拷贝。PCR技术实际上实在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。PCR由变性由变性-退火退火-延伸三个基本反应步骤构成：延伸三个基本反应步骤构成：变性变性：模板DNA经加热至94左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；退火退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；延伸延伸：DNA模板-引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。标准的标准的PCR反应体系反应体系10扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10100pmol模板DNA0.12ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双蒸水至100ul四、基因文库四、基因文库基因文库(genelibrary)则是指某一生物类型全部基因的集合，这种集合以重组形式出现。某生物DNA片段群体（对于核DNA是以限制性酶切后的群体）与载体分子重组，重组后转化宿主细胞，转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌落（噬菌斑或成活细胞）是一个DNA片段的克隆，所有这些片段克隆的集合即是该生物体的基因文库。基因文库基因文库根据基因类型，基因文库可分为基因组文库和cDNA文库。基因组文库是指将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA片段克隆到某种载体上形成的文库。基因组文库根据DNA来源又有核基因组文库、叶绿体基因组文库及线粒体基因组文库。cDNA 文库文库cDNA文库是指将某生物某一发育时期所转录的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。cDNA文库是有时效性的，文库构建时的信息是某一时空条件下的细胞总mRNA，它是在转录水平上反映该植物在某一特定发育时期、某一特定组织或器官在某种环境条件下的基因表达情况，换一种环境或发育时期其表达状况可能就发生改变。再者，cDNA文库只反映加工成熟后mRNA的碱基序列结构。cDNA中不含有核基因中的间隔序列（内含子）及调控区。文库构建的基本过程目的基因的制备载体的选择和制备DNA分子的体外连接将外源DNA导入宿主细胞目的基因(targetDNA)的制备目的基因（外源基因）制备基因组DNA-基因文库(genomiclibrary)存在于转化细菌中、克隆载体携带的所有基因组DNA的集合制备cDNA-cDNA文库(cDNAlibrary)制备用于表达的基因片段：PCR技术、化学合成DNA的体外连接（DNA连接酶）粘性末端连接连接效率高相同酶切末端TAcloning平端连接连接效率低人工接头(linker)法同聚物接尾法将外源DNA导入宿主细胞大肠杆菌受体菌DH5a转化(transformation)制备感受态细胞冷的氯化钙处理，细胞处于最适摄取和容忍外来DNA的生理状态.感染(infection)转导(transduction)：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程五、目的基因的筛选和鉴定五、目的基因的筛选和鉴定(screening/selection)遗传学方法插入灭活法(insertioninactivation):抗药性标志选择标志补救表达产物与营养缺陷互补-互补蓝白斑筛选免疫学方法分子杂交探针原位杂交PCR限制性酶切图谱 互补互补(-complementation):许许多多常常用用载载体体（pUC系系列列）都都带带有有一一个个大大肠肠杆杆菌菌DNA的的短短片片段段，其其中中含含有有-半半乳乳糖糖苷苷酶酶（LacZ）的的调调控控序序列列和和头头146个个氨氨基基酸酸的的编编码码序序列列，该该编编码码区区中中插插入入了了一一个个多多克克隆隆位位点点，它它并并不不破破坏坏阅阅读读框框，不不影影响响功功能能。这这种种载载体体适适用用于于可可编编码码-半半乳乳糖糖苷苷酶酶C端端部部分分序序列列的的宿宿主主细胞。细胞。虽虽然然宿宿主主和和质质粒粒编编码码的的片片段段都都没没有有活活性性，但但它它们们可可以以融融为为一一体体，形形成成具具有有酶酶学学活活性性的的蛋蛋白白质质。这这样样，LacZ基基因因缺缺失失近近操操纵纵基基因因区区段段的的突突变变体体与与带带有有完完整整的的近近操操纵纵基基因因区区段段的的-半半乳乳糖糖苷苷酶酶阴阴性性的的突突变变体体之之间间实实现现互互补补，这种现象叫这种现象叫 互补。互补。x-gal(5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷)生色剂生色剂IPTG（异丙基硫代（异丙基硫代-半乳糖苷）：诱导剂半乳糖苷）：诱导剂由由 互补而产生的互补而产生的LacZLacZ细菌易于识别，因为它们细菌易于识别，因为它们在生色底物在生色底物x-gal(5-x-gal(5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚-D-D-半乳糖半乳糖苷苷)存在下，形成蓝色菌落，而外源片段插入到质存在下，形成蓝色菌落，而外源片段插入到质粒的多克隆位点以后几乎不可避免地导致产生无粒的多克隆位点以后几乎不可避免地导致产生无 互补能力的氨基端片段，因此，带重组质粒的细菌互补能力的氨基端片段，因此，带重组质粒的细菌形成白色菌落。形成白色菌落。IPTGIPTG（异丙基硫代（异丙基硫代-半乳糖苷）：是半乳糖苷）：是-半乳糖苷半乳糖苷酶活性的诱导物，也可作为具有酶活性的诱导物，也可作为具有LacLac或或TacTac启动子的启动子的表达载体的表达诱导物来使用。表达载体的表达诱导物来使用。IPTG;X-gal(5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷)蓝白斑筛选标记蓝白斑筛选常用于蓝白斑筛选常用于PCR产物克隆产物克隆T/ACloningAAT4 ligaseTransferred to E.coli+蓝白斑筛选蓝白斑筛选蓝色菌落：蓝色菌落：载体自连载体自连白色菌落：白色菌落：含外源片段含外源片段基因的鉴定长度鉴定：酶切、长度鉴定：酶切、PCR测序测序表达：表达：原核表达，真核表达原核表达，真核表达bp1534994695515377237A B C MPCR鉴定邹昌勇等2006酶切鉴定酶切鉴定测测 序序基因鉴定：基因鉴定：表达表达原核表达蛋白催化验证基因的离体活性或体内功能验证基因的离体活性或体内功能第三节、基因克隆策略一、常用的克隆策略图位克隆法标签法同源序列法功能克隆法mRNA差异比较利用EST数据库和更新的SAGE法基因芯片RNA-seq基因文库及目的基因分离图图位位克克隆隆(Map-based cloning)又又称称定定位位克克隆隆(positional cloning)，19861986年年，剑剑桥桥大大学学的的Alan Coulson提提出出，用用该该方方法法分分离离基基因因是是根根据据目目的的基基因因在在染染色体上的位置进行基因克隆的一种方法。色体上的位置进行基因克隆的一种方法。在在利利用用分分子子标标记记技技术术对对目目的的基基因因进进行行精精确确定定位位的的基基础础上上，使使用用与与目目的的基基因因紧紧密密连连锁锁的的分分子子标标记记筛筛选选DNADNA文文库库，从从而而构构建建目目的的基基因因区区域域的的物物理理图图谱谱，再再利利用用此此物物理理图图谱谱通通过过染染色色体体步步行行逼逼近近目目的的基基因因或或通通过过染染色色体体登登陆陆的的方方法法最最终终找找到到包包含含该该目目的的基基因因的的克克隆隆，最最后后通通过过遗遗传传转转化化和和功功能能互互补补验证最终确定目的基因的碱基序列。验证最终确定目的基因的碱基序列。图位克隆方法分离基因的优点是无需预先知道基因的图位克隆方法分离基因的优点是无需预先知道基因的DNADNA顺序，也无需顺序，也无需预先知道其表达产物的有关信息。预先知道其表达产物的有关信息。1.1.图位克隆图位克隆（Map-based cloning）法法（未知序列的基因克隆）（未知序列的基因克隆）09 90年代初发展起来的基因克隆技术。很多分离克隆的基年代初发展起来的基因克隆技术。很多分离克隆的基因都是通过这种方法获得的。因都是通过这种方法获得的。图位克隆法是基于基因在遗传图谱上的位置而分离克图位克隆法是基于基因在遗传图谱上的位置而分离克隆基因的方法。隆基因的方法。图位克隆法包括以下步骤：图位克隆法包括以下步骤：(a)Target gene mapping:a high resolution genetic map with average distance is less than 5 cM.(b)Physical mapping:a map of the locations of identifiable landmarks on DNA,regardless of inheritance.Distance is measured in base pairs other than genetic recombination(in cM).图位克隆法步骤图位克隆法步骤 v主要技术环节遗传作图近等基因系BSA筛选连锁的分子标记目的基因的精细定位和作图目的基因分离目的基因鉴定图位克隆法步骤图位克隆法步骤 Genetic map in this case,the maps of potato and tomato are aligned,and the markers align perfectly except for a few inversions(indicated by arrows)遗传作图GeneticMapl物理图谱基因所在DNA区域的物理特征l限制性酶切图谱l跨叠克隆群(contig)图谱菌落杂交PCR筛选Fiber-FISHlDNA序列图谱物理图谱（physicalmap)近等基因系（近等基因系（neariso-geniclines,NILs）除了目标基因所在座位的局部区域外，基因组DNA序列的其余部分都是相同的。BSA(Bulkedsegregantanalysis)将分离群体中研究的目标性状根据其类型(如抗病、感病)分成两组，将每组内一定数量的植株DNA等量混合，形成两个池，这两个池除在目标性状(抗病性)上有差异外，其余遗传背景均相同。利用分子标记技术寻找两个池的扩增谱带的差异，这种多态性极可能与目标基因连锁。v染色体步移法在鉴定出紧密连锁的分子标记所在的大片段克隆以后，以此为起点进行染色体步移，逐渐靠近目标基因。可能中断或遇重复序列转向。v染色体登陆找出与目标基因的物理距离小于基因组文库插入片段的平均距离的分子标记，筛选文库直接获得含有目标文库的克隆。目的基因分离构建作图群体（构建作图群体（F2、BC1F1、RIL、DH或或NIL）分子标记作区段高分子标记作区段高密度遗传连锁图密度遗传连锁图Chr基因基因X Xigfhedcba1.8cM3.5cM0.5cM1.2cM0.8cM以距基因最近的两侧分子标记筛选文库（以距基因最近的两侧分子标记筛选文库（BAC,PAC or YAC 文库）文库），分离片段末端进行染色体步查（，分离片段末端进行染色体步查（chromosome walking)walkinglandinggef1.8cM0.5cMX gene图位克隆示意图图位克隆示意图 文库片段测序文库片段测序Genscan和和Blast，候选基因确定，候选基因确定转基因功能验证转基因功能验证图位克隆示意图图位克隆示意图Du et al.Proceed.Natl.Acad.Sci.USA 2009,106:22163-22168Map-based cloning of Bph14,a resistant gene to rice brown planthopper哪些园艺植物适合做图位克隆？你认为图位克隆最快捷的方法是什么？需要注意哪些问题？2.标签法标签法转座子或转座子或T-DNA标签构建成质粒载体标签构建成质粒载体；载体导入目标植物筛选群体表型突变扩增标签边上的基因T-DNAT-DNA插入引起的后果插入引起的后果（Krysan et al.1999）利用利用T-DNAT-DNA突变体分离克隆基因突变体分离克隆基因侧翼序列（侧翼序列（Flanked-sequence tag,FSTFlanked-sequence tag,FST）的分离方法的分离方法 热不对称交错热不对称交错PCRPCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCRThermal Asymmetric Interlaced PCR，TAIL-PCRTAIL-PCR）反向反向PCRPCR（Inverse PCRInverse PCR，IPCRIPCR）质粒拯救（质粒拯救（Plasmid rescuePlasmid rescue）接头接头PCR PCR（Adaptor PCRAdaptor PCR）TAIL-PCRAD primerAD primer：任意简并引物：任意简并引物 （Arbitrary Degenerate PrimerArbitrary Degenerate Primer）反向反向PCRPCR质粒拯救质粒拯救接头接头PCRPCRv基因同源性分析保守序列简并引物vPCR获得基因片段或是RT-PCR获得cDNA片段vRACE法获取全长vcDNA片段做探针，从cDNA文库钓取全长3.同源序列法PCR巢式巢式PCR多重多重PCR反向反向PCRTouchdown PCR4.mRNA差异比较为基础的分离法差异比较为基础的分离法vMutantandwild-type表型差异：不同基因型目标基因在细胞总DNA中所占比例很小。mRNA仅代表那些在基因组中能够表达的基因顺序。v同一材料不同时空背景、不同环境响应下mRNA表达可能不同4.mRNA差异比较为基础的分离法差异比较为基础的分离法v差异显示(mRNAdifferentialdisplay)DDRT-PCR(differencedisplayRT-PCR)v差减杂交SubtractiveHybridizationv代表性差异分析（RepresentationalDifferenceAnalysis，RDA）v抑制性差减杂交（SuppressionSubtractiveHybridization，SSHv竞争性杂交（CompetitiveHybridization）ReverseTranscriptionPCRAmplificationDenaturingPolyacrylamideGelCAAAAAAAAAAAA-AnTAAAAAAAAAAAA-AnGAAAAAAAAAAAA-An5-AAGCTTTTTTTTTTTG-3(H-T11G)dNTPsMMLVreversetranscriptaseCAAAAAAAAAAA-AnGTTTTTTTTTTTCGAA5-GCTTGATGCC-3(H-AP-1Primer)5-CTTTTTTTTTTTG-3(H-T11G)dNTPsa-33P-dATPTaqDANpolymeraseGCTTGATGCCGTTTTTTTTTTTCGAAXYDifferential Display3端有端有12种组合锚定引种组合锚定引物物10核苷酸引导第核苷酸引导第2链合成链合成两引物扩增产物差异两引物扩增产物差异Subtractive HybridizationSamples of InterestmRNA ExtractionReverse transcriptionHybridizationcDNARNAcDNAcDNARNARNA生物素标记生物素标记；cDNA与与RNA复合体复合体抑制消减杂交抑制消减杂交Suppression Subtractive Hybridization(SSH)2次PCR1st接头外侧（5）作引物；2nd：接头内侧（3）作引物应用的几个关键点：应用的几个关键点：tester与与driver配对密切，最好双方是同源细胞株，这样双方配对密切，最好双方是同源细胞株，这样双方才具有高度可比性，筛选出的差异表达基因才可能与表型关系才具有高度可比性，筛选出的差异表达基因才可能与表型关系密切从而减少工作量，减少下一步工作的肓目性。密切从而减少工作量，减少下一步工作的肓目性。在选用限制酶时应尽量选用对于基因组在选用限制酶时应尽量选用对于基因组DNA中酶切位点较少中酶切位点较少的限制酶，使酶切后产生的片段尽量大的限制酶，使酶切后产生的片段尽量大些。例如使用些。例如使用Rsa I可可产生产生600 bp左右的片段，这样既可防止过长的左右的片段，这样既可防止过长的cDNA片段影响杂片段影响杂交效率，也可提高每个基因的代表性。交效率，也可提高每个基因的代表性。接头的设计上。接头要含有酶切仿点以连于平端接头的设计上。接头要含有酶切仿点以连于平端cDNA上，重上，重要的是要在其末端含有一段反向重复序列，这使得在要的是要在其末端含有一段反向重复序列，这使得在PCR反应反应中能选择性扩增目的中能选择性扩增目的cDNA片段，同时抑制非目的片段，同时抑制非目的cDNA片段的片段的扩增，即抑制扩增，即抑制PCR技术。技术。优点：优点：特异性强特异性强 假阳性率低假阳性率低 高敏感性，检出低丰度高敏感性，检出低丰度mRNA 速度快，效率高速度快，效率高缺点缺点 mRNA用量高用量高 得到的是得到的是cDNA片段片段 研究材料之间不能差异太大研究材料之间不能差异太大5、利用EST数据库发现新基因EST(expressedsequencetags),是从基因表达的短的序列，携带着完整基因某些片断的信息，称为表达序列标签获得一个EST的途径有三种：1大规模测序；2比较同源性；3差异显示或基因芯片法获得与某一性状相关的EST电脑克隆第一步，找到与待克隆基因相关的EST；第二步计算机拼接、比较；第三步检测潜在的可读框ORF确定是否为全长6.SAGEExpressionLevelExpressionLevelGeneProductsGeneProductsQuantify Tags and DeterminePatterns of Gene ExpressionLink tags together and sequenceIsolate SAGE tagsAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAASampleASampleBSerialanalysisofgeneexpressionSAGE7.7.基因芯片（基因芯片（gene chipgene chip）技术）技术生物芯片（生物芯片（BiochipBiochip）:是指通过机器人是指通过机器人自动印迹或引导光化学合成自动印迹或引导光化学合成技技术在术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物制造的生物分子微列阵分子微列阵，根据分子间的特异，根据分子间的特异性相互作用的原理，将生命科学领域中性相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于芯片表面不连续的分析过程集成于芯片表面，以，以实现对细胞、蛋白、基因及其他生物组份的准确、快速、大信息量的检测。实现对细胞、蛋白、基因及其他生物组份的准确、快速、大信息量的检测。基因芯片（基因芯片（Gene chip,DNA chip,or DNA microarryGene chip,DNA chip,or DNA microarry）：）：生物芯片的一种。它是将生物芯片的一种。它是将DNADNA分子固定于支持物上，并与标记的样品杂交，通分子固定于支持物上，并与标记的样品杂交，通过自动化仪器检测杂交信号的强度来判断样品中靶分子的数量，进而得知样品过自动化仪器检测杂交信号的强度来判断样品中靶分子的数量，进而得知样品中中mRNAmRNA的表达量，也可进行基因突变体的检测和基因序列的测定，为进一步了的表达量，也可进行基因突变体的检测和基因序列的测定，为进一步了解基因间的相互关系及基因克隆提供有用的工具解基因间的相互关系及基因克隆提供有用的工具基本概念基本概念GeneChipGeneChip将将探探针针固固定定在在特特定定的的固固体体基基质质上上，而而原原来来印印记记在在膜膜上上的的目目标标DNADNA或或RNARNA进行标记，然后进行的大规模的杂交。进行标记，然后进行的大规模的杂交。Affymetrix的原位合成技术可制作的点阵密度高达1061010/cm2。Cy3和和Cy5Cy3Cy3激发波长激发波长532nm532nmCy5Cy5激发波长激发波长635nm635nm表达谱芯片实验流程表达谱芯片实验流程1.Samples2.mRNA Extraction and Reverse Transcription3.Fluorescent Labeling of cDNAs4.Hybridization to a DNA Microarray5.Scanning the Hybridized Array6.Interpreting the Scanned ImageLiu et al.,JXB,20098.RNA-seq技术Xuetal.,BMCGenomics,20099.酵母双杂交技术酵母双杂交技术(Yeast Two-hybrid System)1 1、酵母双元杂交系统的应用、酵母双元杂交系统的应用 验证传统方法检测的相互作用的蛋白验证传统方法检测的相互作用的蛋白 蛋白的功能作图蛋白的功能作图 功能域功能域 /氨基酸氨基酸 鉴别新的相互作用蛋白鉴别新的相互作用蛋白 (from a cDNA(from a cDNA library)library)Gal4 protein comprises DNA binding domains(BD)and activating domains(AD)Binding domain interact with promoter Activating domain with transcription machineryGal4双元系统双元系统原理原理背景知识背景知识酵母双杂交技术原理示意图酵母双杂交技术原理示意图Yeasttwo-hybridsystem实例Wu et al.Cell.2006,125:1347-1360BiFC：双分子荧光双分子荧光互补互补bimolecular fluorescence complementation20022002年年，HuHu等等报报道道的的一一种种直直观观、快快速速地地判判断断目目标标蛋蛋白白在在活活细细胞胞中中的的定定位位和相互作用的新技术和相互作用的新技术BiFCBiFC技技术术原原理理将将荧荧光光蛋蛋白白在在某某些些特特定定的的位位点点切切开开，形形成成不不发发荧荧光光的的N N和和C C端端2 2个多肽，称为个多肽，称为N N片段片段(N-fragment)(N-fragment)和和C C片段片段(C-fragment)(C-fragment)。当当这这2 2个个荧荧光光蛋蛋白白的的片片段段分分别别连连接接到到1 1组组有有相相互互作作用用的的目目标标蛋蛋白白上上，在在细细胞胞内内共共表表达达或或体体外外混混合合这这2 2个个融融合合蛋蛋白白时时，由由于于目目标标蛋蛋白白质质的的相相互互作作用用，荧荧光光蛋蛋白白的的2 2个个片片段段在在空空间间上上互互相相靠靠近近互互补补，重重新新组组装装成成完完整整的发光蛋白。的发光蛋白。Yuan et al.Plant Cell 2010,22:3164-3176HIS3：筛选标记酵母单杂交技术酵母单杂交技术Li等（1993）从酵母双杂交技术发展而来，研究DNA和蛋白质互作。ChIP:Chromatin immuno precipitation主要实验流程：在活细胞状态下固定蛋白质DNADNA复合物，并通过超声或酶处理将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过抗原抗体的特异性识别反应沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNADNA片段，通过对目的片段的纯化与检测，获得蛋白质与DNADNA相互作用的信息。染色质免疫共沉淀染色质免疫共沉淀思考题什么是基因工程？对社会和科学技术发展有什么重要意义？限制性内切酶有哪几类？什么是回文结构？常见载体？报告基因？蓝白斑筛选？基因克隆的常用策略及原理？果树上使用的有哪些方法？什么是细菌感受态？转化？转染？酵母双杂交？主要参考资料l基因VIIIl基因操作原理孙明华中农业大学l植物基因工程王关林方宏均科学出版社2002lMolecularCloning分子克隆实验指南（E3,2001）lPrinciplesofGeneManipulation(SPrimrose,RTwyman,Blackwellscientificpublication)
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